该方法将iPSC衍生内皮细胞的培养描述为标准化微流体平台中的40个注入3D微容器。该平台支持在3D中研究梯度驱动的血管生成,包括以可扩展的高通量方式血管生成芽的血管生成和稳定。
血管疾病的临床前药物研究需要血管体外模型,可以修改为高通量筛查。然而,目前具有足够通量的体外筛选模型只有有限的生理相关性,这阻碍了从体外到体内的发现翻译。另一方面,微流体细胞培养平台在体外表现出无与伦比的生理相关性,但往往缺乏所需的吞吐量、可扩展性和标准化。我们展示了一个强大的平台,用于研究从人类诱导多能干细胞(iPSC-ECs)中提取的内皮细胞在生理相关细胞微环境中的血管生成,包括灌注和梯度。iPSC-EC 被培养为 40 个注入 3D 微容器,用于对图案胶原蛋白-1 支架。在应用血管生成因子梯度后,可以研究血管生成的重要特征,包括分化为尖端和茎细胞以及可渗透流明的形成。用荧光示踪染料灌注,有助于研究血管生成芽的抗氧化期间和之后的渗透性。总之,该方法显示了iPSC衍生的EC在标准化和可扩展的3D血管生成测定中的可行性,该检测将生理相关培养条件结合在具有集成于其中所需的鲁棒性和可扩展性的平台上药物筛查基础设施。
体外模型在血管疾病新药靶点的发现和验证中起着至关重要的作用。然而,目前具有足够通量的体外筛选模型只有有限的生理相关性1,这阻碍了从体外到体内的发现翻译。因此,为了推进临床前血管药物研究,必须改进血管体外模型,将高通量筛查与生理相关的3D细胞微环境相结合。
在过去十年中,在提高血管体外模型的生理相关性方面取得了重大进展。内皮细胞可以嵌入3D支架,如纤维蛋白和胶原胶2,而不是培养在平坦表面(如组织培养塑料)上的内皮细胞。在这些基质中,内皮细胞表现出与基质降解和流明形成相关的更生理相关的表型。然而,这些模型只演示了血管生成过程中发生的许多过程的子集,因为细胞微环境的重要线索仍然缺乏。
微流体细胞培养平台特别适合进一步提高血管体外模型的生理相关性。例如,内皮细胞可以暴露于剪切应力,这是血管的重要生物力学刺激。此外,在微流体中空间控制流体的可能性允许形成生物分子梯度3,4,5,6。这种梯度在血管生成过程中的形成和模式形成过程中在体内起重要作用。然而,尽管微流体细胞培养平台在传统的2D和3D细胞培养方法中表现出无与伦比的生理相关性,但它们往往缺乏药物筛选所需的必要吞吐量、可扩展性和标准化7.此外,其中许多平台没有商业上,并要求最终用户在使用8之前对其设备进行微结构。这不仅需要制造设备和技术知识,而且限制了质量控制水平,对可重复性有负面影响9。
迄今为止,人类原发性内皮细胞仍然是在体外10中模拟血管生成的最广泛使用的细胞源。然而,原发性人类细胞有一些限制,阻碍其在筛选方法中的日常应用。首先,扩大和扩大初级细胞衍生培养物的可能性有限。因此,对于大规模实验,需要使用来自不同捐赠者的批次,从而导致基因组差异和批次到批次的变化。第二,经过几段后,原发内皮细胞在体外培养时一般会失去相关特性。
来自人类诱导多能干细胞(iPSC)的内皮细胞是一种有前途的替代细胞:它们类似于原发细胞,但基因型更稳定,也适合精确的基因组编辑。此外,iPSC能够自我更新,因此可以无限量地扩展,这使得iPSC衍生细胞成为原体细胞的有吸引力的替代品,用于体外筛选模型13。
在这里,我们将一种在标准化、高通量微流体细胞培养平台中将内皮细胞培养为可渗透的3D微容器的方法。通过将设备放置在摇臂平台上来应用灌注,确保稳健的操作并提高测定的可扩展性。由于微血管不断注入并暴露于血管原性因子的梯度,血管生成在更生理相关的细胞微环境中进行了研究。虽然该协议与许多不同的(初级)内皮细胞14、15源兼容,但我们专注于使用人类iPSC衍生的ECs,以提高这种测定的标准化,并促进其集成在血管药物研究。
该方法描述了40个可渗透内皮微血管在一个强大且可扩展的微流体细胞培养平台中的培养。与传统 2D 和 3D 细胞培养方法相比,该方法展示了如何将一种生理相关的细胞微环境(包括梯度和连续灌注)与具有足够吞吐量的 3D 细胞培养相结合,以进行筛选目的。
与同类微流体测定相比,该方法的主要优点之一是,该方法不依赖泵进行灌注,而是使用摇臂平台同时诱导所有微流体单元的连续灌注。这可确保测定可靠且可扩展:板可以堆叠在摇臂平台上。重要的是,所有微流体单位都保持可单独寻址,这使得这种方法可以在药物筛选中实现,包括生成剂量-反应曲线。此外,如果没有泵,成像和介质更换要简单得多,而且(交叉)污染的风险更低。
这种方法的另一个优点是使用标准化的预制造平台,而类似的微流体细胞培养平台需要由最终用户制造。这种可用性有助于在其他学术和制药研究集团中采用此测定,从而达到标准化。此外,与微流体原型不同,384 孔板接口可确保与当前实验室设备(例如吸气器、板处理机和多通道移液器)兼容,从而促进当前筛选基础设施中的集成.
执行此测定有几个关键步骤。胶原蛋白-1凝胶应完全填充凝胶通道。在凝胶加载过程中,可以通过观察窗口(图2a)或倒置板检查微流体通道(如图1a)来观察这种填充物(如图1a所示)。填充时,胶原蛋白凝胶应保持在中心通道中,不得流入相邻的灌注通道。我们注意到胶原蛋白-1凝胶的质量对于正确的测定性能至关重要。粘度过高的胶原蛋白-1批次会导致凝胶通道的不完全填充。在37°C下聚合10分钟后,凝胶应均匀且清晰。如果胶原蛋白-1不能正确储存(例如,由于冰箱温度波动),胶原蛋白将在通道内聚合,形成清晰可见的纤维。这可能导致在未添加血管生成因子的情况下侵入凝胶,但没有适当的流明发育。
当细胞播种时,纤维素涂层溶液从井中取出,只留下充满涂层溶液的微流体通道。从微流体通道吸入涂层溶液可能会导致凝胶中断或凝胶吸入。电池悬架需要更换/更换此涂层溶液。当使用被动泵送方法播种细胞悬浮液时,这种方法效果最佳,因为直接将细胞悬浮液移入通道表明可重现的种子密度较低。
由于微血管在凝胶上形成稳定的单层,这些小差异只会导致达到汇合所需的不同时间。因此,测定起始点是由汇合时间而不是区域性时间决定的。如有必要,可以延长培养时间,直到对凝胶形成清晰的单层。
在井内,气泡可能由于油井的填充不正确而卡住(参见图 2b)。这些气泡将限制介质的流动,即使设备放置在摇臂平台上,并导致微容器崩溃和不当的梯度形成。将移液器尖端压在井的侧壁上,将提高完全注满井的成功。如果气泡被困在井内,可以通过轻轻地将无菌移液器尖端插入玻璃底部来将其拆下。微流体通道内也可能出现气泡。从井中取出介质后,介质在 30 分钟后从微流体通道中明显蒸发(由于通道内的微升体积)。因此,最好尽可能快地进行介质变化。当介质在蒸发介质的通道中添加时,气泡将滞留在微流体通道内。通过将 P20 移液器直接放置在入口或出口上,并迫使介质从相反的油井穿过微流体,可以手动去除微流体通道内的这些气泡。成功去除气泡会导致另一口井的体积小幅但明显下降。表 1列出了常见错误以及如何排除这些错误。
当需要连续成像时,缺少泵是一个限制,因为摇臂平台将用户限制按顺序时间间隔进行成像。此外,该平台中的介质灌注包括具有低水平剪切应力的双向流动,而体内的血管暴露于具有较高剪切应力水平的单向流动中。虽然我们不观察到双向流动对血管生成的负面影响,但流量是重要的生物力学刺激,最好是受控的。然而,虽然有市售的泵设置,与384孔板的接口仍然具有挑战性,泵设置严重阻碍了此测定的可扩展性。
使用iPSC-ECs研究血管生成的可能性为疾病建模和药物研究开辟了新的机会。与初级EC相比,这些细胞可以产生几乎无限的数量与稳定的基因型,通过使用基因组编辑技术,细胞可以生成,包括基因敲除和敲撞。然而,由于将 EC 与 iPSC 区分的协议相对较新,因此仍不清楚是什么导致 iPSC-EC 最能反映主要 EC,以及正在或可以生成哪些子类型的 EC。此外,关于它们的相关性仍然存在问题。例如,iPSC-EC 是否仍然表现出内皮细胞的典型可塑性?iPSC衍生细胞对细胞微环境的反应和相互作用的程度如何?此处提供的标准化平台可用于回答其中一些问题,以进一步验证 iPSC 衍生的 E 在体外的使用。
这种测定最直接的未来方向是整合在血管生成过程中发挥重要作用的其他细胞类型,如围细胞和巨噬细胞。这将有助于研究巨噬细胞在芽间麻醉或毛细管形成后围虫的依依性中的作用的能力。此外,还可以培养细胞外基质内部或针对细胞外基质的各种其他细胞类型(例如,我们已经显示了神经元和各种上皮结构(如近端小管和小肠)的培养,这些结构可与血管结合使用此方法生成的床。最后,研究合成水凝胶中的血管生成发芽将很有趣,因为其定义的成分进一步增加了测定的标准化,并允许调整影响细胞-基质相互作用的刚度和结合动机。
总之,该方法显示了iPSC衍生的EC在标准化和可扩展的3D血管生成测定中的可行性,该检测将生理相关培养条件结合在具有集成于其中所需的鲁棒性和可扩展性的平台上药物筛查基础设施。
The authors have nothing to disclose.
这项工作部分得到了荷兰卫生研究与发展组织(ZonMw)的”Meer Kennis会见明德·迪伦”计划(项目号114022501)和荷兰心脏基金会CVON联合体赠款的研究资助。重新。
0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
Basal culture medium | NCardia | ||
Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
dPBS | Gibco | 14190-094 | |
Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
HBSS | Gibco | 14025-050 | |
Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |