Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

استخدام الاشعه تحت الحمراء القريبة والمسح عاليه الدقة لقياس تعبير البروتين في الدماغ القوارض

doi: 10.3791/59685 Published: May 23, 2019

Summary

هنا ، ونحن نقدم بروتوكول يستخدم الاصباغ الاشعه تحت الحمراء القريبة بالاقتران مع المسح الضوئي مناعي وعاليه الدقة لفحص البروتينات في مناطق الدماغ.

Abstract

العلوم العصبية هي دراسة كيفيه توسط الخلايا في الدماغ وظائف مختلفه. قياس تعبير البروتين في الخلايا العصبية والخلايا الدبقيه أمر بالغ الاهميه لدراسة علوم الأعصاب كما يتم تحديد وظيفة الخلوية من قبل تكوين ونشاط البروتينات الخلوية. في هذه المقالة ، ونحن وصف كيف يمكن الجمع بين المناعية الكيمياء مع الاشعه تحت الحمراء القريبة من المسح الضوئي عاليه الدقة لتوفير قياس شبه كمي من التعبير البروتين في مناطق الدماغ متميزة. ويمكن استخدام هذه التقنية للتعبير البروتين واحد أو مزدوج في نفس المنطقة الدماغ. يمكن استخدام قياس البروتينات بهذه الطريقة للحصول علي تغيير نسبي في تعبير البروتين مع التلاعب التجريبي ، والتوقيع الجزيئي للتعلم والذاكرة ، والنشاط في المسارات الجزيئية ، والنشاط العصبي في مناطق الدماغ المتعددة. باستخدام البروتينات الصحيحة والتحليل الإحصائي ، يمكن تحديد الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ أيضا. ونظرا لسهوله تنفيذ الكيمياء المناعية في المختبر ، فان استخدام المناعة المناعية مع المسح الضوئي العالي الدقة بالاشعه تحت الحمراء يمكن ان يوسع من قدره الأعصاب علي فحص العمليات البيولوجية العصبية علي مستوي الانظمه.

Introduction

الدراسة من العلوم العصبية تتعلق بالتحقيق في كيفيه الخلايا في الدماغ توسط وظائف محدده1. هذه يمكن ان تكون الخلوية في الطبيعة مثل كيفيه الخلايا التي تمنح الحصانة في الجهاز العصبي المركزي أو يمكن ان تنطوي علي التجارب التي تهدف إلى شرح كيفيه نشاط الخلايا العصبية في الحصين الظهري يؤدي إلى الملاحة المكانية. بمعني واسع ، يتم تحديد وظيفة الخلوية من قبل البروتينات التي يتم التعبير عنها في خليه ونشاط هذه البروتينات2. ونتيجة لذلك ، فان قياس التعبير و/أو نشاط البروتينات في خلايا المخ أمر بالغ الاهميه لدراسة العلوم العصبية.

وهناك عدد من التقنيات المتاحة لقياس التعبير البروتين في الدماغ. وتشمل هذه الأساليب في الكائنات المجرية مثل التضاريس الانبعاثات بوزيترون لكثافة مستقبلات3 والصغرى-غسيل الكلي للببتيدات الصغيرة4. أكثر شيوعا ، وتستخدم أساليب الجسم الآخر لفحص وظيفة البروتين والتعبير. وتشمل هذه التقنيات الطيف الكتلي5، وصمه عار الغربية والانزيم المرتبطة المقايسة المناعية (اليسا)6، والمناعية الكيمياء7. ويستخدم علي نطاق واسع في مجال الكيمياء العصبية المناعية. وينطوي هذا الأسلوب علي استخدام الأجسام المضادة الاساسيه للكشف عن البروتين (أو مستضد) الفائدة (مثلا ، c-Fos) والأجسام المضادة الثانوية المترافقة للكشف عن مجمع الأجسام المضادة للبروتين الأساسي (الشكل 1). لتمكين الكشف عن الأجسام المضادة البروتين-الاساسيه-مجمع الأجسام المضادة الثانوية ، والأجسام المضادة الثانوية لديها عوامل مؤكسده مثل البيروكسيداز الفجل (التي) مترافق لهم. وهذا يسمح لتشكيل الرواسب في الخلايا التي يمكن الكشف عنها باستخدام المجهر الضوئي7. الأجسام المضادة الثانوية يمكن أيضا ان يكون المواد الكيميائية يتالق مترافق لهم (اي الفلوروبيورس). عندما تحفز هذه المواد الكيميائية تنبعث منها الضوء ، والتي يمكن استخدامها للكشف عن البروتين-المضادات الاساسيه-مجمعات الأجسام المضادة الثانوية7. وأخيرا ، في بعض الأحيان الأجسام المضادة الاوليه لديها عوامل الحد والمواد الكيميائية مضان الملحقة بها السلبية مباشره الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية7 (الشكل 1).

ومن المثير للاهتمام ، العديد من الأساليب المناعية تسمح لتصور البروتينات في خلايا المخ ، ولكن ليس القدرة علي قياس كميه البروتين في خليه معينه أو منطقه الدماغ. استخدام المجهر الضوئي للكشف عن الرواسب من ردود الفعل الحد يسمح لتصور الخلايا العصبية والخلايا الأخرى ، ولكن هذا الأسلوب لا يمكن استخدامها لقياس التعبير البروتين في الزنزانات أو في منطقه الدماغ محدده. من الناحية النظرية ، يمكن استخدام المجهر الفلوري لهذا ، لان الضوء المنبعث من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية هو مقياس للأجسام المضادة للبروتين الاوليه-مجمع الأجسام المضادة الثانوية. ومع ذلك ، فان الفلورية في انسجه المخ يمكن ان تجعل من الصعب استخدام المجهر الفلوري لقياس التعبير البروتين في انسجه المخ8. ونتيجة لذلك ، نادرا ما يستخدم الضوء المنبعث من الصور الفلورية لأنسجه المخ لقياس تعبير البروتين في الدماغ.

يمكن معالجه العديد من هذه القضايا باستخدام الاشعه تحت الحمراء شبه الكيميائية بالتزامن مع المسح الضوئي عاليه الدقة9,10. في هذه المقالة ، ونحن وصف كيف المناعية الكيميائية إلى جانب فلوبهورس في أطياف الانبعاثات شبه الاشعه تحت الحمراء يمكن الجمع بين المسح الضوئي عاليه الدقة (علي سبيل المثال ، 10-21 μm) للحصول علي الصور الحاده التي تسمح للقياس الكمي نصف البروتين في متميزة مناطق الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة علي البروتوكول التالي من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي (IACUC) في جامعه ديلاوير. ذكرت [سبرغ] [ددلي] فيران تقريبا 55-75 أيام قديمه كان استعملت ل هذا بروتوكول.

1. استخراج المخ واعداد الانسجه

  1. تخدير الفئران مع ايزوفلونان في غرفه الحث التخدير حتى الفئران لم يعد يسلك استجابه لقرصه القدم.
  2. التضحية الفئران عن طريق قطع الراس السريع باستخدام المقصلة.
  3. قطع الجلد علي الجمجمة الخلفي إلى الامامي وواضح من اعلي الجمجمة.
  4. استخدام رونجيورس لأزاله بعناية الجزء الخلفي من الجمجمة ، ومن ثم استخدام مقص تشريح الصغيرة خفض خط الوسط من الجمجمة ، ودفع التصاعدي ضد الجزء العلوي من الجمجمة في جميع الأوقات لتجنب اتلاف انسجه المخ.
  5. استخدام رونجيورس لقشر بعيدا اليمين واليسار نصف الجمجمة لفضح الدماغ.
  6. استخدام ملعقة صغيره لمغرفة تحت الدماغ وقطع الأعصاب ، ورفع بعناية الدماغ وتجميد العقول في نظير المبردة علي الجليد الجاف (علي الأقل-20 درجه مئوية). بعد ذلك, تخزين العقول في 80 درجه مئوية الفريزر حتى تقطيع.
  7. شريحة العقول في مناطق الفائدة في 30-50 μm في التبريد المحافظة بين-9 درجه مئوية و-12 درجه مئوية. مباشره جبل شرائح علي الشرائح الزجاجية وتخزينها في 80 درجه مئوية الفريزر حتى وقت فحص الكيمياء المناعية.
    ملاحظه: في هذا البروتوكول الدماغ المناطق التي تهم الحصين واللوزة.

2. رد فعل واحد مناعي

ملاحظه: لرد فعل مزدوج مناعي ، والبروتوكول هو نفسه رد فعل مناعي واحد باستثناء هذا التفاعل لديه اثنين من الأجسام المضادة الاساسيه للمضيفين مختلفه (علي سبيل المثال ، الأرنب والفار) واثنين من الأجسام المضادة الثانوية لل المقابلة ينبغي ان تكون الانتخابات التمهيدية من مضيف واحد (علي سبيل المثال ، انتيرابيت الماعز والماعز المضادة). يجب ان تكون الأجسام المضادة الثانوية أيضا من اثنين من أطياف مختلفه متوفرة في الماسحات الضوئية عاليه الدقة. علي سبيل المثال ، واحد الأجسام المضادة الثانوية مع ذروه الانبعاثات في 680 نانومتر وواحد الأجسام المضادة الثانوية 800CW (ذروه الانبعاثات في 780 نانومتر).

  1. أزاله الشرائح الزجاجية من الفريزر والسماح لتتوازن إلى درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه.
  2. تحت غطاء الدخان, إصلاح انسجه المخ في 4% بارافورمالدهيد في 0.1 M الفوسفات مخزنه المالحة (الخدمات التلفزيونية الخاصة) ل 1 − 2 ح في درجه حرارة الغرفة.
  3. شطف الشرائح في 0.1 M تريس مخزنه المالحة (TBS) ثلاث مرات لمده 10 دقيقه لكل منهما. يتخلل اغشيه الخلايا من خلال احتضان الشرائح في المنظفات معتدل (علي سبيل المثال ، 0.01 ٪ المنظفات) لمده 30 − 60 دقيقه.
  4. شطف الشرائح في TBS ثلاث مرات لمده 15 دقيقه لكل منهما.
  5. تمييع الأجسام المضادة الاساسيه للبروتين الفائدة في التركيز الصحيح. علي سبيل المثال ، للكشف عن الجينات المبكرة الفورية ج-فوس ، واعداد أرنب الابتدائي مكافحه c-فوس الأجسام المضادة في تركيز 1:500.
  6. محلول الأضداد الاساسيه ماصه مباشره علي انسجه المخ (حوالي 200 μL لكل 3 بوصه × 1 بوصه الشريحة).
  7. استخدام الشفتين لاحتضان انسجه المخ علي الشرائح الزجاجية في تخفيف الأجسام المضادة الاوليه لمده 1 − 2 ح في درجه حرارة الغرفة أو بين عشيه وضحيها (~ 17 ساعة) في 4 درجه مئوية.
  8. أزاله الشفتين وغسل الشرائح في TBS التي لديها كميه صغيره من المنظفات المضافة اليها (علي سبيل المثال ، 0.01 ٪ المنظفات ، "TBS-T") أربع مرات لمده 15 دقيقه لكل منهما.
  9. استخدام الشفتين لاحتضان أقسام الدماغ في الأجسام المضادة الثانوية في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة.
    ملاحظه: الأجسام المضادة الثانوية يجب ان تكون إلى التخفيف الصحيح وفي مخفف التي تحتوي علي TBS ، والمنظفات ، و 1.5 ٪ من المصل المضيف. علي سبيل المثال ، فان الأجسام المضادة الثانوية الماعز في تخفيف 1:2000 تحتوي علي 1.5 ٪ مصل الماعز و 0.05 ٪ المنظفات.
  10. شطف الشرائح في TBS-T أربع مرات لمده 20 دقيقه لكل منهما ، ومن ثم في TBS أربع مرات لمده 20 دقيقه لكل منهما.
  11. الشرائح الجافة في درجه حرارة الغرفة في الظلام بين عشيه وضحيها. عندما تكون الشرائح جافه ، فهي جاهزه للتصوير.

3-التصوير

  1. ضع الشرائح علي واجهه المسح بالاشعه تحت الحمراء القريبة مع الانسجه التي تواجه الأسفل. اما صوره شريحة زجاجيه واحده أو شرائح متعددة في كل مره باستخدام أداه تحديد.
  2. الشرائح الصورة باستخدام اعداد اعلي مستوي من الجودة مع أزاحه من 0 نانومتر وقرار من 21 μm. وعاده ما يستغرق المسح الضوئي من 13 − 19 ساعة اعتمادا علي معدات المسح المستخدمة.
  3. استيراد الصور إلى برنامج تحليل الصور (علي سبيل المثال ، ImageStudio) لعرض ووضع علامة لتحليل البروتين شبه الكمي.

4. تحليل البروتين التعبير

  1. افتح برنامج تحليل الصور وحدد منطقه العمل التي تم مسح الصورة منها.
  2. افتح الصورة الممسوحة ضوئيا في برنامج تحليل الصور لعرض المسح الضوئي ، واضبط الأطوال الموجية التي يتم عرضها ، بالاضافه إلى التباين والسطوع والتكبير المعروض دون تغيير الصورة الاوليه أو الانبعاث الكمي الإجمالي.
  3. تحديد المناطق الرئيسية للقياس الكمي وحدد علامة التبويب التحليل علي طول الأعلى من الصفحة ، ثم حدد رسم مستطيل (أو رسم القطع الناقص /رسم اليدالحرة) لرسم مستطيل علي المنطقة التي سيتم تحديدها كميا.
  4. لعرض حجم المستطيل ، حدد الاشكال علي طول الجزء السفلي الأيسر من الشاشة ، ثم حدد الاعمده الموجودة أسفل اليمين. أضافه أعمده الارتفاع والعرض للتعرف علي حجم الشكل.
    ملاحظه: من المهم التحكم في حجم الشكل عند مقارنه القياس الكمي. من المستحسن استخدام الاشكال المتطابقة الموضوعة ضمن الموقع الكمي المطلوب ، من أجل الحصول علي عينه دقيقه من الانبعاثات لتلك المنطقة.
  5. ثم اسم الشكل وكرر. وبمجرد ان يتم أخذ عينات من جميع المناطق ، يمكن تجميع البيانات المتوفرة من علامة تبويب الاعمده وتحليلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قبل استخدام المسح الضوئي عالي الدقة لمناعي ، يجب التحقق من ان البروتوكول يعمل. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام فحص التحقق من الصحة حيث يتم احتضان أقسام المخ من نفس الحيواني مع الأجسام المضادة الاوليه والثانوية ، والأجسام المضادة الثانوية وحدها ، أو لا الأجسام المضادة الاوليه ولا الثانوية. وترد نتائج هذا الفحص في الشكل 2. في رد الفعل هذا كنا الكشف عن الجينات المبكرة الفورية c-يونيو في الحصين الظهري واللوزة. لم يلاحظ التعبير C-Jun الا عندما تم تطبيق الأجسام المضادة الاساسيه والثانوية علي انسجه المخ.

الشكل 3 يظهر الكشف عن البروتين المزدوج في نوى اللوزة. وفي هذه التجربة ، قمنا بتهدئة الوحدة الفرعية الGluR1ه لمستقبلات حمض α-امينو-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيسوكسازوليبروبيونيك (امبا) والوحدة الفرعية الNR2Aه لمستقبلات N-ميثيل-د-اسبارتات (NMDA) في نفس انسجه المخ. وهذا يسمح لنا لدراسة نسبه المستقبلات امبا/NMDA في النوى الفرعية من اللوزة. هذه النسبة هي توقيع البيولوجيا العصبية للتعلم والذاكرة11,12. كما يمكن ان يري في الشكل 3، اشاره ل GluR2 (780 nm ضوء الزائفة الملونة باللون الأخضر) و NR2A (680 nm ضوء الزائفة الملونة باللون الأحمر) لا يمكن الا ان يلاحظ في انسجه المخ التي تعرضت للأجسام المضادة الاساسيه والثانوية.

يبين الشكل 4 كيف يمكن الحصول علي القياسات المتوسطة والمعيارية للتعبير عن البروتين من المسح عالي الدقة في الحصين البطني. باستخدام برنامج تحليل الصور ، يتم وضع مستطيل في منطقه الاهتمام (الطبقة الجزيئية من CA1) ويعني كثافة الضوء من الشكل يمكن استخدامها كمقياس للتعبير فلوكوفيري (الشكل 4A). في المقابل ، وهذا هو مقياس للتعبير عن البروتين (اي الأجسام المضادة الاوليه مستضد-مجمع الأجسام المضادة الثانوية). ويمكن أيضا وضع الشكل عبر المنطقة التي تعبر عن اشاره عاليه واشاره منخفضه للحصول علي منحني تطبيع (الشكل 4B). في هذا المثال ، تم وضع مستطيل عبر الطبقة الجزيئية من CA1 ، ولكنه غطي الحقول الجذعية أيضا ، والتي لم تعبر عن كميات كبيره من سي-جون في هذا الفحص. ويمكن بعد ذلك استخدام المنطقة تحت المنحني كمقياس للتعبير عن البروتين. إذا كان الاعداد في التجربة ينطوي علي مجموعات العلاج (علي سبيل المثال ، التعرض للإجهاد) وعنصر تحكم ، يمكن الحصول علي التغيرات النسبية في تعبير البروتين في الدماغ.

Figure 1
الشكل 1 : توضيح لرد الفعل مناعي باستخدامالأجسام المضادة الاوليه (1 st) والثانوية (2الثانية) أو الأجسام المضادةالاساسيه فقط. الدوائر السوداء المملوءة تمثل التسمية ، والتي يمكن ان تكون عامل مؤكسد مثل البيروكسيديز الفجل أو فلوفيمور مثل البورون-ديبيرروماثيني (BODIPY). المربعات الخضراء تمثل مستضد (علي البروتين من الفائدة) يجري الكشف عنها في رد فعل مناعي.

Figure 2
الشكل 2 : صور لفحص التحقق من الصحة للكشف عن c-يونيو. في هذا الفحص ، تم التعامل مع الانسجه من نفس الحيوانية مع الأجسام المضادة الرئيسية أرنب التي تعترف c-يونيو والمضادة الماعز المضادة الأرانب الثانوية مع فلوروكوفيري المرفقة مع الانبعاثات في 780 nm (الزائفة الملونة في الأخضر ، لوحه اليسار). تم التعامل مع الانسجه المجاورة اما مع الأجسام المضادة الثانوية وحدها (اللوحة الوسطي) أو لا الأجسام المضادة (اللوحة اليمني). شريط مقياس = 1 ملم.

Figure 3
الشكل 3 : فحص التحقق من الصحة لوضع العلامات المزدوجة رد فعل مناعي في اللوزة. وقد تعرضت مقاطع الدماغ ثلاثي التوائم من نفس الجرذ اما إلى الأجسام المضادة الأرنب التي تعترف GluR1 والأجسام المضادة الماوس التي تعترف NR2A (ألواح اليسرى) ، الأجسام المضادة الثانوية (ألواح الوسطي) ، أو لا الأجسام المضادة (اللوحات اليمني). وقد تم تصور GlurR1 مع الماعز مكافحه الأرانب 800CW الأجسام المضادة الثانوية (780 nm ، الزائفة الملونة في اللون الأخضر) و NR2A وكان تصور باستخدام المضادة المضادة الماعز 680 RD الأضداد الثانوية (680 nm ، الزائفة الملونة باللون الأحمر). شريط مقياس = 1 مم. ot = المسالك البصرية; ic = كبسوله الداخلية ؛ ec = كبسوله خارجيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 : الحصول علي تدابير شبه كميه للتعبير عن البروتين في انسجه المخ. (A و B) لقطات من الصور المسجلة في برنامج تحليل الصور التي يتم استخدامها لتحليل الصور من الماسح الضوئي. الانسجه كانت من الحصين البطني وتعاملت لتصور سي-جون  يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تظهر النتائج المعروضة في هذه المقالة انه يمكن استخدام الخلايا المناعية القريبة من الاشعه تحت الحمراء في تركيبه مع المسح الضوئي عالي الدقة للحصول علي مقاييس شبه كميه لتعبير البروتين في انسجه المخ. ويمكن أيضا ان تستخدم لتسميه اثنين من البروتينات في وقت واحد في نفس المنطقة الدماغ. وقد استخدمنا سابقا بالقرب من الاشعه تحت الحمراء مناعي لقياس التعبير الجيني المبكر الفوري في مناطق الدماغ متعددة9,10. يمكن استخدام الجينات المبكرة الفورية كمقياس للنشاط العصبي. كما أخضعنا هذه المقاييس شبه الكمية للتعبير عن البروتين للتحليلات الاحصائيه التي سمحت لنا بتجميع مناطق المخ مع مستويات مترابطة من الجينات المبكرة الفورية (IEGs). استخدمنا هذا كمقياس للتوصيل الوظيفي لفحص كيفيه تاثير الإجهاد علي الاتصال الوظيفي بين العقد داخل دائره الخوف اثناء التعلم العاطفي والذاكرة9,10. وأظهرنا كيف النسب امبا/NMDA (توقيع التعلم والذاكرة) يمكن قياس باستخدام الاشعه تحت الحمراء المناعية بالقرب من الكيمياء مع دقه عاليه المسح الضوئي13. ويمكن استخدام تقنيه مماثله لقياس عموم والبروتينات فوسفوسو لتحديد الإشارات الجزيئية. هذا أنجزت يستعمل لطخه غربيه14. ومع ذلك ، وهذا يتطلب تشريح مناطق الدماغ من شرائح الدماغ سميكه وليس قابلا للمناطق الدماغ الصغيرة. يمكن التحايل علي هذه المشكلة باستخدام الشبه الاشعه تحت الحمراء الكيمياء المناعية مع المسح الضوئي عاليه الدقة. وأخيرا ، يتم ترقيم جميع الصور المناعية الكيمياء ، والذي يسمح للتخزين غير محدود ومريحه أعاده تحليل الاختبارات السابقة.

كما هو الآن مع جميع الطرق هناك عيوب. لا يوجد التكبير في الماسحات الضوئية عاليه الدقة وعلاج الانسجه لا يسمح بسهوله لسبر باستخدام التقنيات المجهرية مضان. حتى أخذ شرائح بديله من الدماغ قد لا تعمل ، لان المجهر البؤري قد تعمل بشكل أفضل في انسجه المخ perfused مستخدمه ، ولكن التصوير بالاشعه تحت الحمراء القريبة مع المسح الضوئي عاليه الدقة يتم عاده علي العقول المجمدة فلاش. التعبير عن البروتين في الخلايا العصبية المحددة (علي سبيل المثال ، العصبية البينية مقابل الأعصاب الهرمية) أو أنواع مختلفه من الخلية في الدماغ (علي سبيل المثال ، الخلايا العصبية مقابل الدليا) لا يمكن تحديدها باستخدام شبه الاشعه تحت الحمراء المناعية مع المسح عاليه الدقة. اجراء اختبارات التحقق من الصحة أمر بالغ الاهميه لان هذا لا يزال طريقه جديده نسبيا لفحص التعبير البروتين في انسجه المخ.

عند استخدامها بشكل مناسب ، الاشعه تحت الحمراء المناعية بالقرب من الكيمياء مع المسح الضوئي عاليه الدقة يوفر مزايا. يتم تقليل الفلورية في انسجه المخ في نطاق الاشعه تحت الحمراء القريبة ، ويمكن الحصول علي المقاييس شبه الكمية للتعبير البروتين ، والتعبير عن اثنين من البروتينات في نفس المنطقة الدماغ يمكن الحصول عليها ، ويمكن تخزين الصور من الفحص إلى أجل غير مسمي. عندما يقترن البروتين الصحيح و/أو الطريقة الاحصائيه يمكن استخدام هذه التقنية لفحص تعبير البروتين ، والنشاط العصبي ، والإشارات الجزيئية ، والاتصال الوظيفي داخل الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل البحث في هذا التقرير من قبل منحه الهدف من NIGMS (1P20GM103653) منح إلى DK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Extraction
Anesthesia Induction Chamber Kent Scientific VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine Harvard Apparatus 73-1920
Friedman Rongeur Fine Science Tools 16000-14 used to remove back of skull
Delicate Dissecting Scissors Fischer Scientific 08-951-5 used to cut upward along midline of skull
Micro Spatula Fischer Scientific 21-401-5 used to scoop out brain
Glass Microscope Slides Fischer Scientific 12-549-6
Immunohistochemical Reaction
 Triton X-100 Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody 
Tween-20 Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scanner Licor Biotechnology Inc.
Image Studio Licor Biotechnology Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kandel, E. R. Principles of Neural Science. McGraw Hill. New York. (2013).
  2. Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. Academic Press/Elsevier. (2009).
  3. Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. (2018).
  4. Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20, (1), 229-239 (2004).
  5. English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
  6. David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
  7. Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. (2010).
  8. Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197, (1), 48-55 (2011).
  9. Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
  10. Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23, (12), 689-698 (2016).
  11. Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
  12. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511, (7509), 348-352 (2014).
  13. Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, (2018).
  14. Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75, (2), 130-137 (2013).
استخدام الاشعه تحت الحمراء القريبة والمسح عاليه الدقة لقياس تعبير البروتين في الدماغ القوارض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kimmelmann-Shultz, B., Mohmammadmirzaei, N., Caplan, J., Knox, D. Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59685, doi:10.3791/59685 (2019).More

Kimmelmann-Shultz, B., Mohmammadmirzaei, N., Caplan, J., Knox, D. Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59685, doi:10.3791/59685 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter