Summary
Ici, nous présentons un protocole qui utilise des colorants quasi-infrarouges en conjonction avec l’immunohistochimie et la numérisation à haute résolution pour les protéines de dosage dans les régions du cerveau.
Abstract
La neuroscience est l’étude de la façon dont les cellules du cerveau médient diverses fonctions. La mesure de l’expression des protéines dans les neurones et la Glia est essentielle pour l’étude des neurosciences car la fonction cellulaire est déterminée par la composition et l’activité des protéines cellulaires. Dans cet article, nous décrivons comment l’immunocytochimie peut être combinée avec l’analyse à haute résolution proche infrarouge pour fournir une mesure semi-quantitative de l’expression des protéines dans les régions cérébrales distinctes. Cette technique peut être utilisée pour une expression de protéine simple ou double dans la même région cérébrale. Les protéines de mesure de cette façon peuvent être utilisées pour obtenir un changement relatif dans l’expression des protéines avec une manipulation expérimentale, la signature moléculaire de l’apprentissage et de la mémoire, l’activité dans les voies moléculaires, et l’activité neuronale dans plusieurs régions cérébrales. En utilisant les bonnes protéines et l’analyse statistique, la connectivité fonctionnelle entre les régions cérébrales peut également être déterminée. Étant donné la facilité de mise en œuvre de l’immunocytochimie dans un laboratoire, l’utilisation de l’immunocytochimie avec un balayage à haute résolution à infrarouge proche peut élargir la capacité du neuroscientifique à examiner les processus neurobiologiques au niveau des systèmes.
Introduction
L’étude des neurosciences concerne une enquête sur la façon dont les cellules du cerveau médient les fonctions spécifiques1. Ceux-ci peuvent être cellulaires dans la nature comme la façon dont les cellules gliales confèrent l’immunité dans le système nerveux central ou peuvent impliquer des expériences qui visent à expliquer comment l’activité des neurones dans l’hippocampe dorsal conduit à la navigation spatiale. Dans un sens large, la fonction cellulaire est déterminée par les protéines qui sont exprimées dans une cellule et l’activité de ces protéines2. En conséquence, la mesure de l’expression et/ou de l’activité des protéines dans les cellules cérébrales est essentielle pour l’étude des neurosciences.
Un certain nombre de techniques sont disponibles pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau. Il s’agit notamment de méthodes in vivo telles que la topographie des émissions de positrons pour les densités des récepteurs3 et la micro-dialyse pour les petits peptides4. Plus communément, les méthodes ex vivo sont utilisées pour examiner la fonction et l’expression des protéines. Il s’agit notamment de techniques de spectrométrie de masse5, de Western Blot et d’immunosorbant enzymatique (ELISA)6, et d’immunocytochimie7. L’immunocytochimie est largement utilisée dans le domaine des neurosciences. Cette technique implique l’utilisation d’un anticorps primaire pour détecter une protéine (ou un antigène) d’intérêt (p. ex. c-fos) et un anticorps secondaire conjugué pour détecter le complexe d’anticorps protéine-primaire (figure 1). Pour permettre la détection du complexe anticorps-secondaire anticorps-primaire de protéine, les anticorps secondaires ont des agents oxydants tels que la peroxydase de raifort (HRP) conjugués à eux. Cela permet la formation de précipités dans les cellules qui peuvent être détectées à l’aide de la microscopie photonique7. Les anticorps secondaires peuvent également avoir des substances chimiques fluorescentes conjuguées à elles (c.-à-d. fluorophores). Lorsqu’ils sont stimulés, ces produits chimiques émettent de la lumière, qui peut être utilisé pour détecter les complexes d’anticorps secondaires de protéine-primaire7. Enfin, parfois, les anticorps primaires ont des agents réducteurs et des produits chimiques de fluorescence attachés directement à la nécessité d’anticorps secondaires7 (figure 1).
Fait intéressant, de nombreuses méthodes d’immunocytochimie permettent la visualisation des protéines dans les cellules du cerveau, mais pas la capacité de quantifier la quantité de protéines dans une cellule spécifique ou une région du cerveau. L’utilisation de la microscopie photonique pour détecter les précipités des réactions de réduction permet de visualiser les neurones et les gliales, mais cette méthode ne peut pas être utilisée pour quantifier l’expression des protéines dans les cellules ou dans une région cérébrale spécifique. En théorie, la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour cela, parce que la lumière émise par l’anticorps secondaire fluorescent est une mesure du complexe anticorps-secondaire anticorps-primaire de protéine. Cependant, l’autofluorescence dans le tissu cérébral peut rendre difficile l’utilisation de la microscopie de fluorescence pour quantifier l’expression des protéines dans le tissu cérébral8. Par conséquent, la lumière émise par les images fluorescentes du tissu cérébral est rarement utilisée pour quantifier l’expression des protéines dans le cerveau.
Beaucoup de ces questions peuvent être abordées en utilisant l’immunocytochimie proche infrarouge en conjonction avec la numérisation à haute résolution9,10. Dans cet article, nous décrivons comment l’immunocytochimie couplée avec les fluorophores dans les spectres d’émission proche infrarouge peut être combinée avec une numérisation à haute résolution (par exemple, 10 – 21 μM) pour obtenir des images nettes qui permettent une quantification semi-quantitative des protéines dans des régions du cerveau.
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Protocol
Le protocole suivant a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Delaware. Des rats mâles Sprague Dawley âgés de 55 à 75 jours environ ont été utilisés pour ce protocole.
1. extraction du cerveau et préparation tissulaire
- Anesthésier le rat avec l’isoflurane dans la chambre d’induction d’anesthésie jusqu’à ce que le rat ne montre plus une réponse au pincement de pied.
- Sacrifiez les rats par décapitation rapide à l’aide d’une guillotine.
- Coupez la peau sur le crâne postérieur à antérieur et clair du haut du crâne.
- Utilisez pinces-gouges pour retirer délicatement la partie arrière du crâne, puis en utilisant de petits ciseaux de dissection coupés vers le bas de la ligne médiane du crâne, poussant vers le haut contre le dessus du crâne en tout temps pour éviter d’endommager le tissu cérébral.
- Utilisez pinces-gouges pour décoller à droite et à gauche de la moitié du crâne pour exposer le cerveau.
- Utilisez une petite spatule pour ramasser sous le cerveau et rompre les nerfs, élever soigneusement le cerveau et geler les cerveaux dans l’isopentane réfrigérée sur de la glace carbonique (au moins-20 ° c). Après cela, rangez les cerveaux dans un congélateur de-80 ° c jusqu’à ce que le tranchage.
- Couper les cerveaux dans les régions d’intérêt à 30 – 50 μM dans un cryostat maintenu entre-9 ° c et-12 ° c. Montez directement les tranches sur des lames de verre et rangez-les dans un congélateur de-80 ° c jusqu’au moment de l’immunocytochimie.
Remarque: Dans ce protocole, les régions du cerveau d’intérêt étaient l’hippocampe et l’amygdala.
2. réaction immunohistochimique unique
Remarque: Pour la double réaction immunohistochimique, le protocole est le même que la réaction immunohistochimique unique, sauf que cette réaction a deux anticorps primaires de différents hôtes (par exemple, le lapin et la souris) et deux anticorps secondaires pour les primaires doivent être d’un seul hôte (p. ex., antilapin de chèvre et antisouris de chèvre). Les anticorps secondaires doivent également être de deux spectres différents qui sont disponibles dans les scanners haute résolution. Par exemple, un anticorps secondaire avec un pic de spectre d’émission à 680 nm et un anticorps secondaire 800CW (pic de spectre d’émission à 780 nm).
- Retirer les lames de verre du congélateur et laisser s’équilibrer à température ambiante pendant 30 min.
- Sous une hotte, fixer le tissu cérébral dans du paraformaldéhyde à 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,1 M pour 1 − 2 h à température ambiante.
- Rincer les lames dans une solution saline tamponnée de 0,1 M (TBS) trois fois pendant 10 min chacune. Perméabilize membranes cellulaires en incubant les lames dans un détergent doux (p. ex., 0,01% de détergent) pendant 30 − 60 min.
- Rincer les lames au TBS trois fois pendant 15 min chacune.
- Diluer l’anticorps primaire pour la protéine d’intérêt dans le PBS dans la concentration correcte. Par exemple, pour détecter le gène précoce immédiat c-fos, préparez un anticorps anti-c-fos primaire de lapin dans une concentration de 1:500.
- Pipetter la solution d’anticorps primaire directement sur le tissu cérébral (environ 200 μL par glissière de 3 pouces x 1 pouce).
- Utiliser des lamelles pour Incuber le tissu cérébral sur des lames de verre dans la dilution primaire d’anticorps pour 1 − 2 h à la température ambiante ou pendant la nuit (~ 17 h) à 4 ° c.
- Enlevez les lamelles et les lames de lavage dans le SCT qui contient une petite quantité de détergent (p. ex., 0,01% de détergent, «TBS-T») quatre fois pendant 15 min chacune.
- Utiliser des lamelles pour Incuber les sections cérébrales dans un anticorps secondaire à température ambiante pendant 2 h.
Remarque: L’anticorps secondaire doit être à la dilution correcte et dans un diluant contenant du SCT, du détergent et 1,5% du sérum hôte. Par exemple, un anticorps secondaire de chèvre dans une dilution de 1:2000 contiendrait 1,5% de sérum de chèvre et 0,05% de détergent. - Rincez les lames en TBS-T quatre fois pendant 20 min chacune, puis dans TBS quatre fois pendant 20 min chacune.
- Lames sèches à température ambiante dans l’obscurité pendant la nuit. Lorsque les diapositives sont sèches, elles sont prêtes pour l’imagerie.
3. l’imagerie
- Placez les diapositives sur l’interface de balayage proche infrarouge avec le tissu orienté vers le bas. Soit image une diapositive de verre ou plusieurs diapositives à la fois à l’aide d’un outil de sélection.
- Diapositives d’image utilisant le réglage de la plus haute qualité avec un décalage de 0 nm et une résolution de 21 μm. La numérisation prendra généralement 13 − 19 h en fonction de l’équipement de numérisation utilisé.
- Importez des images dans le logiciel d’analyse d’image (par exemple, ImageStudio) pour afficher et marquer pour l’analyse des protéines semi-quantitatives.
4. analyse de l’expression protéique
- Ouvrez le logiciel d’analyse d’image et sélectionnez la zone de travail dans laquelle l’image a été numérisée.
- Ouvrez l’image numérisée dans le logiciel d’analyse d’image pour afficher l’analyse et ajustez les longueurs d’onde affichées, ainsi que le contraste, la luminosité et le grossissement affichés sans altérer l’image brute ou l’émission quantifiée totale.
- Identifiez les régions clés pour la quantification et sélectionnez l’onglet analyse en haut de la page, puis sélectionnez dessiner un rectangle (ou dessiner ellipse/dessiner à main levée) pour tracer un rectangle sur la zone qui sera quantifiée.
- Pour afficher la taille du rectangle, sélectionnez formes dans le coin inférieur gauche de l’écran, puis sélectionnez colonnes en bas à droite. Ajouter des colonnes Height et Width pour identifier la taille de la forme.
Remarque: Il est important de contrôler la taille de la forme lors de la comparaison de la quantification. Il est recommandé d’utiliser des formes identiques placées dans l’emplacement de quantification désiré, afin d’obtenir un échantillonnage précis des émissions pour cette région. - Nommez ensuite la forme et répétez. Une fois que toutes les régions sont échantillonnées, les données disponibles à partir de l’onglet colonnes peuvent être agrégées et analysées.
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Representative Results
Avant d’utiliser l’analyse à haute résolution pour l’immunohistochimie, il faut vérifier que le protocole fonctionne. Cela peut être accompli à l’aide d’un test de validation où les sections cérébrales du même animal sont incubées avec des anticorps primaires et secondaires, des anticorps secondaires seuls, ou ni des anticorps primaires ni secondaires. Les résultats d’un tel test de validation sont illustrés à la figure 2. Dans cette réaction, nous avons détecté le gène précoce immédiat c-Jun dans l’hippocampe dorsal et l’amygdala. L’expression C-Jun n’a été observée que lorsque des anticorps primaires et secondaires ont été appliqués au tissu cérébral.
La figure 3 montre la double détection des protéines dans les noyaux d’amygdale. Dans cette expérience, nous avons analysé la sous-unité GluR1 du récepteur de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolépropionique (AMPA) et la sous-unité NR2A du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA) dans le même tissu cérébral. Cela nous a permis d’examiner le ratio des récepteurs AMPA/NMDA dans les sous-noyaux de l’amygdala. Ce ratio est une signature neurobiologique de l’apprentissage et de la mémoire11,12. Comme on peut le voir dans la figure 3, le signal pour GluR2 (780 nm de lumière Pseudo colorée en vert) et NR2A (680 nm de lumière Pseudo-colorée en rouge) ne peut être observée dans le tissu cérébral qui a été exposé à des anticorps primaires et secondaires.
La figure 4 montre comment les mesures moyennes et normalisées de l’expression protéique peuvent être obtenues à partir de scans à haute résolution dans l’hippocampe ventrale. En utilisant le logiciel d’analyse d’image, un rectangle est placé dans la région d’intérêt (couche moléculaire de CA1) et l’intensité moyenne de la lumière de la forme peut être utilisée comme mesure de l’expression du fluorophore (figure 4a). À son tour, il s’agit d’une mesure de l’expression des protéines (c.-à-d., le complexe antigène-primaire anticorps-secondaire anticorps). La forme peut également être placée à travers une région qui exprime le signal élevé et le signal faible pour obtenir une courbe normalisée (figure 4b). Dans cet exemple, un rectangle a été placé à travers la couche moléculaire de CA1, mais couvrait également les champs dendritiques, qui n’exprimaient pas de quantités significatives de c-Jun dans ce dosage. La zone sous la courbe peut alors être utilisée comme mesure de l’expression protéique. Si la configuration dans une expérience implique des groupes de traitement (par exemple, l’exposition au stress) et un contrôle, des changements relatifs dans l’expression des protéines dans le cerveau peuvent être obtenus.
Figure 1 : Illustration de la réaction immunohistochimique utilisant des anticorps primaires (1St) et secondaires (2ND) ou juste un anticorps primaire. Les cercles noirs remplis représentent une étiquette, qui pourrait être un agent oxydant tel que la peroxydase de raifort ou un fluorophore tel que le bore-dipyrrométhène (BODIPY). Les carrés verts représentent l’antigène (sur la protéine d’intérêt) détecté dans la réaction immunohistochimique.
La figure 2 : Images d’un test de validation pour la détection de c-Jun. Dans ce dosage, le tissu du même animal a été traité avec un anticorps primaire de lapin qui reconnaît le c-Jun et l’anticorps secondaire antilapin de chèvre avec le fluorophore attaché avec l’émission à 780 nm (Pseudo coloré en vert, panneau de gauche). Les tissus adjacents ont été traités avec un seul anticorps secondaire (panneau du milieu) ou aucun anticorps (panneau de droite). Barre d’échelle = 1 mm.
Figure 3 : Test de validation pour la réaction immunohistochimique à double étiquetage dans l’amygdala. Les sections de cerveau Triplicate du même rat ont été soit exposées à l’anticorps de lapin qui reconnaît GluR1 et l’anticorps de souris qui reconnaît NR2A (panneaux de gauche), Anticorps secondaires (panneaux du milieu), ou aucun anticorps (panneaux de droite). GlurR1 a été visualisé avec l’anticorps secondaire de chèvre anti lapin 800cw (780 nm, Pseudo coloré en vert) et NR2A a été visualisé en utilisant un anticorps secondaire de chèvre immun 680rd (680 nm, Pseudo-coloré en rouge). Barre d’échelle = 1 mm. OT = tube optique; IC = Capsule interne; EC = capsule externe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Obtention de mesures semi-quantitatives de l’expression protéique dans le tissu cérébral. (A et B) captures d’écran des images notées dans le logiciel d’analyse d’image qui est utilisé pour analyser les images du scanner. Les tissus étaient de l’hippocampe ventrale et traités pour visualiser c-Jun. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les résultats présentés dans cet article montrent que la quasi-infrarouge immunocytochimie en combinaison avec la numérisation à haute résolution peut être utilisé pour obtenir des mesures semi-quantitatives de l’expression des protéines dans le tissu cérébral. Il peut également être utilisé pour étiqueter deux protéines simultanément dans la même région du cerveau. Nous avons déjà utilisé l’immunohistochimie près de l’infrarouge pour mesurer l’expression précoce immédiate des gènes dans plusieurs régions cérébrales9,10. Les premiers gènes immédiats peuvent être utilisés comme mesure de l’activité neuronale. Nous avons également soumis ces mesures semi-quantitatives d’expression protéique à des analyses statistiques qui nous ont permis de regrouper les régions cérébrales avec des niveaux corrélés de gènes précoces immédiats (IEG). Nous l’avons utilisé comme une mesure de la connectivité fonctionnelle pour examiner comment le stress affecte la connectivité fonctionnelle entre les noeuds dans le circuit de la peur pendant l’apprentissage émotionnel et la mémoire9,10. Nous avons montré comment les ratios AMPA/NMDA (une signature de l’apprentissage et de la mémoire) peuvent être mesurés en utilisant l’immunocytochimie proche de l’infrarouge avec l’analyse à haute résolution13. Une technique similaire peut être utilisée pour mesurer la casserole et les phospho-protéines pour déterminer la signalisation moléculaire. Ceci est accompli en utilisant Western Blot14. Cependant, cela nécessite de disséter les régions cérébrales à partir de tranches de cerveau épais et ne se prête pas aux petites régions du cerveau. Ce problème peut être contourné en utilisant l’immunocytochimie proche infrarouge avec une numérisation haute résolution. Enfin, toutes les images d’immunocytochimie sont numérisées, ce qui permet un stockage illimité et une ré-analyse pratique des tests précédents.
Comme avec toutes les méthodes, il y a des inconvénients. Il n’y a pas de grossissement dans les scanners haute résolution et le traitement des tissus ne permet pas facilement de sonder en utilisant des techniques microscopiques de fluorescence. Même en prenant des tranches de rechange du cerveau peut ne pas fonctionner, puisque la microscopie confocale peut mieux fonctionner dans le tissu cérébral perfusé, mais l’imagerie à proximité infrarouge avec la numérisation à haute résolution est généralement fait sur Flash cerveaux congelés. L’expression protéique dans des neurones spécifiques (par exemple, interneurones vs Neuron pyramidale) ou différents types de cellules dans le cerveau (par exemple, les neurones vs. Glia) ne peut pas être déterminée en utilisant l’immunocytochimie proche de l’infrarouge avec un balayage à haute résolution. L’exécution de tests de validation est essentielle car il s’agit encore d’une méthode relativement nouvelle pour examiner l’expression protéique dans le tissu cérébral.
Lorsqu’il est utilisé de façon appropriée, l’immunocytochimie proche infrarouge avec balayage haute résolution offre des avantages. L’autofluorescence dans le tissu cérébral est réduite dans la gamme proche infrarouge, des mesures semi-quantitatives de l’expression protéique peuvent être obtenues, l’expression de deux protéines dans la même région cérébrale peut être obtenue, et les images du dosage peuvent être stockées indéfiniment. Lorsqu’il est couplé avec la bonne protéine et/ou la méthode statistique, cette technique peut être utilisée pour examiner l’expression des protéines, l’activité neuronale, la signalisation moléculaire et la connectivité fonctionnelle dans le cerveau.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La recherche dans ce rapport a été financée par une subvention cible de la NIGMS (1P20GM103653) attribuée à DK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
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