Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Summary

Este relatório descreve métodos detalhados para preparar seções congeladas do retina do rato para immunohistochemistry (IHC). Os métodos descritos incluem dissecção do copo posterior ocular, fixação paraformaldeído, incorporação em meios de temperatura de corte ideal (OCT) e orientação tecidual, corte e imunocoloração.

Abstract

A preparação de seções de alta qualidade do olho do rato para immunohistochemistry (IHC) é crítica para avaliar a estrutura e a função retinal e para determinar os mecanismos que subjacentes doenças retinal. Manter a integridade estrutural durante toda a preparação do tecido é vital para obter dados reprodutíveis de IHC retinal mas pode ser desafiante devido à fragilidade e à complexidade da Citoarquitetura retinal. Os fixadores fortes como o formalina de 10% ou a solução de Bouin preservam otimamente a estrutura retinal, impedem frequentemente a análise de IHC realçando a fluorescência do fundo e/ou as interações dediminuição do anticorpo-epítopo, um processo sabido como o mascaramento do epítopo. Os fixatives mais leves, por outro lado, como o paraformaldeído a 4%, reduzem a fluorescência de fundo e o epitope-mascaramento, técnicas de dissecção meticulosa devem ser utilizadas para preservar a estrutura retiniana. Neste artigo, nós apresentamos um método detalhado para preparar copos do posterior da ocular do rato para o IHC que é suficiente preservar a maioria de interações do anticorpo-epítopo sem perda de integridade estrutural retinal. Nós incluímos IHC representativo com os anticorpos aos vários marcadores retinal do tipo da pilha para ilustrar a preservação e a orientação do tecido circunstâncias óptimas e suboptimal. Nosso objetivo é aperfeiçoar estudos de IHC do retina fornecendo um protocolo completo da dissecção do copo do posterior da ocular ao IHC.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica poderosa para localizar proteínas e estruturas celulares específicas nos tecidos in situ^1,2,3. Os métodos inadequados da fixação e o seccionamento secundário-optimal de tecidos complexos podem interromper a estrutura do tecido, gerar a mancha elevada do fundo ou diminuir interações do anticorpo-epítopo, tendo por resultado artefatos de coloração e conseqüente interpretação errónea de Dados IHC⁴. Como a retina de vertebrados é um órgão neural complexo e altamente organizado composto por estratos de fotorreceptores interligados, interneurônios e células ganglionares, é muito frágil e pode ser facilmente interrompido durante a dissecção e o corte. Um protocolo detalhado, padronizado, e validado da dissecção do olho do rato e a orientação à imunomarcação ajudarão significativamente a reduzir artefatos de IHC, desse modo, aumentando a confiabilidade dos resultados e permitindo dados comparativos mais precisos Análise.

Há muitos protocolos para a preparação do tecido para o IHC, entretanto, não todos são apropriados para o tecido retinal. Os fixadores fortes como o formalina de 10% ou a solução de Bouin preservam a estrutura retinal durante a dissecção e o corte⁵. Infelizmente, os fixadores fortes conduzem frequentemente à fluorescência aumentada do fundo e ao mascaramento do epítopo devido à modificação química dos resumos⁶. Por outro lado, os fixadores mais leves, como o paraformaldeído a 4% (PFA) podem aliviar alguns desses artefatos, mas necessitam de dissecção meticulosa e seccionamento para preservar a estrutura retiniana ideal. PFA penetra ràpida o tecido, mas as proteínas Cross-links muito lentamente, reduzindo o risco de mascarar do epítopo. Desde que a incubação do PFA do tempo curto é uma fixação relativamente suave, os tecidos exigem frequentemente o congelamento rápido preservar antígenos. É importante evitar a formação de cristais de gelo durante o congelamento tecidual, pois eles distorcem e danificam a integridade das células e dos tecidos⁷.

Aqui nós descrevemos protocolos detalhados e estandardizados para a dissecção, a fixação, e a Cryo-proteção de copos do posterior da ocular do rato que produzem dados consistentes e de confiança de IHC.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do guia nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório fornecidos pelo Instituto de recursos animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade da Pensilvânia.

Todas as ferramentas e equipamentos para os métodos são mostrados na Figura 1 e listados na tabela de materiais.

1. Enucleation do olho do rato, dissecção do copo do olho, e incorporação

1. Eutanizar camundongos com dióxido de carbono (CO₂) seguido de decapitação (camundongos pós-natal P0-P11) ou luxação cervical (camundongos adultos > P11). Para os ratos P0-P14, os olhos são cobertos pela pele. Certifique-se de remover a pele antes das etapas subsequentes.
2. Marque a parte temporal do olho (Figura 2a), queimando levemente a córnea usando um cauterizador de cauda. Evite queimar um furo na córnea tocando a córnea muito levemente e para não mais do que uma fração de segundo com o cauterizador.
3. Imediatamente enuclear olhos do rato usando curvo Dumont #5/45 fórceps. Incubar durante 15 min em um tubo de 1,5 ml de criotubo com 1 ml de paraformaldeído de 4% (PFA) em Saline fosfato-tamponado (PBS) no gelo.
4. Após 15 min em 4% PFA, transfira o olho fixo usando o fórceps curvado Dumont #5/45 a um prato modificado da dissecção de 35 milímetros (veja a tabela dos materiais e a Figura 1C) enchido com o PBS e o lugar o microscópio de dissecação.
5. Faça uma pequena incisão na marca de queimadura, perpendicular a e logo acima do limbus (borda da córnea) usando a micro faca.
6. Insira a tesoura curvada na incisão e realize um corte circunferencial da córnea seguindo o limbo (Figura 2b).
7. Retire a córnea e extraia a lente com um fino #5 fórceps de Dumont, (Figura 2b) e levante-o delicadamente afastado da parcela do posterior do olho. O corpo vítreo, o gel desobstruído que enche o espaço entre a lente e o retina, virá para fora com a lente (Figura 2b) e o retina será visível como uma superfície branca que cobre o interior do copo do olho do posterior. Certifique-se de que não há danos visíveis na retina, como furos ou lágrimas (Figura 2C).
8. Lave os copos de olho duas vezes em 1 mL de PBS por 10 min à temperatura ambiente.
9. Cryoprotect os copos do olho equilibrando os em uma solução de sacarose de 15% em PBS durante a noite em 4 ° c até que o copo do olho sumidouros
10. Transfira os copos do olho à sacarose de 30% em PBS para 2-3 h até que o copo do olho sumidouros.
11. Incorporar os copos de olho em OCT em 10 x 10 mm crimológicos (Figura 3a). Usando um microscópio de dissecação, Oriente o olho no cryomold ao longo de seu eixo dorsal-ventral (Figura 2D, Figura 3a) girando o olho até que a marca da queimadura esteja na parte superior, o nervo ótico está na esquerda e a parte cortada do molde enfrenta a direita ( Figura 2D). Tome cuidado para evitar bolhas perto do tecido.
    Nota: para manipular o copo do olho, use uma ponta de prova Titanium feita de um fio Titanium Unido a uma ponta da pipeta.
12. Para fixar-congelar o tecido retiniano, mergulhe o cryomold por pelo menos 5 minutos em um copo do metal que contem o isopentano e coloc a taça no nitrogênio líquido ou no banho seco do etanol do gelo/100% (até 1/3 da altura da Taça do metal).
    Nota: o cryomold deve ser imergido em isopentano para maior que a metade de sua altura, mas não tem que ser completamente submerso.
13. Retire o bloco congelado e enrole-o em folha de alumínio.
14. Conservar a-80 ° c.
15. Marque o bloco congelado usando uma caneta ou Sharpie para registrar a orientação do bloco (Figura 3B).

2. Seccionamento usando um criostat

1. Após ajustar a temperatura do criostato (entre-20 e-25 ° c), permita que os moldes que contêm os copos incorporados do olho equilibrem à temperatura do criostato para 1 h.
2. Instale o bloco com orientação dorso-ventral (Figura 3C) e corte 10 μm de espessura de seções seriais. Coloc com cuidado as seções retinal em corrediças anotadas e numeradas do microscópio.
3. Armazene slides em caixas de slides a-20 ° c ou-80 ° c até os procedimentos do IHC.

3. Imunocoloração por fluorescência utilizando a cremalheira deslizante

Nota: o sistema da cremalheira de corrediça (por exemplo, Sequenza) prende as corrediças do microscópio de vidro com uma placa de tampa, criando um ~ 100 μL de abertura capilar entre a corrediça e a placa.

1. Descongelar as crio-secções à temperatura ambiente (RT) durante 2 h a 4 h para lhes permitir secar e fixar nas lâminas do microscópio.
   Nota: também é possível secá-los a 30-37 ° c durante 30 min a 1 h.
2. Coloc corrediças na cremalheira de corrediça e lave as seções retinal duas vezes em 100-200 μL de PBS por 2 minutos.
3. Permeabilize as secções retinianas incubando-as em 0,25% Triton-X/0, 5% NaN₃em PBS durante 5 min em RT.
4. Adicione 100 μL de solução de bloqueio aos slides.
5. Adicionar 100 μL de anticorpo primário diluído na solução de bloqueio para as lâminas.
6. Incubar secções retinianas durante a noite a 4 ° c.
   Nota: durante este tempo, cubra o rack deslizante para evitar a dessecação das secções.
7. Lave as secções retinianas 3 vezes, cada uma por 15 min, utilizando 200 μL de PBS.
   Nota: a adição de 0, 1-0, 2% Triton-X100 a PBS (PBS-T) permite uma lavagem mais rigorosa, mas pode interromper algumas membranas e estruturas celulares.
8. Incubar seções retinianas em anticorpos secundários com rótulo fluorescente por 1 h em RT. A partir de agora Proteja-se da luz.
9. Lave as secções retinianas 3 vezes, cada uma por 15 min.
10. Incubar as secções retinianas em RT durante 5 min com um marcador nuclear como Hoechst 33342 ou solução DAPI.
11. Lave as secções retinianas 1 vez durante 15 min.
12. Coloque uma lamínula em cima de uma toalha de papel no banco de laboratório.
13. Adicione 2 gotas de suportes de montagem antidesvanecimento ao centro da lamínula.
14. Gire a corrediça sobre para ter a Cryo-seção retinal virada para baixo.
15. Monte com cuidado a lamínula lentamente, em um ângulo de ~ 45 °, derrube o slide na mídia de montagem.
    Nota: evitando formando bolhas como você abaixar o slide no lugar.
16. Aplique pressão mesmo, usando um livro pesado ou catálogo (veja abaixo), para a combinação de deslizamento de cobertura para eliminar o excesso de suportes de montagem.
    Nota: para garantir a consistência na preparação da amostra, sempre use o mesmo objeto, (ou seja, o mesmo livro ou catálogo) para aplicar até mesmo a pressão na lamínula durante a montagem do slide.
17. Mantenha o plano e deixe endurecer durante a noite no RT no escuro. Armazene os slides horizontalmente a 4 ° c indefinidamente.
18. Imagem via microscopia de fluorescência de campo largo ou confocal (Figura 4).

Representative Results

Para ilustrar como estes protocolos, asseguram a preservação retinal óptima para IHC, nós sondado seções retinal dos ratos de P28 WT (C57Bl/6N) com os anticorpos ao rodopsina (um marcador do fotorreceptor)⁸, descarboxilase ácido glutâmico 65 (Gad65, uma pilha amacrina marcador)⁹, glutamina sintetase (GS, marcador de célula Müller)¹⁰, e calbindin (marcador de célula horizontal)¹¹ (Figura 4). O IHC indica que nossos protocolos consistentemente produzem alta qualidade e seções retinianas bem preservadas. Notavelmente, os segmentos internos e externos ricos em rhodopsina permanecem verticais e intactos com pouca ou nenhuma separação de sobrejacente ao Epitélio pigmentado da retina (RPE) (figura 4a). Além disso, as células de Müller permanecem bem preservadas com os processos de soma devidamente alinhados e citoplasmáticos que se estendem desde a camada de células ganglionares (GCL) até a camada nuclear externa (ONL) (Figura 4B).

Os interneurônios, como as células amacrinas Gad65-positivas, também permanecem adequadamente estratificados dentro do INL e da camada plexiforme interna (IPL) (Figura 4B), enquanto as células horizontais bem definidas são detectáveis no INL e exterior plexiforme borda da camada (OPL) (Figura 4C). Coletivamente, esses dados demonstram que nosso método preserva a integridade da célula e do tecido da retina, de FOTORRECEPTORES a células ganglionares

Para facilitar o seccionamento transversal, é importante orientar meticulosamente o copo ótico no Cryo-molde antes do congelamento. As retinas mal orientadas, a técnica de corte deficiente ou o corte com facas de micrótomo maçantes ou danificadas podem causar artefatos como lágrimas de tecido retiniana, distorções e deslocamento celular, como na Figura 4. Exemplos de artefatos de seção são mostrados na Figura 4D-F. Na Figura 4D , o corte e o alinhamento ruins levam à distorção dos segmentos interno e externo do fotorreceptor (Figura 4D) e aos pequenos rasgos de tecido (Figura 4e, seta). Em um outro exemplo, a orientação pobre do tecido antes da seção conduz ao alinhamento secundário-optimal do soma da pilha de Muller e dos processos cytoplasmic Figura 4E. A Figura 4F mostra como a seccionamento deficiente provavelmente causada por uma faca maçante do micrótomo causou pilhas horizontais à mancha aberrantemente do OPL ao GCL. Assim, deve-se aplicar atenção precisa à execução de cada etapa delineada no protocolo para garantir a mais alta qualidade e reprodutibilidade dos dados do IHC.

Figura 1. º : Ferramentas para dissecção de olhos de rato, incorporação e IHC. (A) cauterizador; (B) ferramentas de dissecção da esquerda para a direita: Dumont #5/45 fórceps curvo, tesoura curvada, e Dumont #5 fórceps fino; (C) prato de dissecção de 35 mm (seta aponta para a câmara de dissecação); (D) microscópio de dissecação; (E) ferramentas congeladas da esquerda para a direita: refrigerador isolado, taça de aço inoxidável para banho isopentano, líquido de aço inoxidável N₂ banho; (F) sonda de titânio; (G) cremalheira da corrediça e coverplate para IHC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. º : Orientação e descrição do copo do olho do rato. (A) local da marca de queimadura temporal (seta vermelha) para facilitar a orientação ocular (dorso = D, ventral = V, temporal = T, nasal = N). (B) esquema para a dissecção do olho do rato. Uma pequena incisão é feita na marca de queimadura, perpendicular na córnea e logo acima do limbus usando um bisturi fino (micro faca). Corte em torno da córnea para separar a parte anterior e posterior do olho. (C) copo de olho com uma retina intacta. (D) orientação dorso-ventral do olho do rato com o nervo óptico (ON), lente (L), córnea (C) o limbus (OS). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. º : Encaixando o olho do rato. (A) dorso-ventral orientada para o copo de olho de camundongos em crimológico preenchido com OCT, (B) Frozen mouse copo de retina em crimolado anotada. (C) Criostat. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. º : O retina do rato immunohistochemistry. (A-c) a boa qualidade e (D-F) as seções retinal da má qualidade do peso de P28 foram etiquetadas com os anticorpos ao marcador do amacrina do rodopsina (a, c) GAD65 (B, e) e o sintetase da glutamina do marcador da pilha de Müller (GS; B, e), e marcador de célula horizontal calbindin (C, F). As setas brancas apontam para lágrimas de tecido e manchas aberrantes do tecido. Barra de escala, 20 μm. núcleos rotulados com Hoechst 33342 (azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A dissecção do retina do rato é um processo delicado devido ao tamanho e à forma pequenos de olhos do rato e à fragilidade do tecido retinal. Mesmo que a realização de dissecção de alta qualidade é uma questão de prática, tendo um protocolo detalhado, fornecendo métodos eficientes e dicas é uma necessidade para obter seções retinianas e IHC. Além do que os protocolos descritos aqui, há diversas pontas que permitem as seções retinal de alta qualidade consistentes que são apropriadas para o IHC reprodutível.

Antes de começar com dissecção, é importante ser confortável, relaxado e ajustar a iluminação do quarto para a visão óptima durante a microdissecção do olho do rato. Para manter a forma do copo do olho do rato ao dissecação o olho, nós sugerimos manter os olhos submergidos em PBS em pratos cera-revestidos feitos encomenda da dissecção. Sugerimos que revele um prato de dissecção de 35mm com cera dental colorida rosa clara (Figura 1C). Na verdade, a cor rosa clara da cera dental fornece contraste adequado para ver prontamente estruturas oculares um escopo de dissecção, as impressões de tamanho de olho na cera, feita pressionando a base de tubos de microcentrífuga na cera, manterá o copo do olho no lugar enquanto permitindo a rotação apropriada das ferramentas em torno do copo do olho durante a dissecção. Além, é importante remover tanto o líquido vítreo do copo do olho como possível ao remover a lente, porque o líquido vítreo residual é propenso para dar forma a cristais de gelo prejudiciais do tecido durante a etapa de congelação do bloco do tecido. Nós usamos geralmente um papel de tecido e coloc o à beira do copo dissecado do olho, para remover com cuidado todo o líquido vítreo restante pelo capilar sem perturbar o tecido do retina. No caso infeliz onde uma pequena quantidade de líquido vítreo residual está ainda atual no copo do olho, o corte deve ser feito no ° c-20 para reduzir a transformação do vítreo no gelo e para preservar conseqüentemente a agudeza da lâmina e a qualidade do seccionamento .

Os métodos de fixação e incorporação também têm um grande impacto na qualidade das secções e no IHC. Embora as seções parafina-encaixadas formalina-fixas produzam a integridade estrutural óptima do tecido do olho, o formalina contem o metanol que pode realçar a fluorescência do fundo. Para evitar esses artefatos, recomendamos o uso de paraformaldeído fresco em grau (PFA) para limitar o fundo e a autofluorescência causada por metanol ou PFA oxidado^4,5,6. Recomendamos as condições de fixação leves descritas em nosso protocolo fixando o olho com paraformaldeído a 4% por 15 min no gelo. Uma vez que a PFA penetra rapidamente no tecido, mas as proteínas de ligações cruzadas muito lentamente, essas condições são suficientes para preservar a integridade estrutural da retina durante a dissecção e preservar a antigenicidade de antígenos retinianas comuns sem a necessidade de antígeno métodos de recuperação⁴. Se a estrutura da retina não está bem preservada, a duração da fixação de PFA pode ser aumentada, no entanto, é importante estar ciente de que os tecidos de excesso de fixação irá melhorar a fluorescência de fundo não-específica e pode levar ao epítopo mapeado mascaramento, enquanto sob-fixating os tecidos podem comprometer a integridade estrutural do tecido e causar a perda de alguns antígenos propensos à degradação proteolítica. Desde que a incubação do PFA do tempo curto é uma fixação relativamente suave, nós igualmente recomendamos retinas snap-Freezing mergulhando o olho Oct-encaixado, contido em um cryomold (10 milímetros x 10 milímetros x 5 milímetros), em um banho do isopentano imerso no nitrogênio líquido. Os tecidos de congelamento de pressão preservam antígenos, enquanto a solução de sacarose e a OCT atuam como crioprotectantes. Este método reduzirá a distorção do tecido devido à formação de cristais de gelo, que podem causar o so-called tipo suíço do queijo de dano de tecido. O criomofo não deve ser mergulhado diretamente em nitrogênio líquido ou começará a ferver, formando uma barreira de vapor e que retardará o processo de congelamento, resultando em uma fixação heterogênea e preservação. Além disso, o tecido e a OCT em contato com nitrogênio líquido podem rachar, afetando assim a integridade do olho⁷. Nós, conseqüentemente, recomendamos mergulhar o cryomold (10 milímetros x 10 milímetros x 5 milímetros) em não mais do que o isopentano profundo de 5 milímetros usando uma taça de aço inoxidável pequena, própria mergulhada em uma taça de aço inoxidável maior (mínimo de 100 milímetros largamente) que contem o nitrogênio líquido. Para evitar a rápida evaporação do nitrogênio líquido durante a preparação de várias amostras, mantemos ambos os banhos em um refrigerador isolado. Deve-se notar que os tecidos criopreservação em OCT não é um método de preservação a longo prazo, devido à formação de cristais de gelo no tecido ao longo do tempo que pode alterar a morfologia subcelular e/ou desnaturamento alguns antígenos. Consequentemente, os blocos do tecido e as seções congeladas devem ser armazenados em-20 ° c para o armazenamento a curto prazo e para o armazenamento a longo prazo de-80 ° c.

A retina de mamíferos é um órgão assimétrico com uma distribuição espacial específica das células nos eixos temporal-nasal e dorso-ventral. Por exemplo, os cones de M-e de S-opsin são arranjados em um inclinação dorso-ventral específico ¹². Conseqüentemente, é essencial assegurar a orientação apropriada do olho durante todo a preparação do tecido e seccionamento a fim executar o IHC comparativo. Nós usamos um cauterizador para coloc uma marca de referência no olho antes da dissecção (Figura 2a, D) demodo que nós possamos orientar o copo do olho ao longo de seu eixo dorsal-ventral durante a fase de incorporação, e conseqüentemente obtendo seções perfeitamente transversais. Nós coloc a marca da queimadura na parte dorso-temporal do olho, tocando na córnea para uma fração de segundo com o cauterizer. Isto permitirá queimar ligeiramente a córnea ao evitar perfurar um furo nele. Durante a dissecção do copo ocular, fazemos uma pequena incisão, na marca de queimadura, perpendicular à borda da córnea, usando a microfaca (Figura 2b). Para facilitar a orientação dorso-ventral do bloco e minimizar os ajustes de orientação durante o corte, sugerimos orientar o copo ocular posterior no crimolador, com a marca de queimadura voltada para o fundo do crimolador e a abertura da córnea perfeitamente paralelo do lado direito do crimolado (Figura 3a, B). O bloco congelado será instalado com a parte inferior do bloco voltado para a lâmina no criostat, o copo do olho perpendicular à lâmina, em uma orientação dorso-ventral (Figura 3C).

A retina confiável IHC começa com dissecções ideais, adaptadas e reprodutíveis e processamento de tecidos. O método descrito aqui preserva otimamente a estrutura e a integridade retinianas, minimizando a autofluorescência e o mascaramento de epítopo que podem comprometer a IHC fluorescente. Seguir este protocolo garantirá que você tenha dados de alta qualidade reprodutíveis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives - Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods