Denne metode beskriver kulturen af IPSC-afledte endotelceller som 40 perfbrugte 3D mikrofartøjer i en standardiseret mikrofluidisk platform. Denne platform muliggør studiet af gradient-drevet angiogen spiring i 3D, herunder anastomose og stabilisering af de angiogene spirer i en skalerbar og høj gennemløb måde.
Præ-klinisk stof forskning af Vaskulære sygdomme kræver in vitro-modeller af Vaskulaturen, der kan ændres til high-gennemløb screening. Nuværende in vitro-Screenings modeller, der har tilstrækkelig kapacitet, har kun begrænset fysiologisk relevans, hvilket hindrer oversættelsen af fund fra in vitro til in vivo. På den anden side, mikrofluidisk cellekultur platforme har vist uovertruffen fysiologisk relevans in vitro, men ofte mangler den nødvendige gennemløb, skalerbarhed og standardisering. Vi demonstrerer en robust platform til at studere angiogenese af endotelceller afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC-ECs) i et fysiologisk relevant cellulært mikromiljø, herunder perfusion og gradienter. IPSC-ECs dyrkes som 40 perfbrugte 3D-mikrofartøjer mod et mønstret kollagen-1-stilladset. Ved anvendelse af en gradient af angiogene faktorer, vigtige kendetegn af angiogenese kan undersøgt, herunder differentiering i spids-og stilk celle og dannelsen af perfbrugelige lumen. Perfusion med fluorescerende Tracer farvestoffer gør det muligt at studere permeabilitet under og efter anastomose af de angiogene spirer. Afslutningsvis, denne metode viser gennemførligheden af iPSC-afledte ECs i en standardiseret og skalerbar 3D angiogen analyse, der kombinerer fysiologiske relevante kulturforhold i en platform, der har den nødvendige robusthed og skalerbarhed, der skal integreres i lægemiddel screening infrastrukturen.
In vitro-modeller spiller en grundlæggende rolle i opdagelsen og validering af nye Drug mål for Vaskulære sygdomme. Nuværende in vitro-Screenings modeller, der har tilstrækkelig kapacitet, har kun begrænset fysiologisk relevans1, hvilket hindrer oversættelsen af fund fra in vitro til in vivo. Således, at fremme præ-klinisk vaskulære stof forskning, forbedrede in vitro-modeller af Vaskulaturen er nødvendige, der kombinerer High-gennemløb screening med en fysiologisk relevante 3D cellulære mikro-miljø.
Inden for det seneste årti er der gjort betydelige fremskridt for at øge den fysiologiske relevans af in vitro-modeller af Vaskulaturen. I stedet for dyrkning endotelceller på flade overflader såsom væv-kultur plast, endotelceller kan indlejres i 3D stilladser, såsom fibrin og kollagen gels2. Inden for disse matricer viser endotelcellerne en mere fysiologisk relevant fænotype forbundet med matrix nedbrydning og lumen dannelse. Men disse modeller kun demonstrere en delmængde af de mange processer, der opstår under angiogen spiring som vigtige signaler fra cellulære mikromiljø er stadig mangler.
Mikrofluidic cellekultur platforme er unikt egnet til yderligere at øge den fysiologiske relevans af in vitro-modeller af vasculature. For eksempel kan endotelceller blive udsat for forskydnings stress, som er en vigtig Biomekanisk stimulus til vasculature. Muligheden for at kontrollere væsker inden for mikrofluidics giver også mulighed for dannelse af biomolekulære gradienter3,4,5,6. Sådanne gradienter spiller en vigtig rolle in vivo under dannelsen og mønstret under angiogenesis. Men mens mikrofluidisk cellekultur platforme har vist uovertruffen fysiologisk relevans over traditionelle 2D og 3D cellekultur metoder, de ofte mangler den nødvendige gennemløb, skalerbarhed og standardisering, der er nødvendig for Drug screening 7. også, mange af disse platforme er ikke kommercielt tilgængelige og kræver, at slutbrugerne til at mikrofabrikere deres enheder før brug8. Dette kræver ikke kun fremstillings apparater og teknisk viden, men begrænser også kvalitetskontrol niveauet og påvirker reproducerbarhed9negativt.
Til dato, primære humane endotelceller forbliver den mest udbredte celle kilde til model angiogenese in vitro10. Men, primære humane celler har en række begrænsninger, der hindrer deres rutine anvendelse i screening tilgange. For det første er der en begrænset mulighed for at skalere op og udvide primær celle-afledte kulturer. For store forsøg skal der således anvendes partier fra forskellige donorer, hvilket resulterer i genomforskelle og variationer fra batch til batch. For det andet, efter et par passager, primære endotelceller generelt mister relevante egenskaber, når kultiveret in vitro11,12.
Endotelceller afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC) er et lovende alternativ: de ligner primære celler, men med en mere stabil genotype, der også er modtagelig for præcis genomredigering. Desuden, iPSCs er i stand til at selv forny og dermed kan udvides i næsten ubegrænsede mængder, som gør iPSC-afledte celler et attraktivt alternativ til primære celler til brug inden in vitro screening modeller13.
Her beskriver vi en metode til kultur endotelceller som perfbrugelige 3D-mikrobeholdere i en standardiseret, højt gennemløb mikrofluidisk cellekultur platform. Perfusion påføres ved at placere enheden på en rocker platform, som sikrer robust drift og øger skalerbarheden af analysen. Da mikroskibene kontinuerligt anvendes og udsættes for en gradient af angiogene faktorer, undervises angiogen spiring i et mere fysiologisk relevant cellulært mikromiljø. Mens protokollen er kompatibel med mange forskellige kilder til (primære) endotelceller14,15, fokuserede vi på at bruge humane IPSC-afledte ECs for at øge standardiseringen af denne analyse og for at lette dens integration inden for vaskulære stof forskning.
Denne metode beskriver kulturen i 40 perfbrugelige endotelmikrobeholdere inden for en robust og skalerbar mikrofluidisk cellekultur platform. Sammenlignet med traditionelle 2D-og 3D-celle dyrkningsmetoder viser denne metode, hvordan et fysiologisk relevant cellulært mikromiljø, der omfatter gradienter og kontinuerlig perfusion, kan kombineres med 3D-cellekultur med tilstrækkelig gennemløb til screening Formål.
En af de største fordele i forhold til sammenlignelige mikrofluidisk analyser er, at denne metode ikke er afhængig af pumper til perfusion, men bruger en rocker platform til at fremkalde kontinuerlig perfusion i alle mikrofluidisk enheder samtidigt. Dette sikrer, at analysen er robust og skalerbar: pladerne kan stables på en rocker platform. Det er vigtigt, at alle mikrofluidiske enheder forbliver individuelt adresserbare, hvilket gør det muligt at gennemføres denne metode inden for lægemiddel screening, herunder generering af en dosis-respons kurve. Desuden, uden en pumpe, billeddannelse og medium udskiftning er langt enklere med mindre risiko for (kryds)-kontaminering.
En anden fordel ved denne metode er brugen af en standardiseret, præ-fremstillede platform, mens sammenlignelige mikrofluidisk cellekultur platforme skal fremstilles af slutbrugerne. Denne tilgængelighed letter vedtagelsen af denne analyse blandt andre akademiske og farmaceutiske forskningsgrupper, hvilket fører til standardisering. I modsætning til mikrofluidiske prototyper sikrer 384-Well-plade interfacet også kompatibilitet med det nuværende laboratorieudstyr (f. eks. aspiratorer, plade handlere og multikanalpipetter), hvilket letter integrationen inden for den nuværende screening infrastruktur .
Der er flere kritiske trin i udførelsen af denne analyse. Collagen-1 gel skal fylde gelkanalen helt. Under pålæsning af gel kan denne fyldning observeres ved at inspicere de mikrofluidiske kanaler enten gennem observationsvinduet (figur 2a) eller ved at spejlvende pladen på hovedet (som vist i figur 1a). Mens påfyldning, kollagen gel bør forblive i midterkanalen, uden at flyde i tilstødende perfusion kanaler. Vi bemærkede, at kvaliteten af kollagen-1 gel er afgørende for korrekt analyse ydeevne. Kollagen-1 partier med for høj viskositet vil føre til ufuldstændig fyldning af gel-kanalen. Efter 10 minutters polymerisering ved 37 °C skal gelen være homogen og klar. Hvis kollagen-1 ikke opbevares korrekt (f. eks. på grund af svingende temperaturer i køleskab), vil kollagen polymerisere inden for kanalerne med klart synlige fiber dannelse. Dette kan resultere i invasion af ECs i gelen uden tilsætning af angiogene faktorer, men uden ordentlig lumen udvikling.
Når cellerne er seedet, er fibronektin coating opløsning fjernet fra brøndene, efterlader kun de mikrofluidisk kanaler fyldt med belægning løsning. Aspiration af overfladebehandlings opløsningen fra mikrofluidiske kanaler kan forårsage gel-forstyrrelse eller gel aspiration. Den cellesuspension skal erstatte/fortrænge denne belægning løsning. Dette fungerer bedst, når cellesuspensionen er seedet ved hjælp af den passive pumpe metode, da direkte Pipettering af cellesuspensionen i kanalerne viser mindre reproducerbare såning tætheder.
Da mikroskibene danner et stabilt enkeltlags mod gelen, resulterer disse små forskelle kun i forskellige tider, der er nødvendige for at nå konfluency. Således er analysen startpunktet bestemmes ved konfluency snarere end kultur tid. Om nødvendigt kan dyrknings tiden forlænges, indtil der er dannet en klar enkeltlags mod gelen.
I brøndene kan luftbobler fanges ved ukorrekt fyldning af brøndene (Se figur 2b). Disse luftbobler vil begrænse strømmen af medium, selv når enheden er placeret på en rocker platform, og resultere i kollaps af mikrofartøjet og forkert gradient dannelse. Ved at trykke pipettespidsen mod sidevæggen af brøndene vil øge succesen med helt at fylde brønden. Hvis en luftboble er fanget i brøndene, kan den fjernes ved forsigtigt at indsætte en steril pipettespids i glasbunden. Luftbobler kan også forekomme inden for de mikrofluidiske kanaler. Når mediet er blevet fjernet fra brøndene, er fordampning af medium mærkbar fra de mikrofluidiske kanaler efter 30 min (på grund af mikroliter volumener i kanalerne). Således udføres medium ændringer fortrinsvis så hurtigt som muligt. Når mediet tilsættes i en kanal med fordampet medium, vil luftbobler blive fanget i de mikrofluidiske kanaler. Disse luftbobler inden for de mikrofluidiske kanaler kan fjernes manuelt ved at placere en P20-pipette direkte på enten indløbet eller stikkontakten og tvinge medium gennem mikrofluidics fra det modsatte brønd. Vellykket fjernelse af luftbobler resulterer i en lille, men mærkbar nedgang i volumen i den anden brønd. Tabel 1 viser almindelige fejl, og hvordan du foretager fejlfinding af dem.
Manglen på en pumpe er en begrænsning, når kontinuerlig billeddannelse er påkrævet, da rocker platformen begrænser brugeren til billede i sekventielle tidsintervaller. Desuden består perfusion af medium i denne platform af bi-directional flow med lave niveauer af forskydnings stress, mens Vaskulaturen in vivo er udsat for ensrettede flow med højere niveauer af forskydnings stress. Mens vi ikke observere negative virkninger af bi-directional flow med hensyn til angiogen spiring, flow er en vigtig Biomekanisk stimulus og fortrinsvis kontrolleres. Men mens der er kommercielt tilgængelige pumpe opsætninger, grænseflade med 384-brønd pladen forbliver udfordrende og pumpe opsætninger alvorligt hæmmer skalerbarheden af denne analyse.
Muligheden for at bruge iPSC-ECs til at studere angiogen spiring åbner op for nye muligheder i sygdoms modellering og narkotikaforskning. I modsætning til primære ECs, kan disse celler genereres i næsten ubegrænsede mængder med en stabil genotype og ved hjælp af genomredigering teknikker, kan celler genereres, herunder gen knockouts og Knock-ins. Da protokollerne til at differentiere ECs fra iPSC er relativt nye, er det dog stadig uklart, hvad der fører til iPSC-ECs, som bedst afspejler primære ECs, og hvilke undertyper af EF der er eller kan genereres. Der er også stadig spørgsmål vedrørende deres relevans. For eksempel, gør iPSC-ECs stadig udviser plasticitet, der er typisk for endotelceller? Og i hvilken grad reagerer iPSC-afledte celler på og interagerer med deres cellulære mikromiljø? Den standardiserede platform præsenteret her kunne bruges til at besvare nogle af disse spørgsmål for yderligere at validere brugen af iPSC-afledte ECs in vitro.
Den mest ligefremme fremtidige retning for denne analyse vil være integrationen af andre celletyper, der spiller en vigtig rolle under angiogenese, såsom pericytes og makrofager. Dette vil lette evnen til at studere makrofager rolle under anastomose mellem spirer eller overholdelse af pericytes efter kapillær dannelse. Det er også muligt at kultur forskellige andre celletyper inden for eller mod en ekstracellulær matrix (f. eks. har vi vist kulturen af neuroner og forskellige epiteliale strukturer såsom proksimale tubuler og små tarme), som kan kombineres med den vaskulære senge genereret ved hjælp af denne metode. Endelig vil det være interessant at studere angiogen spiring i syntetiske hydrogels, som deres definerede sammensætning yderligere øger standardiseringen af analysen og tillader tuning af stivhed og bindende motiver, der påvirker celle-matrix interaktioner.
Afslutningsvis, denne metode viser gennemførligheden af iPSC-afledte ECs i en standardiseret og skalerbar 3D angiogen analyse, der kombinerer fysiologiske relevante kulturforhold i en platform, der har den nødvendige robusthed og skalerbarhed, der skal integreres i lægemiddel screening infrastrukturen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes delvis af et forskningsstipendium fra “Meer Kennis met minder Dieren”-programmet (projektnummer 114022501) fra den nederlandske organisation for sundhed, forskning og udvikling (ZonMw) og den hollandske Heart Foundation CVON Consortium Grant Tilslut.
0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
Basal culture medium | NCardia | ||
Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
dPBS | Gibco | 14190-094 | |
Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
HBSS | Gibco | 14025-050 | |
Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |