Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 使用近红外染料结合免疫组织化学和高分辨率扫描来检测大脑区域的蛋白质。
Abstract
神经科学是研究大脑中的细胞如何调节各种功能的研究。测量神经元和胶质细胞中的蛋白质表达对于神经科学的研究至关重要, 因为细胞功能是由细胞蛋白的组成和活性决定的。在本文中, 我们描述了免疫细胞化学如何可以结合近红外高分辨率扫描, 以提供在不同的大脑区域的蛋白质表达的半定量测量。这项技术可用于同一大脑区域的单蛋白或双蛋白表达。用这种方式测量蛋白质可以通过实验操作、学习和记忆的分子特征、分子途径中的活动以及多个大脑区域的神经活动来获得蛋白质表达的相对变化。通过正确的蛋白质和统计分析, 也可以确定大脑区域之间的功能连接。鉴于在实验室实施免疫细胞化学很容易, 使用具有近红外高分辨率扫描的免疫细胞化学可以扩大神经学家在系统层面检查神经生物学过程的能力。
Introduction
神经科学的研究涉及对大脑中细胞如何介导特定功能的研究 1。这些可能是细胞性质的, 例如胶质细胞如何在中枢神经系统中赋予免疫, 或者可能涉及旨在解释海马背侧神经元的活动如何导致空间导航的实验。从广义上讲, 细胞功能是由细胞中表达的蛋白质和这些蛋白质的活性2决定的。因此, 测量脑细胞中蛋白质的表达和活性对于神经科学的研究至关重要。
有许多技术可以用来测量大脑中的蛋白质表达。这些方法包括体内方法, 如受体密度为 3的正电子发射地形和小肽4的微透析。更常见的是, 体外方法被用来检查蛋白质的功能和表达。其中包括质谱技术5、西方印迹和酶联免疫吸附法 (elisa)6和免疫细胞化学7。免疫细胞化学在神经科学领域得到了广泛的应用。这项技术涉及使用初级抗体检测感兴趣的蛋白质 (或抗原) (例如 c-Fos) 和共轭二级抗体来检测蛋白质-初级抗体复合物 (图 1)。为了能够检测蛋白-初级抗体-二级抗体复合物, 二级抗体具有氧化剂, 如辣根过氧化物酶 (HRP) 结合到它们。这样就可以在细胞中形成沉淀物, 可以使用光学显微镜7检测到。继发性抗体也可以使化学物质与之结合在一起 (即荧光)。当受到刺激时, 这些化学物质会发光, 可用于检测蛋白质原代抗体-二级抗体复合物 7。最后, 有时初级抗体具有还原剂和荧光化学物质, 直接否定了对二级抗体的需求 ( 图 1)。
有趣的是, 许多免疫细胞化学方法允许对脑细胞中的蛋白质进行可视化, 但不能量化特定细胞或大脑区域中的蛋白质含量。使用光显微镜检测减少反应的沉淀物可以显示神经元和胶质细胞, 但这种方法不能用于量化蛋白质在细胞或特定大脑区域的表达。从理论上讲, 荧光显微镜可以用于这一点, 因为荧光二级抗体发出的光是对蛋白质-初级抗体-二级抗体复合物的测量。然而, 脑组织中的自体荧光可能会使使用荧光显微镜来量化脑组织中的蛋白质表达。因此, 脑组织荧光图像发出的光很少被用来量化大脑中的蛋白质表达。
其中许多问题可以通过近红外免疫细胞化学与高分辨率扫描9,10一起解决。在本文中, 我们描述了如何免疫细胞化学结合近红外发射光谱中的荧光, 可以结合高分辨率扫描 (例如, 10–21μm), 以获得清晰的图像, 允许在不同的蛋白质半定量大脑区域。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
以下议定书得到了特拉华州大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。大约55-75天大的雄性 Sprague Dawley 大鼠被用于该方案。
1. 脑摘除和组织准备
- 将大鼠在麻醉诱导室中使用异氟烷, 直到大鼠不再对脚夹紧有反应。
- 用断头台通过快速斩首来牺牲老鼠。
- 将头骨的皮肤切割到前部, 从头骨顶部清除。
- 使用公语仔细地取出头骨的后部, 然后使用小解剖剪刀剪下头骨的中线, 在任何时候向上推到头骨顶部, 以避免损害脑组织。
- 用无赖剥去右半部头骨, 露出大脑。
- 使用一个小铲子挖出大脑和切断神经, 小心地抬起大脑, 冻结在在干冰 (至少-20°C) 冰凉的异戊烷中的大脑。在此之后, 将大脑存放在-80°c 的冰柜中, 直到切片。
- 将感兴趣区域的大脑切成30–50微米, 在-9°c 至-12°c 之间保持的低温恒温器中。将切片直接安装在玻璃幻灯片上, 并存放在-80°c 的冰柜中, 直到进行免疫细胞化学检测。
请注意:在这个协议中, 感兴趣的大脑区域是海马体和杏仁核。
2. 单次免疫组化反应
请注意:对于双免疫组化反应, 该方案与单一免疫组化反应相同, 但这种反应有两种不同宿主的原生抗体 (如兔子和小鼠), 两种二级抗体为相应的初选应该来自一个单一的主机 (例如, 山羊抗兔子和山羊的反鼠)。二次抗体还必须来自高分辨率扫描仪中的两种不同光谱。例如, 一个具有 680 nm 的发射光谱峰值的二级抗体和一个在 780 nm 时的二级抗体 800CW (发射光谱峰值为 780 nm)。
- 从冰柜中取出玻璃滑梯, 使其平衡至室温30分钟。
- 在通风罩下, 将4% 的二聚甲醛固定在室温下1-2小时的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。
- 在 0.1 M tris 缓冲盐水 (TBS) 中冲洗滑块三次, 每次10分钟。通过在温和的洗涤剂 (如0.01% 的洗涤剂) 中孵育滑块, 使细胞膜渗透30-60分钟。
- 在 TBS 中冲洗幻灯片三次, 每次15分钟。
- 稀释 PBS 中感兴趣的蛋白质的原代抗体在正确的浓度。例如, 要检测立即早期基因 c-Fos, 请在浓度为1:500 的情况下制备兔初级抗 c-Fos 抗体。
- 移液器的主要抗体溶液直接进入脑组织 (约每3英寸 X1 英寸幻灯片 200μl)。
- 在室温下进行1-2小时的初级抗体稀释, 或在4°C 下隔夜 (~ 17小时), 使用覆盖片在玻璃滑块上孵育脑组织。
- 在 TBS 中取出盖板并清洗幻灯片, tbs 中添加了少量洗涤剂 (例如, 0.01% 的洗涤剂, "TBS-T"), 每次 4次, 每次15分钟。
- 使用盖板在室温下孵育二级抗体中的大脑部分2小时。
请注意:第二抗体必须是正确稀释和稀释剂含有 TBS, 洗涤剂, 和1.5% 的宿主血清。例如, 山羊二级抗体在稀释1:2000 中将含有1.5% 的山羊血清和0.05% 的洗涤剂。 - 在 TBS-T 中冲洗幻灯片 4次, 每次 20分钟, 然后在 TBS 中冲洗 4次, 每次20分钟。
- 在室温下连夜干滑块。当幻灯片干燥时, 它们就可以进行成像了。
3. 成像
- 将幻灯片放置在近红外扫描界面上, 组织朝下。使用选择工具一次拍摄一张玻璃幻灯片或多张幻灯片。
- 图像幻灯片使用最高质量设置, 偏移量为 0 nm, 分辨率为21μm。扫描通常需要 13-19小时, 具体取决于所使用的扫描设备。
- 将图像导入到图像分析软件 (例如, ImageStudio) 中, 以查看和标记半定量蛋白质分析。
4. 蛋白质表达分析
- 打开图像分析软件, 然后选择扫描图像的工作区。
- 在图像分析软件中打开扫描图像以查看扫描, 并调整查看的波长, 以及显示的对比度、亮度和放大倍率, 而不改变原始图像或总量化发射。
- 确定要量化的关键区域, 然后选择页面顶部的"分析" 选项卡, 然后选择 "绘制矩形" (或"手绘"/"手绘"), 在要量化的区域上绘制一个矩形。
- 若要查看矩形的大小, 请选择屏幕左下角的"形状" , 然后选择右下角的"列" 。添加"高度"和"宽度"列, 以标识形状大小。
请注意:在比较定量时, 控制形状大小是非常重要的。建议使用放置在所需量化位置内的相同形状, 以便准确地采样该区域的排放量。 - 然后命名形状并重复。对所有区域进行采样后, 可以聚合和分析列选项卡中可用的数据。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在使用高分辨率扫描进行免疫组织化学之前, 应验证该协议是否有效。这可以通过验证分析来实现, 在这种方法中, 来自同一动物的大脑部分用原生和二级抗体、二级抗体单独培养, 或者既不存在原发抗体, 也不使用二级抗体。这种验证分析的结果如图 2所示。在这个反应中, 我们检测到了海马背侧和杏仁核的直接早期基因 c-Jun。只有当一次和二级抗体应用于脑组织时, 才观察到 C-Jun 的表达。
图 3显示了杏仁核的双重蛋白质检测。在这个实验中, 我们检测了 glur1 亚基α-氨基-3-羟基-5-4-异恶唑丙酸 (AMPA) 受体和 NR2A 亚基 n-甲基-d-天冬氨酸受体 (NMDA) 受体在同一脑组织。这使我们能够检查杏仁核亚核中 AMPA\ nmda 受体的比例。这个比例是学习和记忆的神经生物学特征11,12。如图 3所示, 只有在接触原发和继发抗体的脑组织中才能观察到 GluR2 (780 纳米浅的绿色假色) 和 NR2A (680 nm 浅假红色) 的信号。
图 4显示了如何从腹侧海马的高分辨率扫描中获得蛋白质表达的平均值和归一化指标。使用图像分析软件, 在感兴趣的区域 (CA1 的分子层) 放置一个矩形, 并且形状的平均光强可用作荧光表达的测量 (图 4 a)。反过来, 这是蛋白质表达的测量 (即抗原-初级抗体-二级抗体复合物)。该形状还可以放置在表示高信号和低信号的区域中, 以获得归一化曲线 (图 4b)。在本例中, 一个矩形被放置在 CA1 的分子层上, 但也覆盖了树突领域, 这在这个检测中没有表达大量的 c-Jun。然后, 曲线下的区域可以用来衡量蛋白质的表达。如果实验中的设置涉及治疗组 (例如, 压力暴露) 和控制, 则可以获得大脑中蛋白质表达的相对变化。
图 1: 使用原代 (1)和二级 (第2个) 抗体或仅仅是原代抗体的免疫组化反应的说明。填充的黑眼圈代表一个标签, 它可以是一种氧化剂, 如辣根过氧化物酶, 也可以是含氟的, 如硼-二吡咯烷酮 (BODY py)。绿色方块代表在免疫组化反应中检测到的抗原 (感兴趣的蛋白质)。
图 2: 用于检测 c-Jun 的验证分析的图像.在本试验中, 同一动物的组织接受了兔初级抗体的治疗, 该抗体识别 c-Jun 和山羊抗兔二级抗体, 并附着荧光体, 排放量为780纳米 (绿色假色, 左面板)。邻近的组织单独用二级抗体 (中间面板) 或无抗体 (右面板) 治疗。刻度杆 = 1 毫米。
图 3: 杏仁核中双重标记免疫组化反应的验证测定.同一只大鼠的大脑切片要么暴露于识别 GluR1 的兔子抗体和识别 NR2A (左面板)、二级抗体 (中间面板) 的小鼠抗体, 要么没有抗体 (右面板)。用山羊抗兔子800CW 二级抗体 (780 纳米, 绿色假色) 进行 GlurR1 可视化, 用山羊680RD 二级抗体 (680 nm, 假红色) 对 NR2A 进行可视化。刻度杆 = 1 毫米 ot = 光学道;ic = 内囊;ec = 外部胶囊。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 获得脑组织蛋白质表达的半定量测量.(A和b) 图像分析软件中的评分图像的屏幕截图, 用于分析扫描仪中的图像。组织来自腹侧海马体, 并进行治疗, 以显示 c-Jun。 请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本文的研究结果表明, 近红外免疫细胞化学结合高分辨率扫描可用于获得脑组织中蛋白质表达的半定量指标。它还可以用来在同一大脑区域同时标记两种蛋白质。我们以前用近红外免疫组织化学来测量多个大脑区域9、10 的直接早期基因表达。即时早期基因可以用来衡量神经活动。我们还将这些蛋白质表达的半定量指标进行了统计分析, 使我们能够对大脑区域进行分组, 并对直接早期基因 (Ieg) 的相关水平进行分组。我们使用它来衡量功能连接, 以检查在情感学习和记忆9, 10 期间, 压力如何影响恐惧电路中节点之间的功能连接。我们展示了如何使用高分辨率扫描13的近红外免疫细胞化学测量 ampaxnmda 比率 (学习和记忆的特征)。类似的技术可用于测量泛和磷蛋白, 以确定分子信号。这是用西方污点14 完成的。然而, 这需要从厚厚的大脑切片中解剖大脑区域, 不适合小的大脑区域。使用高分辨率扫描的近红外免疫细胞化学可以解决此问题。最后, 所有免疫细胞化学图像都进行了数字化处理, 从而可以无限存储, 并方便地重新分析以前的检测结果。
与所有方法一样, 也有缺点。高分辨率扫描仪中没有放大倍率, 对组织的处理不容易使用荧光显微镜技术进行探测。即使从大脑中取出交替切片也可能不起作用, 因为共聚焦显微镜可能最适用于灌注脑组织, 但具有高分辨率扫描的近红外成像通常是在闪光灯冷冻大脑上进行的。特定神经元 (如神经元间与锥体神经元) 或大脑中不同细胞类型 (如神经元与胶质细胞) 中的蛋白质表达无法使用高分辨率扫描的近红外免疫细胞化学来确定。进行验证检测至关重要, 因为这仍然是一种相对较新的检测脑组织中蛋白质表达的方法。
如果使用得当, 具有高分辨率扫描功能的近红外免疫细胞化学具有优势。脑组织中的自体荧光在近红外范围内减少, 可以获得蛋白质表达的半定量测量, 可以获得同一脑区两种蛋白质的表达, 并可无限期地存储检测图像。当与正确的蛋白质和/或统计方法配对时, 该技术可用于检查大脑内的蛋白质表达、神经活性、分子信号和功能连接。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本报告中的研究由 NIGMS 的目标赠款 (1P20GM103653) 资助, 授予 DK。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
