Summary
在这里, 我们提出了一个 eCLIP 协议, 以确定主要的 RBP 候选在睾丸的 rna 目标。
Abstract
精子发生定义了哺乳动物雄性生殖细胞分化的高度有序过程。在睾丸中, 转录和翻译是不耦合的, 这突出了限制性商业惯例组织的转录后基因表达调控的重要性。为了阐明 RBP 的机械作用, 可以使用交联免疫沉淀 (CLIP) 方法来捕获其内源性直接 RNA 靶点并定义实际的相互作用位点。增强的 CLIP (eCLIP) 是一种新开发的方法, 与传统的 Clip 相比具有多种优势。然而, 到目前为止, 电子浓缩公司的使用仅限于细胞系, 这就需要扩展应用程序。在这里, 我们使用 eCLIP 在鼠标睾丸中研究 MOV10 和 MOV10L1 这两个已知的 rna 结合螺旋。正如预期的那样, 我们发现 MOV10 主要与3个未翻译的 mRNA 区域 (Ucr) 结合, MOV10L1 有选择地与 piRNA 相互作用的 RNA (piRNA) 前体转录结合。我们的 eCLIP 方法允许通过对亚克隆进行小规模测序, 从而提供合格的库, 快速确定受各种限制性商业惯例约束的主要 RNA 物种, 作为进行深度测序的理由。本研究为哺乳动物睾丸的电子规则规则制定了适用的依据。
Introduction
哺乳动物睾丸代表了一个很好的发展模型, 其中一个复杂的细胞分化计划循环运行, 以产生大量的精子。这种模型的一个独特价值在于在精子发生的某些阶段出现转录失活, 通常是在减数分裂性染色体失活 (msci) 发生1,2和圆形精子细胞发生时精子发生时的强烈核压实3。这些连续的转录事件需要转录后基因调控, 其中 rna 结合蛋白 (Rpp) 发挥着至关重要的作用, 塑造转录组和保持男性生育能力。
为了识别个体 rbp 在体内的真正 rna 靶点, 在常规 rna 免疫沉淀 (rip) 6, 7 的基础上, 开发了4,5 交联免疫沉淀 (clip)方法., 通过采用包括紫外线 (UV) 交联、严格清洗和凝胶转移在内的关键步骤, 提高信号特异性。利用 CLIP 与高通量测序相结合的先进应用引起了人们对在全基因组范围内的蛋白质-rna 相互作用进行分析的极大兴趣。除了对 RBP 功能的遗传研究外, 这种确定内源性蛋白质和 RNA 直接相互作用的生化方法对于准确阐明限制性商业惯例的 RNA 调控作用是不可或缺的。例如, MOV10L1 是男性生育能力和 piRNA 相互作用的 RNA (piRNA) 生物发生所需的一种睾丸特异性 RNA 螺旋酶9。它的类似的 mov10 被称为一个无处不在的表达和多功能 rna 螺旋酶, 在 rna 生物学的多个方面的作用10,11,12, 13,14,15,16,17,18. 通过使用传统的 clip-seq, 我们发现 mov10l1 结合和调节初级 pirna 前体, 以启动早期 pirna 处理19,20, 并且 mov10 结合 mrna 3 ' ucr 和非编码 rna在睾丸生殖细胞中的物种 (未显示数据)。
然而, CLIP 最初是一个费力的放射性程序, 然后对库的准备进行排序, 并显著丢失了 CLIP 标签。在传统的 CLIP 中, 使用在两个 RNA 末端结扎的适配器制备 cDNA 文库。蛋白质消化后, 交联的短肽仍附着在 RNA 片段上。这种交联标记部分阻断了 cdna 合成过程中逆转录酶 (rtase) 的进展, 导致约占 cdna 文库21,22的80% 的 cdna 被截断。因此, 只有 RTase 产生的绕过交联位点 (读通) 的 cDNA 片段才会被测序。最近, 各种 CLIP 方法 (如 PAR-CLIP、iCLIP、eCLIP 和 uvCLAP) 被用来识别活细胞中限制性商业惯例的交联位点。PAR-CLIP 涉及365纳米紫外线辐射和光可激活核苷酸类似物的应用, 因此仅适用于培养中的活细胞, 将核苷类似物纳入新合成的转录中容易产生偏差rna 与 23,24蛋白的物理相互作用。在 iCLIP 中, 只有一个适配器连接到交联 RNA 片段的 3个 ' 末端。逆转录酶 (rt) 后, 通过细胞内循环和再线性化获得截断和读通 cDNAs, 然后进行聚合酶链反应 (pcr) 扩增 25,26.然而, 分子内循环的效率相对较低。尽管较旧的 CLIP 协议需要用放射性同位素标记交联 RNA, 但紫外线交联和亲和力纯化 (uvCLAP), 以及严格的串联亲和力纯化过程, 并不依赖于放射性27。然而, uvCLAP 仅限于培养的细胞, 必须通过带有 3x FLAG-HBH 标记的表达载体转染, 以便进行串联亲和力纯化。
在 eCLIP 中, 适配器首先在 RNA 的 3 ' 末端连接, 然后是 rt, 然后在分子间模式下的 3个 cDNAs 极点进行结扎。因此, eCLIP 能够捕获所有截断和读取的 cDNA28。此外, 它既不限于放射性标记, 也不限于根据其原理使用细胞系, 同时保持单核苷酸分辨率。
在这里, 我们提供了适用于鼠标睾丸的 eCLIP 协议的分步说明。简单地说, 该 eCLIP 协议从睾丸小管的紫外线交联开始, 然后使用蛋白质特异性抗体进行部分 RNase 消化和免疫沉淀。接下来, 蛋白质结合 rna 被脱磷酸化, 适配器连接到它的 3 ' 末端。在蛋白质凝胶电泳和凝胶-膜转移后, RNA 通过切割预期大小范围的膜面积进行分离。RT 后, DNA 适配器连接到 cDNA 的 3 ' 端, 然后进行 PCR 扩增。在高通量测序之前对子克隆进行筛选, 作为图书馆的质量控制。该协议能够有效地识别限制性商业惯例的蛋白质结合 RNA 的主要物种, 例如两个表达睾丸的 RNA 螺旋酶 MOV10L1 和 MOV10。
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Protocol
所有进行的动物实验都得到了南京医科大学委员会的批准。雄性 c57bl6 小鼠在光周期条件下保存, 并提供食物和水。
1. 组织收集和紫外线交联
- 使用二氧化碳 (CO2) 对2只成年小鼠进行安乐死1-2分钟或直到呼吸停止。接下来, 对每只老鼠进行颈椎脱位。
- 在每个免疫沉淀实验中, 从适当年龄的小鼠 (本研究中的一个成体睾丸) 中提取约100毫克的睾丸, 并将组织放入冰凉磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。
- 用一对细尖的推子轻轻取出。
- 在组织磨床中加入3毫升的冰凉 PBS, 并使用宽松的玻璃牙柱 (A 型玻璃牙柱) 用轻微的机械力对组织进行三重处理。
请注意:这一步的目的不是裂解细胞, 而是将组织分开。保持细胞的活力和完整性是很重要的。 - 将组织悬浮液转移到细胞培养盘 (直径10厘米), 并添加冰凉 PBS 高达6毫升。
- 快速摇晃盘子, 使液体均匀地覆盖盘底。如果组织是适当的地面, 均匀分布的精原体小管将是可见的, 而组织团块的存在表明组织分散是次优的。
- 在冰上的254纳米上, 用 400 mjcm 2 交叉悬浮液三次。在每次辐照之间混合悬浮液。
请注意:对于每一个新的实验, 交联应进行优化。 - 在4°C 下, 以 1200 x g 的速度将悬浮液收集在 15 毫升锥形管和颗粒中5分钟。取出上清液, 重新悬浮 PBS 1 毫升中的颗粒, 然后将悬浮液转移到 1.5 mL 离心管中。在4°c 和 1, 000 x g下旋转 2分钟, 并去除上清液。
- 此时, 立即进行协议的其余部分, 或将颗粒冻结在液氮中, 并在-80°c 下储存, 直到使用。
2. 珠子准备
- 在新鲜的离心管中加入125Μl 的蛋白质每个样品 (颗粒) 的磁珠。
请注意:使用蛋白质 G 磁珠进行小鼠抗体。 - 将管子放在磁铁上, 将珠子与溶液分离。10秒后, 取出上清液。用1毫升的冰凉裂解缓冲液清洗珠子两次。
请注意:随后分离的蛋白质 A 磁珠遵循这一步骤。裂解缓冲液组成为 50 mM Tris-HCl, pH 7.5;100 mM 氯化钠;1% NP-40;0.1% 的战略部署储存;0.5% 脱氧胆酸钠;半乙二胺四乙酸 (EDTA) 不含蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (添加新鲜)。 - 用 10μg eclip 抗体在100μl 的冷裂解缓冲液中重新扫描珠子。在室温下旋转管45分钟。
请注意:免疫沉淀的最终抗体浓度为10μgml。如果抗体浓度未知, 应优化抗体的数量。 - 用1毫升的冰凉裂解缓冲液清洗珠子两次。
3. 组织裂解和部分 RNA 消化
-
在1毫升的冷裂解缓冲液中再移植组织颗粒 (在裂解缓冲液1毫升中加入22Μl 的 50x (EDTA) 无蛋白质抑制剂鸡尾酒和11μl 的 RNase 抑制剂)。
- 每组实验重新拔插 2个 uv 交联颗粒和2个非交联颗粒: 用于 Ecip 库 (UV-1) 的 uv 交联-1 颗粒;用于 eCLIP 库的 uv 交联2颗粒 (UV-2);用于作为控件的 eCLIP 库的非交联1颗粒 (非 uv);非交联2颗粒的 IgG ip, 以证明抗体的特异性。
注: uv 交联宽型睾丸的 Ecip 库的理想控制是来自同一垃圾小鼠的 uv 交联敲除试验。
- 每组实验重新拔插 2个 uv 交联颗粒和2个非交联颗粒: 用于 Ecip 库 (UV-1) 的 uv 交联-1 颗粒;用于 eCLIP 库的 uv 交联2颗粒 (UV-2);用于作为控件的 eCLIP 库的非交联1颗粒 (非 uv);非交联2颗粒的 IgG ip, 以证明抗体的特异性。
- 在冰上对样品进行15分钟的裂解 (以防止蛋白质和 RNA 的降解)。
- 在数字声纳中使用超声, 以10% 的振幅 5分钟, 30秒/30秒关闭。始终将样品放在冰上, 并在每个样品之间用无核酸水清洁探头。
- 在每个管中加入4μl 的 DNase, 搅拌均匀。在37°c 下孵化 10分钟, 在1200转/分处晃动。
- 加入10Μl 稀释的 RNase i (4 uμl RNase i 在 PBS 中), 并充分混合。在37°c 下孵化 5分钟, 在1200转/分处晃动。
- 以 15, 000 x g离心清除裂解液, 时间为 20分钟 (4°c)。
- 小心收集上清液。留下50Μl 的裂解液, 并将颗粒与它一起丢弃。
- 将输入样本另存为rwb (为西部印迹运行) 和rri (为 rna 隔离而运行)。节省 20μl (2%)UV-1、UV-2、非 uv 和 IgG 样品作为 RWB 凝胶负载的输入。节省 20μl (2%)UV-1 或 UV-2 样品作为 RRI 凝胶负载的输入。
4. 免疫沉淀
- 在珠子 (第2节中准备) 中加入1毫升的裂解液 (从3.7 步开始), 并在4°c 下旋转样品2小时或一夜。
- 用磁性支架收集珠子, 丢弃上清液。用900μl 的高盐缓冲液清洗珠子两次 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M 氯化钠; 1 mM EDTA; 1% np-40; 0.1% SDS; 0.5% 脱氧胆酸钠), 然后用900μl 洗涤缓冲液清洗珠子两次 (20 mM Tris-HCl, 7.5; 10 mM cl2; 0.2% Tween-20)。
请注意:对于 IgG 示例, 请在此处暂停该过程, 并将其存储在洗涤缓冲液中的冰上。 - 用500μl 的1X 脱磷酸化缓冲液清洗一次珠子 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 5 mM Mgmcl 2; 100 mm kcl; 0.02% triton x-100)。
5. RNA 3 ' 结束时的去磷酸化
- 用磁性支架收集珠子, 丢弃上清液。使用精细的移液器吸头去除残留液体。加入100μl 脱磷酸化主混合物 (10Μl 的10倍脱磷酸化缓冲液 [100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 50 mM MgCl2; 1 m kcl; 0.2% triton X-100; 1Mg/ml 牛血清白蛋白 (bsa)]; 78μl 无核水; 2 微米 rase 抑制剂; 2μl DNase; 8μl(kaline 磷酸酶), 并在37°c 下孵育 15分钟, 在1200转/分的情况下晃动。
- 加入300Μl 多核苷酸激酶 (PNK) 主混合物 (50μl 的 5x PNK pH 6.5 缓冲液 [350 mM Tris-HCl, pH 值 6.5; 50 mM MgCl2]; 223Μl 无核酸酶水; 5Μl rnase 抑制剂; 2μl DNASE; 7μl pnk 酶; 3μl 0.1 m 二硫醇), 在37°c 下孵育 20分钟, 在1200转/分处晃动。
- 用磁性支架收集珠子, 丢弃上清液。用500μl 的冷洗缓冲液清洗珠子一次。然后用500μl 的冷高盐缓冲液清洗珠子一次。按照此顺序再次重复这些清洗。
- 用500μl 的冷洗缓冲液清洗珠子一次, 然后用300μl 的冷1x 结扎缓冲液清洗两次 (无二硫代三醇, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM MgCl2)。
6. RNA 适配器连接到 RNA 3 ' 结束
- 丢弃上清液, 用精细的移液器吸头去除残留液体。在每个样品中加入25Μl 的 3 ' 结扎主混合物。通过移液仔细混合。这一步容易产生气泡。
请注意:结扎主混合含有3Μl 的10倍结扎缓冲液 [500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 mM MgCl2];9μl 无核酸水;0.4Μl 的 RNase 抑制剂;0.3μl 的 0.1 m ATP;0.8 微米的二甲基亚硫酸 (DMSO);9μl 的50% 聚乙二醇 (PEG) 8000;2.5μl rna 连接酶 [30 ueμl]。 - 在每个样品中加入 2.5μl rna 适配器 X1B (表 1) 和 2.5μl rna 适配器 X1b (表 1)。通过移液或闪烁仔细混合, 在25°c 下孵育 75分钟, 每10分钟闪烁一次。
- 用500μl 的冷洗缓冲液清洗珠子一次 (在此恢复 IgG 样品)。
- 用500μl 的冷高盐缓冲液清洗珠子一次, 然后用500μl 冷洗缓冲液清洗珠子。再次重复这些清洗。
- 磁性分离珠子, 用精细的移液器吸头去除残留的液体。
- 将珠子重新放在100μl 的冷洗缓冲液中 (暂停这里的 IgG 样品, 并将其储存在洗涤缓冲液中的冰上)。将20μl 移动到新管作为 RWB 样品。磁性地将剩余的80Μl 作为 RRI 样品分离。取出 RRI 样品的上清液, 并在20μl 的洗涤缓冲液中重新悬浮珠子。
- 在 IgG 样品中加入37.5μl 的4x 硫酸锂 (LDS) 样品缓冲液和15μl 的10倍样品还原剂。在 (剩余) 样品中加入7.5Μl 的 4倍 LDS 样品缓冲液和3倍的10倍样品还原剂。(不要通过移液混合)。在70°c 下孵化 10分钟, 在1200转/分处晃动。在冰上冷却 1分钟, 离心机在4°C 下以 1, 000 x克冷却1分钟。
7. SDS-PAGE 和膜转移
-
装上凝胶。
- 对于 RRI 凝胶 (4-12 Bis-Tris 蛋白凝胶, 10 井, 1.5 mm) 放置管在磁铁和分离的蛋白质洗脱从珠子。每个井可装入30μl 的样品。样品由预先染色的蛋白质大小标记间隔。
- 对于 RWB 凝胶 (4-12 Bis-Tris 蛋白凝胶, 10 井, 1.5 mm) 放置管在磁铁和分离的蛋白质洗脱从珠子。每口井可装入15μl 的样品。将剩余样品保存在-20°C 的备份中。
- 在 1x SDS 运行缓冲液的500ml 中加入500μl 抗氧化剂。在 1x SDS 中以 200 V 的速度运行, 运行缓冲液50分钟或直到染料前部位于底部。
请注意:抗氧化剂含有 N, n-二甲基甲酰胺, 亚硫酸钠, 它与减少的蛋白质迁移, 以防止敏感氨基酸, 如蛋氨酸和色氨酸的再氧化。 - 在1% 甲醇 (vol/vol) 的1xtransfer 缓冲液中, 将蛋白质-rna 复合物从凝胶转移到 10 V 时的硝化纤维素膜上70分钟。用冷 PBS 冲洗 RRI 膜, 用塑料包装, 并存放在-80°c。
- 在室温下将 RWB 膜在 TBST 5% 的牛奶中堵塞 1小时, 在 TBST 中冲洗膜。在4°c 条件下, 用原代抗体在 TBST 中隔夜孵化。在室温下, 用 TBST 用 tbst (1:5000 hrp 山羊抗兔 IgG) 进行两次清洗 5分钟, 用 TBST 清洗 3次, 分别为5分钟、10分钟和15分钟。
- 将等量的电化学发光 (ECL) 缓冲液 A 和缓冲 B 混合, 加入膜并孵育 1分钟, 用塑料包装覆盖膜, 并在室温下将其暴露在 x 射线胶片上2-3分钟。然后开发这部电影。
请注意:过度曝光的薄膜将清楚地显示膜边缘的形状, 通过这种形状, 薄膜可以与 RWB 膜对齐。然后, 根据标记中标记的位置对齐 RWB 和 RRI 膜。从下到上按顺序排列的是薄膜、RWB 膜和 RRI 膜的顺序。
8. RNA 分离
- 使用 RWB 膜和薄膜作为指南, 将该区域从蛋白质带切割成 75 kDa (约220分 RNA)。
请注意:由于受蛋白质保护的 RNA 分子的最大长度可能为225个碱基, 每个碱基约为 340 da, 因此合理地将该区域切割到 RBP 波段上方约 75 kDa, 以检索所有蛋白质-rna 复合物。 - 将切除的膜切成几片, 放入新鲜 1.5 mL 离心管中。加入200Μl 蛋白酶 K (PK) 缓冲液 (100 mM Tris-HCl ph 7.5; 50 mM Ncl; 10 mM EDTA), 并在膜上加入40Μl 的 PK。在37°c 下混合孵育 20分钟, 在1200转/分的情况下晃动。
- 在每个样品中加入200Μl 的 PK 尿素缓冲液 (100 毫米弗里斯-h科尔 ph 值 7.4; 50 毫米氯化钠; 10 毫米 EDTA; 7 M 尿素)。在37°c 下孵化 20分钟, 在1200转/分处晃动。
- 加入400Μl 酸性酚-氯甲胺醇 (25:24/1), 在37°c 下搅拌均匀, 孵育 5分钟, 摇摇 1, 200 转/分。
- 将2毫升锁相凝胶 (PLG) 重管放入离心机中, 以 15, 000 x g 旋转25秒。
- 将除膜切片以外的所有内容物转移到 PLG 重管中。在37°c 下孵化 5分钟, 在1200转/分处晃动。
- 在室温下旋转, 15, 000 x克, 15分钟. 将水层转移到一个新的15毫升锥形管中。
-
使用 RNA 纯化和浓度柱提取 RNA。
- 在每个样品中添加 2个 RNA 结合缓冲液 (800μl) (从步骤8.7 开始) 并混合。加入相同体积 (1200μl) 的100% 乙醇和混合。
- 将750微米的样品 (从步骤 8.8.1) 转移到收集管中的 RNA 纯化和浓缩柱, 并以 15, 000 x克g 的速度移植到离心机中, 以 30 x g 的速度进行。
- 重复步骤 8.8.2, 直到所有示例都通过列。在色谱柱上加入400Μl 的 RNA 准备缓冲液, 离心机在 15, 000 x 克的地方添加 30 s. 丢弃流动, 用700升的 rna 洗涤缓冲液, 并以 15, 000 x克的速度将色谱柱离心 30 s。
- 在色谱柱和离心机中加入 400μl rna 洗涤缓冲液, 以 15, 000 x g的速度, 将色谱柱小心地转移到一个新的 1.5 ml 管中。在柱状基质中加入10Μl 无核酸酶水, 让它坐 2分钟, 并以 15, 000 x克的速度离心器 30 s. 将 eclip 样品储存在-80°c, 直到 rt (步骤 11.1)。
9. 输入 RNA 3 ' 端的去磷酸化
- 加入15μl 脱磷酸化主混合物 (10倍脱磷酸化缓冲液的 2.5Μl [100 mM Tris-HCl, pH 值 8.0; 50 Mm MgCl2; 1 m kcl; 0.2% triton x-100; 1 MGML bsa]; 9.5 μl 无核酸酶水; 0.5Μl rnase 抑制剂; 2.5μl 碱性磷酸酶) 至10Μl输入样本 (从步骤 8.8.4)。在37°c 下孵化 15分钟, 在1200转/分处晃动。
- 加入75μl 的 PNK 主混料 (20μl 的 5x PNK ph 6.5 缓冲液 [350 mM Tris-HCl, pH 值 6.5; 50 mM MgCl2]; 44μl 无核酸酶水; 1Μl rnase 抑制剂; 2Μl 的 DNASE; 7μl 的 pnk 酶; 1μl 0.1 m 二硫醇)。在37°c 下孵化 20分钟, 在1200转/分处晃动。
-
输入 RNA 的清理
- 在小瓶中提取磁性珠 (涡流超过 30秒)。添加20Μl 的核酸提取磁珠的每个样品到新的管。用磁性支架收集珠子, 丢弃上清液。
- 用1毫升 RNA 纯化裂解缓冲液 (RLT 缓冲液) 清洗珠子一次。将管子放在一块30的磁铁上, 并丢弃上清液。
请注意:随后分离核酸提取磁珠遵循这一步骤。 - 用300μl 的 RLT 缓冲液重新扫描珠子, 并将其添加到样品中。加入10Μl 的 5 m 氯化钠和615μl 的100% 乙醇 (EtOH), 并通过移液混合。在室温下旋转 15分钟. 磁性地分离珠子并去除上清液。
- 在 75% EtOH 的1毫升中重新扫描珠子, 并转移到新的试管中。30秒后, 用磁性支架收集珠子, 丢弃上清液。用 75% EtOH 清洗两次, 磁性地分离珠子, 用精细的移液器吸头丢弃残留的液体。空气干燥 5分钟 (避免过度干燥)。
- 用10μl 的无核酸酶水将珠子重新送入, 孵育 5分钟. 磁分离珠子, 并将5Μl 上清液移动到新的管中 (下面为 3 ' 适配器结扎)。剩余的 RNA 可以存储在-80°c 作为备份。
10. RNA 适配器连接到输入 RNA 3 ' 结束
- 加入1.5Μl 的 DMSO 和0.5Μl 的 ril19 适配器 (表 1) 到5μl 的输入 rna (从步骤 9.3.5), 在65°c 孵育 2分钟, 并放置在冰上1分钟以上. 在每个样品中加入13.5 微米的 3 ' 结扎主混合物, 通过移液混合, 在25°c 下孵育 75分钟, 每15分钟闪烁一次。
请注意:结扎主混合物含有2μl 的10倍结扎缓冲液 [500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 mM MgCl 2; 10mm 二硫醇];1.5 微米无核酸水;0.2Μl 的 RNase 抑制剂;0.2μl 的 0.1 m ATP;0.3Μl 的 DMSO;8μl 的 50% PEG8000;1.3 微米 rna 连接酶 [30 ueμl]。 -
结扎输入 RNA 的清理
- 磁分离20Μl 核酸, 为每个样品提取磁珠, 并去除上清液。用1毫升的 RLT 缓冲液清洗珠子一次。
- 在61.6μl 的 RLT 缓冲液中重新扫描珠子, 并将悬浮液转移到每个样品中。加入61.6μl 的 100% etoh。使用移液器每5分钟混合 15分钟, 磁分离珠子, 并去除上清液。
- 重复步骤9.3.4。
- 用10μl 的无核酸酶水重新扫描珠子, 让它坐 5分钟, 磁性地将珠子分开, 并将上清液的10Μl 转移到新的管中。
请注意:这是一个可能的停止点 (输入样本可以存储在-80°c, 直到第二天)。
11. 反向转录, DNA 适配器结扎到 cDNA 3 ' 结束
- 将0.5Μl 的 RT 引物 (表 1) 加入10μl 的输入 rna (从步骤 10.2.4) 和10ΜL 的 LIP rna (从步骤 8.8.4) 中, 在65°c 的预热 PCR 块中孵育 2分钟, 放在冰上1分钟以上。
- 加入10μl 的 RT 主混料 (2μl rt 缓冲液 [500 mM Tris-HCl, pH 值 8.3; 750 mM kcl; 30 mM MgCl 2]; 4Μl 无核酸酶抑制剂; 0.3Μl rnase 抑制剂; 2μl 0.1 m dithio复合醇; 0.2μl 0.1 m datp; 0.2Μl 0.1 m dctp; 0.2 μl 0.1 m dCTP; 0.2 μL 的 0.1 m dctp; 0.2 μl 的无核酸酶抑制剂; 0.2μl0.1 m dGTP;0.2μl 为 0.1 M dTTP;将逆转录酶 0.9Μl) 混合, 在55°c 下在预热的 PCR 块上孵育45分钟。
- 将 RT 反应产物20Μl 与 3.5μl PCR 产品的清洁试剂混合。在37°c 下孵化15分钟。
- 加入 1μl 0.5 M EDTA, 通过移液混合。加入3Μl 的 1 m NaOH, 通过移液混合, 在70°c 的 PCR 块上孵育 12分钟, 水解模板 RNA。
- 加入3Μl 的 1 m HCl, 将移液剂混合, 以中和缓冲液。
-
CDNA 的清理
- 磁分离10Μl 的核酸提取磁珠为每个样品, 去除上清液。用500μl 的 RLT 缓冲液清洗一次。
- 在93μl 的 RLT 缓冲液中重新悬浮珠子, 并将悬浮液转移到样品中。加入111.6μl 的 100% etoh, 孵育 5分钟, 每2分钟混合一次移液器, 用磁支架收集珠子, 丢弃上清液。用 80% etoh 的1毫升重新扫描珠子, 并移动到一个新的管。
- 30秒后, 用磁性支架收集珠子, 丢弃上清液。用 80% EtOH 清洗两次。磁性分离并丢弃有细尖端的残留液体。空气干燥 5分钟 (避免过度干燥)。在5μl 的 5mm Tris-HCl 中重新扫描珠子, 并孵育5分钟。
- 在珠子中加入0.8Μl 的 DNA 适配器 (表 1) 和1ΜL 的 dmso, 在75°c 下孵育2分钟。在冰上放置1分钟以上。
- 制备12.8μl 结扎主混合物 (2Μl 的10倍结扎缓冲液 [500 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mm 二硫醇]; 1.1μl 无核酸酶 atp; 0.2μl 0.1 m atp; 9μl 为 50% PEG8000; 0.5Μl rna 链酶 [30 uμl]), 轻拍混合, 在离心机中短暂旋转, 并将其添加到每个样品中, 用移液器尖端慢慢搅拌样品。
- 在每个样品中加入另外1μl 的 RNA 连接酶 [30 ueμl], 然后轻拍混合。在25°c 下孵化 30秒, 在1200转/分处晃动。在25°c 下过夜。轻触可轻轻混合5至 6次, 每小时一次。
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结扎 cDNA 的清理
- 磁性分离5Μl 的核酸, 为每个样品提取磁珠, 并去除上清液。
- 用 500μl RLT 缓冲液清洗一次。
- 将磁珠重新悬浮到60μl 的 RLT 缓冲液中, 并将悬浮液转移到每个样品中。加入60Μl 的 100% etoh, 孵育 5分钟, 每2分钟混合一次. 磁分离, 丢弃上清液。
- 重复步骤9.3.4。
- 用27μl 的 10 Mm Tris-HCl 重新扫描珠子, 将其孵育 5分钟, 磁分离, 并将25μl 的样品移动到新的管中。在新管中用9μl 的无核水稀释1Μl 的结扎 cDNA。将剩余样品存放在-20°c, 直到步骤13.1。
12. 利用实时定量 PCR (qPCR) 定量 cDNA
- 在96井 qPCR 板上加入9μl 的 qPCR 主混料 (2x 主混料 5μl; 无核酸水 3.6μl; 0.4μl 引物混合物 [10μm PCR-F-D50X 和 10μm Pcr-r-d70x])。加入1X·10的 1:10 (h2o) cDNA (从步骤 11.10.5), 密封和混合.
- 在热环器中运行 qPCR 程序: 50°c 时 2分钟;95°c 时 2分钟;在95°c 下为 3秒, 在68°c 时为 30秒, 在40次循环中;95°c 时 15秒, 68°c 时 15秒, 95°c 时 15秒, 1个周期15秒。注意 Ct (周期阈值) 值。
13. cdna 的 PCR 扩增
- 将35μl 的 PCR 主混料 (2X PCR 主混合 25μl; 无核酸水 5Μl; 5Μl 引物混合物 [20μm PCR-F-D50X 和 20Μm PCR-R-D70X]) 分配到8孔条带中。对于 CLIP 组, 加入12.2μl 的 CLIP 样品 + 2.5μl 的h2o;对于输入组, 加入10μl 的输入 + 5μl 的 h2o. 在离心机中混合均匀, 并短暂旋转.
- 在98°c 下运行 PCR 程序: 30秒;在98°c 时 15秒, 68°c 时 15秒, 62°c 时 30秒, 72°c 时 30秒;在98°c 时 15秒, 在72°c 时为 60秒, n 周期为 (qPCR Ct 值-3)-6;72°C 时 60秒;4°c 保持。
请注意:最好对前一对 Clip 执行1到2个额外的 PCR 周期。
14. 凝胶纯化
- 在3% 高分辨率琼脂糖凝胶上加载样品。在样品之间留下1个空井, 并在凝胶两侧使用梯子。在1x 里斯-波拉特-edta (TBE) 缓冲液中以 100 V 运行75分钟。
-
在蓝光照明下, 使用新鲜剃须刀片为每个样品切割 175-350 bp 的凝胶片。将它们放入15毫升的锥形管中。
- 称量凝胶片, 用凝胶提取试剂盒将凝胶洗净。
- 加入6x 体积凝胶溶解缓冲液, 以熔化凝胶 (100 毫克凝胶 = 600μl 的凝胶溶解缓冲液)。在室温下溶解凝胶。(摇匀每15分钟混合一次, 直到凝胶片完全溶解)。加入1凝胶体积100% 异丙醇, 搅拌均匀。
- 以 17, 900 x 克的速度将750微米的样品 (从步骤 14.2.2) 转移到收集管和离心机中的色谱柱, 时间为1分钟。
- 重复步骤14.2.3 直到所有样品通过色谱柱, 用500μl 的凝胶溶解缓冲液清洗一次。
- 在柱和离心机中加入750微米的洗涤缓冲液 (从凝胶提取试剂盒), 以 17, 900 x g 的速度进行 1分钟. 丢弃流经, 以 17, 900 x克的速度旋转 2分钟. 将色谱柱放入新的 1.5 ml 管中。
- 从柱的塑料紫色边缘取出所有剩余的洗涤缓冲液。空气干燥 2分钟, 在膜中央加入12.2Μl 的无核酸酶水。让色谱柱在室温下站立 2分钟, 在 17, 900 x克旋转 1分钟 (为了提高产量, 重复洗脱步骤)。
15. PCR 产品的 TOPO 克隆
- 制备 TOPO 克隆反应混合物 (从步骤14.2.6 的 PCR 产物为 1Μl; 克隆混合物为 1μl; 无菌水为 3μl)。在20-37°c 下轻轻混合, 孵育5分钟。在冰上凉快。
- 在冰上解冻具有化学能力的大肠杆菌。将5微米的 TOPO 克隆产品添加到100μl 的合格细菌29中。轻轻混合好。在冰上孵化30分钟。
- 42°c 时的热冲击为60秒。然后在冰上冷却 2分钟, 加入900μl 的溶酶汤 (LB) 培养基, 在37°c 孵育 1小时, 在225转/分晃动。以 1, 000 x克的速度旋转 1分钟, 然后去除900μl 的上清液。重新填充解决方案的其余部分。
- 将转化后的细菌放入含有氨匹西林 (100μgml) 的 1.5% lb 琼脂板上, 并在37°c 下孵育过夜。
- 为每个结构准备至少 20 1.5 mL 的离心管。在一组中加入含有100μgml 氨匹西林的 LB 介质500μl。使用无菌移液器尖端随机划掉一个细菌菌落, 并与500μl 的 LB 培养基混合 (通过移液)。在37°c 下孵化 5小时, 在225转/分晃动。
- 用 M13 反向引物对插入片段进行排序: 用 Sanger 测序30对插入片段进行排序。
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Representative Results
Eclip 过程和结果如图 1、 图 2、 图 3、 图 4所示。用二氧化碳对小鼠进行安乐死, 用手术剪刀在下腹部做了一个小切口 (图 2a,b)。鼠标睾丸研磨后被切除、失谐, 然后 uv 交联 (图 2c-i)。图 3和图 4显示了在睾丸组织中使用两个已知 rna 结合螺旋的代表性 eclip 结果。我们在成年野生小鼠睾丸中进行了 MOV10 eCLIP, 普通浓度为 40 U\ l RNase i 治疗交联裂解液。图 3A的顶部面板显示, 目标蛋白大小约 114 kda 被成功地丰富。在 eCLIP 过程中, 用 RNASE i 的两种浓度 (5 或 40 U/mL) 进行了免疫沉淀的 MOV10L1 蛋白的西方印迹 (图 3a)。图 3B显示 qPCR 使用了来自 MOV10 和 MOV10L1 uv 交联、非交联和配对大小匹配输入 (sminput) 样本的 1:10 稀释 Cdna (已经与 dna 适配器连接)。非交联样本显示 RNA 恢复减少。我们观察到, 非交联组的 Ct 值一般是 uv 交联组的5倍。图 4A显示了通过琼脂糖凝胶电泳 (切割 175-350 bp) 进行 PCR 扩增和大小选择。Primer-dimer 产品出现在 140 bp 左右. 图 4b 显示了两个具有代表性的子克隆序列的 ucsc 基因组浏览器视图。在 FTO 基因的3 ' utr 内发现了具有 Mv10 的 eclip 标记;3 ' UTR 目标的大约速率为 75% (图 4c), 与 HEK293 单元10和睾丸中的大多数 mov10 目标一致 (未显示数据)。相反, 发现 MOV10L1 绑定的 eCLIP 标记位于 piRNA 群集中, 表明 MOV10L1 的目标是 piRNA 前体。PiRNA 前体目标的近似速率为 42% (图 4e), 这反映了我们以前常规 clip 实验20的趋势。具有 40 uml rnase i 消化的 MOV10L1 eCLIP 产生相对较多的序列, 小于 20 bp (图 4d)。
图 1: 电子规则夹的原理图表示.紫外交联小鼠精管 (步骤 1) 在 eCLIP 裂解缓冲液中裂解并超声 (步骤 2)。溶酶体用 RNase i 进行分解 RNA, 之后使用抗 rbp 抗体 (步骤 3-4) 进行免疫沉淀。对 RNA 片段进行去磷酸化, 对 3 ' RNA 适配器进行结扎 (步骤 5-6)。蛋白质-rna 复合物在 SDS-PAGE 凝胶上运行, 并转移到硝化纤维素膜 (步骤 7)。RNA 是通过消化蛋白质与蛋白酶 K 和尿素, 留下一个短的多肽留在交联位点从膜中恢复。对输入样品的 RNA 片段进行去磷酸化, 对 3 ' RNA 适配器进行结扎 (第8步)。执行 RNA RNA rna 和 3 ' DNA 适配器结扎 (第9-10 步)。执行 cDNA 文库的 PCR 扩增、凝胶提取和钝端 PCR 克隆, 以进行初步的库质量控制 (步骤 11)。最后, 执行高通量排序 (步骤 12)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 睾丸组织采集和紫外线交联.(A) 暴露小鼠腹部。(B) 腹壁有0.5 厘米的切口, 露出腹膜。(C) 通过拔出脂肪垫, 取出一对睾丸。(D) 切除睾丸组织, 并将其放入含有冰凉 pbs 的小菜中。(E) 轻轻取出。(F) 按下松动的子, 在组织磨床的凹槽中试穿组织。(G) 在10厘米的板中分布生精小管。(H) uv 交联, 具有 400 mjcm 2 能量.(I) 交联样品以1.5 毫升离心管收集。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: Mov10 和 MOV10L1 电子贴会的代表性结果.(A) 西方印迹验证 mov10 和 MOV10L1 免疫沉淀法。(B) qpcr 在 1:10 稀释的 EMV10 和 MOV10L1 的 eclip 库, 具有紫外线、非紫外线和配对 sminput 样本的复制。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 电子数据系列图书馆的准备和质量评估.(A) 显示 PCR 扩增的凝胶图像。星号表示底漆二聚体。红色虚线表示用于 cDNA pcr 产物的区域, 大约在175到 350 bp (b) 之间的 ucsc 基因组浏览器视图中的两个代表性的子克隆序列31。(C) mov10 的小规模子克隆测序分析。(D) mov10l1 绑定标记在通过两种不同的 RNase 浓度处理时显示不同的长度分布模式。(E) MOV10L1 的小规模子克隆测序分析。请点击这里查看此图的较大版本.
| 序列号名称 | 序列信息 | 描述 | |||||
| RNA 适配器 | |||||||
| RNA X1A | /5phosnauagnnnnnnnnagagagguguguagc/ | 库存在 200μm;在20Μm 下工作 | |||||
| RNA X1B | /5Phos/aauagcannnnnnagagagguguguagc/ | 库存在 200μm;在20Μm 下工作 | |||||
| RiL19 | /5Phose/agacagagaggugug cc3/ | 库存在 200μm;在40μm 下工作 | |||||
| 脱氧核糖核酸适配器 | |||||||
| Rand103tr3 | /5phosnnnnnnnnnnnagagagcccctg | 库存在 200μm;工作在80μm | |||||
| RT 底漆 | |||||||
| AR17 | ACACGCTCTCCGA | 库存在 200μm;在20Μm 下工作 | |||||
| PCR 引物 | |||||||
|
PCR-F-D 501 |
AATATACGCCCACCCACACTACTACTACTCCTCACCCCTCCCTCCTCCTCCTCT | 库存在 100μm;在20Μm 下工作 | |||||
| PCR-R-D 701 | CAGAGAGAGAGAGAGAGTAGGGAGGAGGGCTCGCGCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCGGCGCGCGCGCGCGC | 库存在 100μm;在20Μm 下工作 | |||||
| (见 D502-508、D702-712 的 Illumina 客户服务信) | |||||||
表 1: 适配器和引物序列.适配器包含一个在线随机生成器 (N5 或 N10), 以确定两个相同的序列读取是否指示两个唯一的 RNA 片段或相同 rna 片段的 PCR 副本。"5 phos" 代表 5 ' 磷酸化, 这是必要的, 如果寡核苷酸被用作 dna只能 rna 连接酶的底物。"3SpC3" 代表 3 ' C3 垫片, 可以防止适配器之间的结扎。
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Discussion
随着人们对限制性商业惯例在生物和病理环境中的普遍作用的日益了解, clip 方法被广泛用于揭示限制性商业惯例20、32、33、 34,35。此处描述的协议代表了 eCLIP 方法在鼠标睾丸中的一种适应应用。
在睾丸中执行 eCLIP 的一个挑战是保持新鲜睾丸细胞的活力和完整性, 这对于有效的交联也很重要。使用松散的牙槽剪断具有轻微机械力的睾丸, 可以防止细胞裂解32,36。正确消化 RNA 对于成功的 eCLIP 检测也是至关重要的。RNA 片段在消化后可以更收敛, 但长度小于 20 bp 可以通过对库的预处理来去除。为了采用理想的 RNASE 剂量的 RNase 剂量的 Rbp 候选, 我们建议一个初步测试的基础上, 克隆排序的实验库的结果, 可以准备 RNase 处理浓度范围从0你到 40 U (每毫升的裂解液)。在我们的 eCLIP 方法中, 小规模子克隆测序分析是可靠检查库质量的推荐步骤。首先, 小于 20 bp 的插入百分比不应过高, 或者, eCLIP 库的后续预处理将导致代价高昂的读取损失。其次, 应检查两个适配器正确结扎的效率。不合格的样品可以在没有深度测序的情况下消除, 以确保深度测序成功, 其结果通常需要更长的时间来分析。
尽管在小鼠睾丸中, eCLIP 的可行性仍然受到免疫沉淀步骤抗体特异性的限制, 但 eCLIP 在几个方面优于传统的 ECLIP 方法。首先, 它是一种非放射性方法。通过 eCLIP, Rpp 的 RNA 目标在体内直接捕获, 而无需使用使用放射性材料的劳动密集型技术。其次, 该方法的时间密集程度较低。通过 eCLIP 库的准备, 整个过程只需4天。第三, 序列多样性。与25-35 周期的传统统一扩增周期相比, eCLIP 指的是 Qpcr 的 ct 值, 专门设置 pcr 周期的数量。最后, 它提供了更强的信噪比。大小匹配的输入可作为真实目标的适当背景。
总之, 我们的 eCLIP 结果巩固了 MOV10 和 MOV10L1 分别对 mRNA 3 ' UTR 和 piRNA 前体具有约束力偏好的结论。我们这里描述的协议代表了 eCLIP 方法在生殖中的首次应用, 在这一领域, RNA-RBP 相互作用知识相当不足, 尽管遗传研究提供了大量关于生物作用的信息。限制性商业惯例. 此 eCLIP 协议的可视化可能有助于指导其在更广泛领域的广泛应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢埃里克 L 范诺斯特兰德和吉恩·韦奥对原始协议的有益指导。K. z. 得到了中国国家重点研发 & 项目 (2016YFA0500902, 2016YFA0500902) 和中国国家自然科学基金 (31771653) 的支持。L. y. 得到了国家自然科学基金 (81471502, 31871503) 和江苏省创新创业项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
| Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
| Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
| Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 Hz |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
| Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
| Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
| Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
| Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
| TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Reagents | |||
| Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
| AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
| Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
| DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
| DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
| ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
| Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
| FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
| LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
| MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
| MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ?; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
| MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
| NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
| NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
| Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
| Proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
| Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
| RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
| RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
| RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
| Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
| SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
| T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
| T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
| TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
| TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
| Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
| X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |
References
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