Den eVOLVER ramverk möjliggör hög genom strömning kontinuerlig mikrobiell kultur med hög upplösning och dynamisk kontroll över experimentella parametrar. Detta protokoll visar hur man kan tillämpa systemet för att genomföra en komplicerad Fitness experiment, vägleda användare på programmering automatiserad kontroll över många enskilda kulturer, mäta, samla in och interagera med experimentella data i real tid.
Kontinuerliga odlings metoder gör det möjligt att odla celler under kvantitativt kontrollerade miljö förhållanden och är därför i stort sett användbara för att mäta konditionen fenotyper och förbättra förståelsen av hur genotyper formas genom urval. Omfattande senaste insatserna för att utveckla och tillämpa nisch kontinuerlig kultur enheter har avslöjat fördelarna med att genomföra nya former av cell kultur kontroll. Detta inkluderar att definiera anpassade urvals tryck och öka genom strömningen för studier som sträcker sig från långsiktig experimentell evolution till genomtäckande biblioteks val och syntetiska genkretsinkaraktärisering. EVOLVER-plattformen har nyligen utvecklats för att möta denna växande efter frågan: en kontinuerlig kultur plattform med en hög grad av skalbarhet, flexibilitet och automatisering. eVOLVER ger en enda standardisering plattform som kan (Re)-konfigurerad och skalas med minimal ansträngning för att utföra många olika typer av hög genom strömning eller flerdimensionella tillväxt urvals experiment. Här presenteras ett protokoll för att ge användare av eVOLVER ram en beskrivning för att konfigurera systemet att genomföra en anpassad, storskalig kontinuerlig tillväxt experiment. Specifikt, protokollet vägleder användare om hur man programmerar systemet till multiplex två val tryck-temperatur och osmolaritet-över många eVOLVER flaskor för att kvantifiera Fitness landskap av Saccharomyces cerevisiae mutanter på fina Upplösning. Vi visar hur enheten kan konfigureras både programmatiskt, genom sin öppen källkod webbaserade program vara, och fysiskt, genom att arrangera fluidic och hårdvarulayouter. Processen för att fysiskt ställa in enheten, programmering av kulturen rutin, övervakning och interagera med experimentet i real tid över Internet, provtagning flaskor för efterföljande offline analys, och efter experiment data analys är detaljerade. Detta bör fungera som en utgångs punkt för forskare inom olika discipliner att tillämpa eVOLVER i utformningen av sina egna komplexa och hög genom strömning cell tillväxt experiment för att studera och manipulera biologiska system.
Kontinuerlig cell odlings teknik, utvecklades först nästan 70 år sedan1,2, njuter av en nyligen väckelse3,4. Detta beror på en sammanflödet av faktorer. För det första har utvecklingen av teknik med hög genom strömning-omik, som har gjort det möjligt att läsa upp och generera ett stort antal genotyper5,6, skapat en samtidig efter frågan på experimentella tekniker som underlättar välkontrollerad cell tillväxt och fenotypning. För detta ändamål är kontinuerlig kultur en kraftfull experimentell metod för att kapitalisera på framväxande genomiska framsteg. Genom att under lätta tillväxt val/experiment på cell populationer i noggrant kontrollerade (och dynamiska) miljö förhållanden, ger kontinuerlig kultur ett sätt att rigoröst kartlägga genotyper till fenotyper7,8, kvantitativt karakterisera konstruerade stammar och organismer9, och spåra adaptiva genetiska förändringar i laboratoriet evolution studier10,11,12.
För det andra, den senaste tidens framväxten av tillgängliga prototyper tekniker, såsom additiv tillverkning och öppen källkod hård vara och program vara element, har möjliggjort en bredare uppsättning användare att utforma och bygga sina egna kostnads effektiva former av kontinuerliga kultur system direkt i laboratoriet. Allt detta har lett till ett spännande utbud av gör-det-själv (DIY) enheter som utför kontinuerlig kultur funktioner, såsom chemostat13, turbidostat14, eller morbidostat15. Tyvärr, men framgångs rika i att ta itu med specifika (nisch) problem som de utformades, dessa ad hoc-lösningar saknar i allmänhet förmågan att skala i genomflöde och/eller experimentell design komplexitet.
Den evolver systemet utformades med målet att skapa en enda plattform som kan tillgodose de växande experimentella behoven av kontinuerlig kultur och matcha hastigheten och skalan av framväxande genomisk tekniker16 (figur 1a). eVOLVER ‘ s design implementerar vanliga grundämnen som ligger bakom mycket skalbara teknologier från andra discipliner17, inklusive standardiserade fot avtryck, modulära komponenter och design principer med öppen källkod. Således kan lösningar för nya nisch applikationer utformas utan större modifieringar av systemet. Består av mycket modulära och öppen källkod wetware, hård vara, elektronik och webbaserad program vara, eVOLVER är den första automatiserade kontinuerliga kultur system som kan vara kostnads effektivt och lätt omkonfigurerad för att utföra praktiskt taget alla typer av tillväxt experiment med hög genom strömning. Genom modulära och programmerbara smart ärm som hus alla sensorer och ställdon som behövs för att styra enskilda kulturer, eVOLVER unikt möjliggör skalning av både genom strömning och individuell kontroll av kultur förhållanden. Dessutom, som en webbaserad plattform, utbyter eVOLVER data och information med fjärrdatorer i real tid, vilket tillåter samtidig övervakning av hundratals enskilda kulturer och automatiserade kultur störningar genom godtyckligt definierad kontroll Algoritmer.
I tidigare arbete16, evolver robusta prestanda visades i långsiktiga experiment under hundratals timmars drift, och dess förmåga att odla olika organismer, från E. coli och s. cerevisiae till odomesticerade Mikrober. En rad olika experiment för tillväxt urval utfördes, där program mässigt definierade flerdimensionella vals gradienter tillämpades på en rad olika kultur förhållanden och det resulterande cellulära Fitness landskap var Kvantifierade. Här, målet är att ge eVOLVER användare med en beskrivning av hur man använder systemet för att utforma och dessa typer av experiment. Som ett belysande exempel, metoder kvantifiera Fitness landskapet i S. cerevisiae mutanter över en tvådimensionell miljö gradient består av temperatur och osmotisk stress presenteras. Protokollet vägleder användare genom att konfigurera evolver ramverket för detta experiment både program mässigt, i att använda program varan för att ställa anpassade grumlighet och temperatur kontroll rutiner för var och en av 16 parallella kontinuerliga kulturer, och fysiskt, genom flödes teknik layout för att på lämpligt sätt dirigera medier med olika saltkoncentrationer. Detta protokoll bör fungera som ett allmänt kriterium för att konfigurera eVOLVER att utföra en mängd olika automatiserade kontinuerliga kultur experiment för olika studier och discipliner.
Tillväxt val är ett oumbärligt verktyg i biologi, används i stor utsträckning för att generera och karakterisera fenotypisk skillnader mellan cellulära populationer. Medan parti kulturer tillåter tillväxt urval på ett begränsat sätt, kontinuerlig kultur tekniker dramatiskt utöka graden av kontroll och förutsägbarhet av dessa experiment, genom att utöva exakt reglering över formen och dynamiken i urvalet för att generera repeterbara, kvantitativa resultat22. Kontinuerlig kultur har använts för att rigoröst kontrol lera urvalet för bibliotek med hög mångfald20,23,24,25och för att implementera sofistikerade adaptiva regimer i experimentella och riktad evolution11,12,26,27. Kontinuerlig kultur möjliggör också exakt karakterisering av celler över en mängd kvantifierbara kontrollerade betingelser för att bättre förstå komplexa genetiska system och optimera konstruerade bio produktions stammar9,14 , och 28.
Det finns dock inget universellt protokoll för kontinuerlig kultur, eftersom subtila förändringar av de selektiva förhållandena kan leda till dramatiska förändringar i biologiska utfall4,29,30. Experimenterarna måste kunna välja mellan urvals system och anpassa experimentella protokoll och utrustning därefter. Förutom att erbjuda ett val mellan kontroll parametrar, skulle sådana system helst vara sofistikerade nog att självständigt hantera flera parametrar samtidigt i mycket parallella experiment som behövs för att tolka interagerande indata i komplexa biologiska system (t. ex. epistas). eVOLVER löser denna utmaning genom att möjliggöra för användare att godtyckligt program mera återkoppling mellan odlings förhållanden och fluidiska funktioner för att specificera högt specialiserade miljö nischer.
För att övervinna begränsningarna i den aktuella installationen och för att expandera eller ändra styr parametrarna kan smart Sleeve enkelt omformas för att lägga till nya sensorer eller ställdon. Dessutom skulle minska Flask volymen minska Media utgifter, vilket kan vara betydande i kontinuerlig kultur. Medan den nuvarande konstruktionen tillåter mätning och kontroll av temperatur, kultur agitation, ljus induktion, grumlighet och fluidik, måste andra parametrar mätas externt genom provtagning från injektions flaskorna. Nuvarande arbete innefattar att införliva förmågan att övervaka enzymatisk aktivitet via luciferas och reglera upplöst syre och pH direkt i evolver kulturer. Dessutom, även om det inte visas i detta arbete, eVOLVER kan samverka med nya millifluidic multiplexing enheter16 som drar på principerna om storskalig integration (som härrör från elektronik och antas av mikrofluidik) för att Billigt att möjliggöra mer komplex fluidic hantering (t. ex. Multiplexed fluidic ingångar, injektions flaska-till-flaska överföringar). Dessa wetware moduler kan utformas och tillverkas helt i labbet, så att användarna kan dirigera vätskor genom att program mässigt aktivera olika kombinationer av ventiler i automatiserade fluidic rutiner. Detta gör det möjligt för användare att övervinna de stela fluidic mönster traditionellt används i kontinuerlig kultur, men också att skala fluidic kapacitet till hög genom strömning med ett mindre antal kostsamma kontroll element (t. ex. Peristaltiska pumpar). Slutligen, vi hoppas att införliva en autosampling plattform som kommer att använda dessa millifluidik och DIY komponenter, övervinna begränsningen av manuell interaktion under längre och större experiment där provtagning kulturer skulle vara besvärligt.
Förutom fysiska modifieringar av plattformen öppnar den webbaserade program varan nya frihets grader genom att tillåta användare att skriva, redigera och dela anpassade eVOLVER-skript, generera helt automatiserade, feedbackaktiverade kultur program (t. ex. turbidostat). Användare kan program mässigt svepa över parameter intervall i subtila variationer på samma urvals schema eller ansluta kontrollalgoritmer i nya kombinationer för att ange valfritt antal sofistikerade urvals scheman. Dessutom förändrar förmågan att enkelt övervaka kulturer i real tid det sätt på vilket experiment utförs. Med övervakning i real tid kan användare 1) kontrol lera konsekvens mellan körningar, en kritisk funktion för bioproduktionsprogram och experiment med hög genom strömning och 2) ingripa vid behov vid experiment för att felsöka utmanande stammar som uppvisar eller Biofilm bildning, eller diagnostisera användar fel (t. ex. kontaminering). Slutligen, med flera data strömmar som samlas in och tolkas i real tid för varje enskild kultur, genererar eVOLVER en hög täthet av data, vilket kan under lätta maskin inlärning metoder för nya nedströms analys.
Bortom visat användnings områden för fitness karakterisering, bibliotek urval, och laboratorie utveckling, vi ser ett antal relaterade områden som mogna för genomförande i eVOLVER med integrerade fluidik. evolver experiment med mikrobiome prover kan assay gemenskap stabilitet i kontrollerade miljöer31,32, utforska bakterieflora sammansättning med hjälp av culturomics tekniker33, eller dynamiskt blanda arter till förhöra ekologisk dynamik av kolonisering eller invasion34,35. Många metoder för kontinuerlig riktad utveckling av bio molekyler kan enkelt implementeras på enheten samt26,36,37, kraftigt öka tillgängligheten och genom strömningen av dessa system. Förmågan att optimera odlings förhållanden såsom Media sammansättning, temperatur och stammar i en dynamisk, hög genom strömning natur kan hjälpa i optimering ansträngningar för industriella biomanufacturing applikationer9. Vi ytterligare föreställa vertikalt integrera eVOLVER med andra analys tekniker såsom Mikroskopi och flödescytometri i en sluten slinga mode, vilket ger ett helt automatiserat system för tillväxt och analys av cellulära kulturer på både enstaka cell och population Nivåer. Dessutom, med vissa hård vara modifieringar till smart Sleeve såsom tätning av fartyget och kontrol lera gas innehåll, eVOLVER skulle kunna anpassas för att stödja tillväxten av ett bredare spektrum av cell typer, såsom SUS pension däggdjurs celler. Det är också möjligt att placera hela ramen i en anaerob kammare för anaerob cell kultur. Ser fram emot, strävar vi efter att bygga vår program vara ram till en centraliserad moln infrastruktur och tror att detta skulle tillåta användare att enkelt konfigurera, analysera och dela sina data på distans utan att behöva fysiskt vara närvarande i labbet. Moln infrastrukturen fungerar som datainkurator och lämpar sig också för storskaliga metaanalyser i experiment. Vi räknar med att eVOLVER och dessa framtida framsteg kommer att kraftigt utvidga räckvidden för möjliga tillväxt urvals experiment genom att under lätta automatisering och innovation i kontinuerlig kultur.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar B. Stafford för hans hjälp i utformningen av systemet, och H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, och A. Cavale för hjälp med byggandet av systemet. Vi erkänner Electronics design Facility (EDF), Engineering Product innovation Center (EPIC), och program varan & Application Innovation Lab (SAIL) vid Hariri Institute for Computing vid Boston University för deras tjänster. Detta arbete stöddes av en NSF karriär Award (MCB-1350949 till Ask), och DARPA beviljar HR0011-15-C-0091 och HR0011-18-2-0014 (till Ask). Ask också erkänner finansiering från NIH Director ‘ s nya innovatör Award (1DP2AI131083-01), DARPA Young fakulteten Award (D16AP00142), och NSF expeditioner i Computing (CCF-1522074).
5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
eVOLVER Unit | FynchBio | ||
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
Pipettes | Eppendorf | ||
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |