ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Этот метод описывает культуру эндотелиальных клеток, полученных iPSC, как 40 проникнутых 3D микрососудов в стандартизированной микрофлюидной платформе. Эта платформа позволяет изучать градиентно-управляемый ангиогенный прорастания в 3D, в том числе анастомоз и стабилизации ангиогенных ростков в масштабируемой и высокой пропускной форме.
Abstract
Доклинические лекарственные исследования сосудистых заболеваний требуют в пробирке моделей сосудов, которые поддаются коррективу для скрининга с высокой пропускной способностью. Тем не менее, текущие модели скрининга in vitro, которые имеют достаточную пропускную способность, имеют лишь ограниченную физиологическую значимость, что препятствует переводу результатов из in vitro в in vivo. С другой стороны, микрофлюидные платформы культуры клеток показали беспрецедентную физиологическую релевантность in vitro, но часто не имеют необходимой пропускной способности, масштабируемости и стандартизации. Мы демонстрируем надежную платформу для изучения ангиогенеза эндотелиальных клеток, полученных из индуцированных человека плюрипотентных стволовых клеток (iPSC-ECs) в физиологической соответствующей клеточной микросреде, включая перфузию и градиенты. iPSC-ECs культивируются как 40 проникнуты 3D микрососудов против узорчатых коллагена-1 эшафот. При применении градиента ангиогенных факторов можно изучить важные признаки ангиогенеза, в том числе дифференциацию на оконечности и стебельную клетку и образование просвета. Перфузия флуоресцентными красителями позволяет изучать проницаемость во время и после анастомоза ангиогенных ростков. В заключение, этот метод показывает осуществимость iPSC полученных ECs в стандартизированных и масштабируемых 3D ангиогенных ассеи, который сочетает в себе физиологические соответствующие условия культуры в платформе, которая имеет необходимую надежность и масштабируемость, чтобы быть интегрированы в инфраструктуры скрининга наркотиков.
Introduction
Модели In vitro играют основополагающую роль в открытии и проверке новых лекарственных целей сосудистых заболеваний. Тем не менее, текущие модели скрининга in vitro, которые имеют достаточную пропускную способность, имеют только ограниченную физиологическую актуальность1,что препятствует переводу результатов из in vitro в in vivo. Таким образом, для продвижения доклинических исследований сосудистого препарата необходимы усовершенствованные модели свиной свиной свиной свиной свиной свиной микро-средой.
В течение последнего десятилетия был достигнут значительный прогресс в повышении физиологической значимости моделей сусультуры in vitro. Вместо культивирования эндотелиальных клеток на плоских поверхностях, таких как ткани культуры пластмасс, эндотелиальные клетки могут быть встроены в 3D леса, такие как фибрин и коллаген гели2. В этих матрицах эндотелиальные клетки показывают более физиологически значимый фенотип, связанный с деградацией матрицы и образованием просвета. Тем не менее, эти модели демонстрируют только подмножество многих процессов, которые происходят во время ангиогенного прорастания, как важные сигналы из клеточной микросреды по-прежнему отсутствуют.
Платформы микрофлюидной культуры клеток однозначно подходят для дальнейшего повышения физиологической значимости моделей сусультуры in vitro. Например, эндотелиальные клетки могут подвергаться стрессу сдвига, который является важным биомеханическим стимулом для сосуды. Также возможность пространственно контролировать жидкости в микрофлюитике позволяет формировать биомолекулярные градиенты3,4,5,6. Такие градиенты играют важную роль в vivo во время формирования и узора во время ангиогенеза. Однако, в то время как микрофлюидные платформы культуры клеток показали беспрецедентную физиологическую релевантность по сравнению с традиционными методами 2D и 3D-культуры клеток, они часто не имеют необходимой пропускной способности, масштабируемости и стандартизации, которая необходима для скрининга наркотиков 7. Кроме того, многие из этих платформ не являются коммерчески доступными и требуют от конечных пользователей микрофабриката своих устройств до использования8. Это не только требует производственного аппарата и технических знаний, но и ограничивает уровень контроля качества и негативно влияет на воспроизводимость9.
На сегодняшний день первичные эндотелиальные клетки человека остаются наиболее широко используемым источником клеток для моделирования ангиогенеза in vitro10. Тем не менее, первичные человеческие клетки имеют ряд ограничений, которые препятствуют их обычному применению в подходах скрининга. Во-первых, существует ограниченная возможность расширения и расширения первичных культур, полученных из клеток. Таким образом, для крупномасштабного эксперимента необходимо использовать партии от разных доноров, что приводит к геномным различиям и вариациям партии в партию. Во-вторых, после нескольких проходов, первичные эндотелиальные клетки обычно теряют соответствующие свойства, когда культивируется в пробирке11,12.
Эндотелиальные клетки, полученные из индуцированных стволовыми клетками человека (iPSC), являются перспективной альтернативой: они напоминают первичные клетки, но с более стабильным генотипом, который также поддается точному редактированию генома. Кроме того, iPSCs способны к самообновлению и, таким образом, могут быть расширены в почти неограниченных количествах, что делает клетки, полученные из iPSC, привлекательной альтернативой первичным клеткам для использования в рамках моделей скрининга in vitro13.
Здесь мы описываем метод культуры эндотелиальных клеток как перфусируемые 3D микрососуды в стандартизированной, высокой пропускной микрофлюидной платформе культуры клеток. Перфузия применяется путем размещения устройства на рокер платформы, которая обеспечивает надежную работу и увеличивает масштабируемость асссе. Поскольку микрососуды постоянно пронизаны и подвергаются градиенту ангиогенных факторов, ангиогенное прорастание изучается в более физиологической клеточной микросреде. В то время как протокол совместим со многими различными источниками (первичных) эндотелиальных клеток14,15, мы сосредоточились на использовании человека iPSC полученных ECs для того, чтобы увеличить стандартизацию этого комитета и облегчить его интеграцию в сосудистых исследованиях наркотиков.
Protocol
1. Подготовка устройства
- Перенесите микрофлюидную 384-пуговую пластину на стерильный ламинарный капот.
- Снимите крышку и добавьте 50 qL воды или фосфат-буферизированного сольника (PBS) к каждой из 40 смотровых скважин(рисунок 1b,хорошо B2) с помощью многоканальной или повторяющейся пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Оставьте тарелку с крышкой в стерильной комнатной культуре шкаф при комнатной температуре (RT).
2. Подготовка гель и покрытие
- Приготовьте 2,5 мл из 10 мкг/мл фибронектина (FN) покрытия раствора. Разбавить 25 л 1 мг/мл фибронектина в 2,5 мл PBS Dulbecco (dPBS, кальция и магния бесплатно). Поместите раствор в водяную ванну при 37 градусах Цельсия до использования.
- Приготовьте 100 л раствора коллагена-1. Добавьте 10 кЛ HEPES (1 М) к 10 Зл NaHCO3 (37 г/л) и перемешайте путем пипетки. Поместите трубку на лед и добавьте 80 л коллагена-1 (5 мг/мл), чтобы дать нейтрализованную концентрацию коллагена-1 4 мг/мл. Используйте пипетку, чтобы тщательно перемешать и избежать образования пузырьков.
- Добавьте 1,5 л раствора коллагена-1 (4 мг/мл) в гель-впуск каждого микрофлюидного блока(рисунок 1b,хорошо В1). Убедитесь, что капля геля помещается в середине каждого колодца для того, чтобы гель войти в канал (см. Рисунок 2a).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фазовые гиды предотвращают заполнение смежных каналов и позволяют узорики геля. Правильная загрузка геля может быть подтверждена под ярким микроскопом, наблюдая за образованием мениска через «окно наблюдения» (хорошо B2) или перевернув тарелку вверх ногами. Если гель не полностью заполнил канал, можно добавить дополнительную капельку в размере 1 зл. - Поместите микрофлюидную пластину в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2)в течение 10 мин для полимеризации коллагена-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки полимеризации имеют решающее значение; из-за низких объемов, используемых в микрофлюитике, испарение уже может наблюдаться после 15 мин инкубации, что приводит к коллапсу геля или усадке. - Вынняйте тарелку из инкубатора и перенесите на стерильный ламинарный капот.
- Добавьте 50 кЛ 10 мкг/мл FN покрытие раствора для розетки хорошо верхнего канала перфузии каждого микрофлюидного блока(Рисунок 1b, хорошо A3). Нажмите на кончик пипетки на стороне колодца для правильного заполнения скважины без захвата пузырьков воздуха (см. Рисунок 2b). Канал должен заполниться, а жидкость должна приколоть на розетку (хорошо C1) без хорошо заполняния розетки.
- Поместите тарелку в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) в течение по крайней мере 2 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь, так как гель коллагена-1 вместе со смесью покрытия стабилен не менее 5 дней в инкубаторе. Если смесь покрытия обновляется, более длительные периоды могут быть возможны, но это не было проверено. Решающее значение имеет уровень FN-покрытия, так как это предотвращает обезвоживание геля коллагена-1.
3. Культура посева клеток/микрососуд
- Добавьте 5 мл сыворотки плода и 2,5 мл пера/стрепы до 500 мл базальной эндотелиальной клеточной культуры среднего и фильтр стерилизовать с помощью фильтра верхней бутылки с размером поры 0,22 мкм. Эта среда в настоящее время называется базальной средой.
- Подготовка среды роста сосудов: Добавить 3 мкг/мл сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и 2 ЗЛ 20 мкг/мл основных факторов роста фибробластов (bFGF) до 5 мл базальной среды.
- Быстро оттепели замороженные iPSC-ECs (1 мин) в ванне 37 градусов по Цельсию и перенесите в трубку 15 мл и разбавьте в 10 мл базальной среды.
- Посчитайте клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один флакон содержит 1 миллион клеток в 0,5 мл с жизнеспособностью 90%. - Centrifuge трубки на 100 х г в течение 5 мин. Аспират супернатант, не нарушая клеточной гранулы и resuspend в базальной среде, чтобы дать концентрацию 2 х 107 клеток / мл.
- Перенесите микрофлюидную 384-колодственную пластину из инкубатора в стерильный ламинарный капот.
- Аспирированный fN-покрытие раствор из перфузионного впуска (хорошо A1). Добавьте 25 зЛ базальной среды в входе скважин (хорошо A1).
- Добавьте 1 капельку клеточной подвески к каждому верхнему впуску перфузии хорошо(Рисунок 1b,хорошо A1). Капля должна сгладиться в течение нескольких секунд (см. рисунок 3a,b для иллюстрации этого метода «пассивной накачки»).
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте под микроскопом, является ли посев однородный. Если нет, добавить еще 1 л в розетке и ждать, пока капля выравнивается. - Инкубировать микрофлюидную хорошо пластину на 1 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. После этого клетки должны были прилипать. Если нет, подождите еще 30 минут.
- Удалите базальную среду из верхних скважин перфузии(рисунок 1b,хорошо A3). Добавить теплую среду культуры сосуда в верхней входе перфузии и розетки(Рисунок 1b,колодцы A1 и A3). Поместите пластину на рокер платформы (установить на 7 "угол, 8 мин интервал качания) в инкубаторе (37 кв. C, 5% CO2).
- Изображение пластины с помощью яркого микроскопа с автоматизированной стадии в день 1 и 2 после посева, чтобы подтвердить жизнеспособность клеток. Через 2 дня против эшафота должен был образоваться сольственный монослой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если каналы не кажутся одинаково сливовыми, микрососуды могут быть культивированы еще на 24 ч.
4. Изучение ангиогенного прорастания в том числе Совет- и сталк-клеток формирование
- Приготовьте 4,5 мл ангиогенной среды прорастания, дополняя базальную среду 4,5 мл VEGF (50 мкг/мл), 4,5 мл форбола 12-миристата-13-ацетата (PMA) (2 мкг/мл запасов) и 2,25 л сфингосина-1-фрафата (SP1).
- Подготовьте 8,5 мл среднего роста судна (базальная среда, дополненная 30 нг/мл VEGF и 20 нг/мл bFGF).
- Аспирсредовый носитель из скважин и добавляй 50 л свежей сосудной культуры среды в верхний перфузионный впуски и выходные скважины и гель-впускные и выходные колодцы(рисунок 1b,скважины A1, A3, B1 и B3).
- Добавьте 50 зЛ ангиогенной смеси ростка к каждому из нижних впусковых каналов перфузии(Рисунок 1b,скважины C1 и C3).
- Поместите устройство обратно в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) на рокер платформы для того, чтобы сформировать градиент ангиогенных факторов роста.
- Изображение 1 день и 2 дня после добавления ангиогенных факторов роста с помощью яркого поля микроскопа с автоматизированной стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжить культивирование микрососудов для изучения анастомоза (перейдите в раздел 5) или исправить и пятно микрососудов для количественной оценки прорастания длины и морфологии в день 2 и день 6 (перейдите на раздел 6).
5. Изучение анастомоза и стабилизации ростков
- Изображение с помощью яркого поля микроскоп с автоматизированной стадии.
- Добавьте 1 зл флуоресцентно маркированного альбумина (0,5 мг/мл) в верхний впуск перфузий(рисунок 1b,хорошо А1) и смешайте с помощью 50-й пипетки.
- Перенесите пластину на флуоресцентный микроскоп с автоматизированной стадией и инкубатором, установленным при 37 градусах Цельсия. Установите микроскоп в 10-кратном объективе и правильных настройках экспозиции (например, тетраметилродамин (TRITC-канал), 20 мс экспозиции). Приобретайте замедленное изображение каждую минуту в течение 10 минут.
- Снимите пластину с микроскопа и перенесите пластину на стерильный ламинарный капот.
- Удалите все средство из скважин и замените как сосудную культуру среднего, так и ангиогенную среду прорастания в соответствующих скважинах (см. шаги 4.3 и 4.4).
- Поместите устройство обратно в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2)для продолжения ангиогенного прорастания.
- Повторите шаги 5.1'5.6 для изучения проницаемости на 6-й день.
6. Фиксация, окрашивание и визуализация
- Аспирируй все культурные носители из всех колодцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточная среда или жидкости в микрофлюидных каналах не влияют на фиксацию из-за ее низкого объема в 1 х 2 л. - Добавьте 25 qL 4% параформальдегида (PFA) в PBS ко всем впускам перфузии(рисунок 1b,A1 и C1) и розетки скважин(рисунок 1b,A3 и C3). Инкубировать в течение 10 минут на RT. Поместите устройство под небольшим углом (5 ") для индуцирования потока (например, путем размещения одной стороны пластины на крышке).
- Аспир ПФА из скважин. Вымойте все заливы перфузии и розетки дважды с 50 зл и солейного раствора Хэнка (HBSS). Аспир HBSS из скважин.
- Permeabilize на RT в течение 10 мин, добавив 50 зл и 0,2% неионический сурфактант для всех заливов перфузии и выходов.
- Аспирируй неионический сурфактант из скважин. Вымойте перфузионные каналы дважды, добавив 50 л HBSS на все входе перфузии и розетки скважин. Аспир HBSS из скважин.
- Пятно ядра с помощью Hoechst (1:2,000) и F-актина с использованием фаллоидина (1:200) в HBSS. Приготовьте 2,2 мл для 40 единиц и добавьте 25 кL к каждому впуску и выходу перфузии. Поместите пластину под небольшим углом и инкубировать на RT, по крайней мере 30 минут.
- Вымойте дважды с 50 л HBSS во всех заливов перфузии и розетки.
- Непосредственно изображение с помощью флуоресцентного микроскопа с автоматизированной стадии или хранить пластины защищены от света при 4 градусов по Цельсию для последующего использования.
Representative Results
Микрофлюидная платформа 3D-клеточной культуры состоит из 40 проникнутых микрофлюидных единиц(рисунок 1a,b),который используется для изучения ангиогенного прорастания пронизы микрососудов против узорчатого коллагена-1 геля(рисунок 1c). Эти микрососуды постоянно пронизаны и подвергаются градиентангангии факторов роста(рисунок 3a-d). Ангиогенные ростки могут быть либо изучены через 2 дня после градиентного воздействия или культивируется в течение более 5 дней после градиентного воздействия для изучения анастомоза и стабилизации ростка (см. временную шкалу, Рисунок 1d).
Посев iPSC-ECs с помощью метода пассивной прокачки должен привести к однородной плотности посева(рисунок 4a,b). Культура под непрерывным перфузией привела к слиянию микрососудов в течение 2 дней, с клетками полностью выстилающий окружность микрофлюидного канала и образование слияния монослой против узорного коллагена-1 гель.
Воздействие градиента ангиогенных факторов привело к направленной ангиогенной прорастания микрососудов в узорчатом геле коллагена-1(рисунок 5а-г). Четкое образование клеток кончика и вторжение в гель коллагена-1 было видно 24 ч после добавления ангиогенного градиента, в то время как клетки стебля, включая образование промена, были видны после 48 ч(Рисунок 5a).
После фиксации и окрашивания, капиллярная сеть может быть визуализирована с помощью фаллоидина, чтобы испачкать F-актин и с помощью Hoechst 33342, чтобы испачкать ядро(Рисунок 5b,c). Эти ростки могут быть количественно (например, форма и длина14). Без добавления факторов роста, никакого вторжения в коллаген-1 гель не следует соблюдать(рисунок 5d). Конфокальная визуализация была использована для определения диаметра ростка и для подтверждения образования проема(рисунок 5e-g).
Ростки продолжают расти в направлении градиента и достигают противоположного перфузионного канала в течение 3–4 дней после добавления ангиогенных факторов роста. Это приводит к реконструкции сосудистой сети, с явным сокращением числа ангиогенных ростков(рисунок 6a). Образование люмен овечивалое оценивалось путем перфузии сосудистой сети с флуоресцентно обозначенными макромолекулами (например, альбумином или декстрантом). Perfusing микрососудов с 0,5 мг /мл помечены альбумин до и после анастомоза показали явную разницу в проницаемости ростка после 10 мин (Рисунок 6b-e), который предполагает, что капилляры стабилизироваться и созреть после анастомоза.
Рисунок 1: Протокол микрофлюидной культуры клеток для микросудов, полученных из iPSC. ()В нижней части микрофлюидной культуры ячейки устройство показано отображение 40 микрофлюидных единиц, которые интегрированы под 384-наилучшим образом пластины. Больший вид отображает один из 40 микрофлюидных блоков. (б)Каждый микрофлюидный блок расположен под 9 скважинами с 3 впускными колодцами и 3 выходными скважинами. Микрофлюидные каналы разделены хребтами («фазгидами»), которые позволяют узорить гидрогели в центральном канале («гелевый канал»), в то время как все еще контакт с соседними каналами («перфузионные каналы»). (с)Метод к культуре perfused микрососуд в микрофлюидном устройстве, который используется для изучения градиента приводом ангиогенного прорастания через узорчатый коллаген-1 матрицы. (d)Хронология для изучения ангиогенного прорастания и/или анастомоза. Эта цифра была изменена с ван Duinen и др.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Процедуры загрузки геля и среднего. ()Примеры правильного и неправильного осаждения геля. Правильная подача приводит к узорчатом узорчатом коллагену-1 гелю в среднем канале, который впоследствии полимеризуется. (б)Примеры правильного и неправильного заполнения скважин. Скважины заполняются в порядке 1 х 4, чтобы предотвратить захват воздушного пузыря в микрофлюидных каналах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Непрерывный гидростатическое давление приводом потока и градиентстабилизации. ()Гидростатическое давление различия между скважинами привести к пассивному выравниванию и потоку в микрофлюидных каналах. (b)Размещение устройства на рокер-платформе, установленной на 7 и 8 мин, приводит к непрерывному, двунаправленному перфузии в микрофлюидных каналах. (c)Градиенты образуются путем введения двух различных концентраций в скважинах, которые постоянно обновляются пассивным выравниванием. (d)Градиентная визуализация с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-экстран. Двухнаправленный поток стабилизирует градиент до 3 дней. Шкала бар 200 мкм. Эта цифра была изменена с ван Duinen и др.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Пассивный метод накачки для посева клеток. ( ) Пассивная накачка обусловлена различиями в давлении, которые вызваны различиями в поверхностном натяжении. Это приводит к притоку от капли (высокое внутреннее давление) к резервуару (низкое внутреннее давление). (b)Промежуток времени капли (серый контур), который помещается поверх впускного (белого контура) микрофлюидного канала (синий контур). Сразу после добавления(Рисунок 4b, i),капля на верхней части входе сжимается(Рисунок 4b, ii: 1 s после добавления; iv: 2 s после добавления), что приводит к потоку к розетке. Это продолжается до тех пор, пока капелька мениска закреплена входе(Рисунок 4b, iv). Шкала бар 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Надежное 3D прорастание микросудов iPSC-EC. ()Проращивание iPSC-EC с течением времени. Микрососуды выращивались в течение 48 ч (справа), а затем стимулировали ангиогенным коктейлем, содержащим 50 нг/мл VEGF, 500 nM S1P и 2 нг/мл PMA. Первые наконечник-клетки, которые вторгаются в коллаген-1 эшафот (средний) видны 24 ч после воздействия. Первые люмены видны (стрелки) 48 ч после воздействия (справа), в то время как наконечник-клетки мигрировали дальше в направлении градиента. (b)Массив из 15 микрососудов, которые стимулировались VEGF, S1P и PMA в течение 2 дней и окрашенных для F-актина (желтый) и ядер (синий). Шкала бар 200 мкм.(с)Стимулированный микрососуд (положительный контроль). (d)Нестимулированное микрососуд (отрицательный контроль). (e)Максимальная проекция одного капилляра внутри геля. (f)То же самое, что(г),но сосредоточены на середине. Пунктирная линия указывает положение ортогоналкого обзора в панели g. Шкала баров (a-d: 200 мкм; e-g: 20 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Визуализация ангиогенной проницаемости ростков до и после анастомоза. ()Анастомоз с базальным каналом вызывает обрисовку и созревание ангиогенных ростков. Крупный рост капиллярной кровати через 2, 4, 6 и 7 дней после стимуляции с ангиогенными факторами роста. (b)Ангиогенные ростки через 2 дня после добавления ангиогенных факторов роста. Ангиогенные ростки образуются в гель, но еще не подключены к нижней перфузионного канала. (c)Перфузия микрососуда с раствором 0,5 мг/мл альбумина-Алекса 555. Флуоресцентные изображения, полученные на 0 и 10 мин. (d, e) То же самое, что и в панелях b и c, но после 7 дней стимуляции. Ростки соединены с другой стороной и образуют сливающееся микрососуд в базальном канале перфузии. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Проблема | Вызвать | Решение |
| Коллаген-1 не входит и не заполняет канал полностью | Капля коллагена-1 не помещается на верхней части впускного налета | Аккуратно поместите капельку поверх входе из гелевого канала |
| Объем коллагена-1 слишком низок | Используйте 1,5 л геля, чтобы заполнить канал полностью | |
| Коллаген-1 слишком вязкий | Используйте другую партию коллагена-1 | |
| Коллаген-1 вливается в перфузийные каналы | Коллаген-1 пронизан прямо в входе гелевого канала | Аккуратно поместите капельку поверх входе из гелевого канала |
| Коллаген-1 не ясно / волокна формирования | Коллаген-1 не хранится должным образом | Хранить коллаген-1 при 4 градусах Цельсия, не замерзайте |
| NaHCO3 и HEPES не смешиваются задолго до добавления коллагена-1 | Тщательно перемешать NaHCO3 и HEPES путем пипетки перед добавлением коллагена-1 | |
| Капля не сокращается с помощью пассивного метода накачки | Капля прилипает к стороне колодца | Аспир капли и добавить новую капельку на верхней части входе |
| Убедитесь, что выход наяпой заполнен, по крайней мере, 20 л среднего | ||
| Прорастание не наблюдается | Факторы роста не добавляются или aliquots не хранятся должным образом | Подготовка свежей ангиогенной среды прорастания |
| Воздушный пузырь блокирует перфузию/ градиентное образование | Удалить пузырьки воздуха с помощью пипетки P20 или P200 | |
| Разница в объеме между скважинами | Объемы во всех скважинах должны быть равными, чтобы сформировать линейный градиент | |
| Клетки нежизнеспособны | Плита не размещена на рокер платформы / рокер платформы выключен | Убедитесь, что рокер платформа на и имеет право время цикла / угол (8 мин / 7 ") |
| Нет перфузии возможно из-за присутствия пузырьков воздуха | Удалить пузырьки воздуха с помощью пипетки P20 или P200 | |
| Никаких люменов не образуется, клетки мигрируют как одиночные клетки | Ангиогенная прорастание смесь была добавлена до формирования монослойной | Подождите еще 24 ч, прежде чем добавлять ангиогенные факторы роста |
| Основные изменения плотности прорастания | Различия в плотности клеток после посева | Проверьте, является ли плотность клеток однородной и сопоставимой между микрофлюидными единицами. При необходимости добавьте еще одну капельку клеточной подвески |
Таблица 1: Устранение распространенных ошибок.
Discussion
Этот метод описывает культуру 40 перфузируемых эндотелиальных микрососудов в надежной и масштабируемой платформе микрофлюидной культуры клеток. По сравнению с традиционными методами 2D и 3D-культуры клеток, этот метод показывает, как физиологическая релевантная клеточная микросреда, включающая градиенты и непрерывную перфузию, может быть объединена с 3D-клеточной культурой с адекватной пропускной мощностью для скрининга Целей.
Одним из основных преимуществ по сравнению с сопоставимыми микрофлюидных анализов является то, что этот метод не опирается на насосы для перфузии, но использует платформу рокер, чтобы вызвать непрерывную перфузию во всех микрофлюидных единиц одновременно. Это гарантирует, что ассеий является надежным и масштабируемым: пластины могут быть уложены на рокер платформы. Важно отметить, что все микрофлюидные блоки остаются индивидуально адресными, что позволяет внедрить этот метод в рамках скрининга на наркотики, включая генерацию кривой дозы-реакции. Кроме того, без насоса, визуализации и средней замены гораздо проще с меньшим риском (кросс)-загрязнения.
Еще одним преимуществом этого метода является использование стандартизированной, предварительно изготовленной платформы, в то время как сопоставимые платформы микрофлюидной культуры клеток должны быть изготовлены конечными пользователями. Такая доступность облегчает принятие этого исследования среди других академических и фармацевтических исследовательских групп, что приводит к стандартизации. Кроме того, в отличие от микрофлюидных прототипов, интерфейс 384-хорошо пластины обеспечивает совместимость с текущим лабораторным оборудованием (например, аспираторы, пластины обработчики и многоканальные пипетки), облегчая интеграцию в рамках текущей инфраструктуры скрининга .
Есть несколько важных шагов в выполнении этого ассепа. Гель коллагена-1 должен полностью заполнить гелевый канал. Во время погрузки геля, эта начинка может наблюдаться путем проверки микрофлюидных каналов либо через окно наблюдения(рисунок 2a) или переворачивая пластину вверх дном (как показано на рисунке 1a). При заполнении коллагеновый гель должен оставаться в центральном канале, не вливаясь в соседние перфузийные каналы. Мы заметили, что качество коллагена-1 гель имеет решающее значение для надлежащей производительности ассеа. Партии коллагена-1 с слишком высокой вязкостью приведут к неполной заполнению гелевого канала. После 10 мин полимеризации при 37 градусах Цельсия гель должен быть однородным и прозрачным. Если коллаген-1 не хранится должным образом (например, из-за колебаний температуры в холодильнике), коллаген будет полимеризироваться в каналах с четко видимым образованием волокна. Это может привести к вторжению ЭК в гель без добавления ангиогенных факторов, но без надлежащего развития просвета.
Когда клетки посеяны, фибронектин покрытие раствор удаляется из колодцев, оставляя только микрофлюидные каналы заполнены покрытием раствора. Стремление раствора покрытия из микрофлюидных каналов может привести к нарушению геля или аспирации геля. Суспензия клетки должна заменить/вытеснить это покрытие раствора. Это работает лучше всего, когда подвеска ячейки посеяна с помощью пассивного метода накачки, так как непосредственно пипетка яточной подвески в каналы показывают менее воспроизводимую плотность посева.
По мере того как микрососуды формируют стабилизированный монослой против геля, эти малые разницы только приводят в по-разному временах необходимых для достижения confluency. Таким образом, отправная точка ассеа определяется не культурным временем, а времям. При необходимости время культивирования может быть продлено до тех пор, пока против геля не образуется четкий монослой.
Внутри скважин воздушные пузырьки могут быть захвачены неправильным заполнением скважин (см. рисунок 2b). Эти пузырьки воздуха будут ограничивать поток среды, даже когда устройство находится на платформе рокера, и привести к коллапсу микросудна и неправильному образованию градиента. Принажатие наконечника пипетки на боковую стенку колодцев увеличит успех полного заполнения скважины. Если пузырь воздуха находится в ловушке в колодцах, он может быть удален, аккуратно вставив стерильный кончик пипетки в стеклянное дно. Воздушные пузыри могут также возникать в микрофлюидных каналах. Когда среда удалена из скважин, испарение среды заметно из микрофлюидных каналов после 30 мин (из-за микролитра объемов в каналах). Таким образом, средние изменения предпочтительно выполняются как можно быстрее. Когда среда добавляется в канал с испаряемым средством, пузырьки воздуха будут находиться в ловушке в микрофлюидных каналах. Эти пузырьки воздуха в микрофлюидных каналах могут быть удалены вручную, поместив пипетку P20 непосредственно на входе или розетке и заставляя среду через микрофлюиды из противоположного колодца. Успешное удаление пузырьков воздуха приводит к небольшому, но заметному снижению объема в другой скважине. В таблице 1 перечислены распространенные ошибки и способы их устранения.
Отсутствие насоса является ограничением, когда требуется непрерывное изображение, так как платформа рокера ограничивает пользователя изображением на последовательных временных интервалах. Кроме того, перфузия среды на этой платформе состоит из двунаправленного потока с низким уровнем напряжения сдвига, в то время как сосудininin in vivo подвергается однонаправленному потоку с более высоким уровнем напряжения сдвига. Хотя мы не наблюдаем негативных последствий двунаправленного потока в отношении ангиогенного прорастания, поток является важным биомеханическим стимулом и предпочтительно контролируется. Однако, в то время как Есть коммерчески доступных насосных установки, взаимодействие с 384-ну хорошо пластины остается сложной задачей и насос установки серьезно препятствуют масштабируемости этого асссе.
Возможность использования iPSC-ECs для изучения ангиогенного прорастания открывает новые возможности в моделировании заболеваний и исследованиях лекарственных средств. В отличие от первичных ECs, эти клетки могут быть созданы в почти безграничных количествах со стабильным генотипом и с помощью методов редактирования генома, клетки могут быть созданы, что в том числе геннокаутов и стук-ин. Однако, поскольку протоколы, отличающие ECs от iPSC, являются относительно новыми, до сих пор неясно, что приводит к iPSC-ECs, которые наилучшим образом отражают первичные ECs и какие подтипы EC являются или могут быть созданы. Кроме того, по-прежнему остаются вопросы, касающиеся их релевантности. Например, по-прежнему ли iPSC-ECs демонстрируют пластичность, характерную для эндотелиальных клеток? И в какой степени клетки, полученные из iPSC, реагируют и взаимодействуют со своей клеточной микросредой? Стандартизированная платформа, представленная здесь, может быть использована для ответа на некоторые из этих вопросов для дальнейшей проверки использования eCs in vitro, полученных из iPSC.
Наиболее прямое направление будущего для этого ассебудет будет интеграция других типов клеток, которые играют важную роль во время ангиогенеза, таких как перициты и макрофаги. Это облегчит возможность изучения роли макрофагов во время анастомоза между ростками или присоединения перицитов после образования капилляров. Кроме того, можно культивировать различные другие типы клеток внутри или против внеклеточной матрицы (например, мы показали культуру нейронов и различных эпителиальных структур, таких как проксимальные трубки и тонкий кишечник), которые могут быть объединены с сосудистыми кровати, генерируемые с помощью этого метода. Наконец, будет интересно изучить ангиогенное прорастания в синтетических гидрогелях, так как их определенный состав еще больше увеличивает стандартизацию асссея и позволяет настройку жесткости и связывающих мотивов, влияющих на взаимодействие клеток и матриц.
В заключение, этот метод показывает осуществимость iPSC полученных ECs в стандартизированных и масштабируемых 3D ангиогенных ассеи, который сочетает в себе физиологические соответствующие условия культуры в платформе, которая имеет необходимую надежность и масштабируемость, чтобы быть интегрированы в инфраструктуры скрининга наркотиков.
Disclosures
P. Vulto и T. Hankemeier являются акционерами Mimetas BV. В. Боргорфьф и А. Райджерк являются сотрудниками Ncardia BV. В. ван Дуйнен, В. Стэм, В.В. Орлова и А.Я. ван Зонневелд не разглашаем информацию.
Acknowledgments
Эта работа частично поддерживается исследовательским грантом от программы «Meer Kennis met Minder Dieren» (проект No 114022501) Нидерландской организации по исследованиям и развитию здравоохранения (ЗонМ) и грантом голландского фонда сердца CVON Подключите.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
| 3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
| 4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
| Basal culture medium | NCardia | ||
| Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
| Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
| dPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | |
| Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
| iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
| OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
| Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
| PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
| S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
| TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
| VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |
References
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. , 17-28 (2013).
- Kim, S., Chung, M., Jeon, N. L. Three-dimensional biomimetic model to reconstitute sprouting lymphangiogenesis in vitro. Biomaterials. 78, 115-128 (2016).
- Kim, C., Kasuya, J., Jeon, J., Chung, S., Kamm, R. D. A quantitative microfluidic angiogenesis screen for studying anti-angiogenic therapeutic drugs. Lab Chip. 15 (1), 301-310 (2015).
- Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), e0133880 (2015).
- Tourovskaia, A., Fauver, M., Kramer, G., Simonson, S., Neumann, T. Tissue-engineered microenvironment systems for modeling human vasculature. Experimental biology and medicine. 239 (9), 1264-1271 (2014).
- Junaid, A., Mashaghi, A., Hankemeier, T., Vulto, P. An end-user perspective on Organ-on-a-Chip: Assays and usability aspects. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 15-22 (2017).
- Pagano, G., et al. Optimizing design and fabrication of microfluidic devices for cell cultures: An effective approach to control cell microenvironment in three dimensions. Biomicrofluidics. 8 (4), 046503 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8, 14361 (2017).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Passier, R., Orlova, V., Mummery, C. Complex Tissue and Disease Modeling using hiPSCs. Cell Stem Cell. 18 (3), 309-321 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids Barriers CNS. 15 (1), 23 (2018).
Tags
Биоинженерия Выпуск 153 3D-культура клеток микрофлюидика in vitro индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки эндотелиальные клетки ангиогенез градиенты высокопроизводительный скрининг развитие анализаErratum
Formal Correction: Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro
Posted by JoVE Editors on 01/25/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. The Protocol section was updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 µL of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 µL of basal medium in the outlet well (well A3).
