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Neuroscience

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

doi: 10.3791/59685 Published: May 23, 2019

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das nahezu infrarote Farbstoffe in Verbindung mit Immunhistochemie und hochauflösendem Scannen verwendet, um Proteine in Hirnregionen zu untersuchen.

Abstract

Neurowissenschaften ist die Studie, wie Zellen im Gehirn verschiedene Funktionen vermitteln. Die Messung der Proteinexpression in Neuronen und Glia ist für die Erforschung der Neurowissenschaft von entscheidender Bedeutung, da die zelluläre Funktion durch die Zusammensetzung und Aktivität zellulärer Proteine bestimmt wird. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Immunozytochemie mit dem Infrarot-hochauflösenden Scannen kombiniert werden kann, um eine halbquantitative Messung der Proteinexpression in unterschiedlichen Hirnregionen zu ermöglichen. Diese Technik kann für den Einzel-oder Doppelproteinausdruck in der gleichen Hirnregion verwendet werden. Die Messung von Proteinen auf diese Weise kann verwendet werden, um eine relative Veränderung des Proteinausdrucks mit einer experimentellen Manipulation, molekularer Signatur von Lernen und Gedächtnis, Aktivität in molekularen Wegen und neuronale Aktivität in mehreren Hirnregionen zu erreichen. Mit den richtigen Proteinen und statistischen Analysen kann auch die funktionelle Konnektivität zwischen Hirnregionen ermittelt werden. Angesichts der Leichtigkeit der Einführung der Immunozytochemie in einem Labor, die Verwendung von Immunozytochemie mit nahezu infraroten hochauflösenden Scannen kann die Fähigkeit der Neurowissenschaftler, neurobiologische Prozesse auf einer Systemebene zu untersuchen zu erweitern.

Introduction

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Die Studie der Neurowissenschaften betrifft eine Untersuchung, wie Zellen im Gehirnbestimmte Funktionen 1vermitteln. Diese können zellulärer Natur sein, wie zum Beispiel, wie Gliazellen Immunität im zentralen Nervensystem gewähren oder Experimente beinhalten, die erklären sollen, wie die Aktivität von Neuronen im dorsalen Hippocampus zu einer räumlichen Navigation führt. Im weitesten Sinne wird die zelluläre Funktion durch die Proteine bestimmt, die in einer Zelle ausgedrückt werden, und dieAktivität dieser Proteine 2. Daher ist die Messung des Ausdrucks und/oder Aktivität von Proteinen in Gehirnzellen entscheidend für die Untersuchung der Neurowissenschaften.

Eine Reihe von Techniken stehen zur Verfügung, um Proteinausdruck im Gehirn zu messen. Dazu gehören in vivo-Methoden wie Positronen-Emissionstopografie für Rezeptordichten 3 und Mikrodialyse für kleine Peptide4. Häufiger werden Ex-vivo-Methoden verwendet, um Proteinfunktion und-ausdruck zu untersuchen. Dazu gehören Massenspektrometrie-Techniken 5, Western Blot und enzym-verknüpfte immunsorbierende Assay(ELISA) 6, und Immunozytochemie7. Die Immunozytochemie ist im Bereich der Neurowissenschaften weit verbreitet. Bei dieser Technik wird ein primärer Antikörper verwendet, um ein Protein (oder Antigen) von Interesse zu erkennen (z.B. c-Fos) und einen konjugierten sekundären Antikörper, um den Protein-primären Antikörper-Komplex zu erkennen (Abbildung1). Um den Nachweis des protein-primären Antikörper-Sekundarkkomplexes zu ermöglichen, haben sekundäre Antikörper oxidierende Substanzen wie Meerrettiche Peroxidase (HRP), die ihnen konjugiert werden. Dies ermöglicht die Bildung von Niederschlägen in Zellen, die mit Lichtmikroskopie7erkannt werden können. Sekundäre Antikörper können auch Chemikalien haben, die fluoreszieren, um sie zu konjugieren (z.B. Fluorophore). Bei der Stimulierung stoßen diese Chemikalien Licht aus, mit dem Protein-primäre Antikörper-sekundäre Antikörper-Komplexe 7 erkannt werden können. Schließlich sind primäre Antikörper manchmal mit Reduktionsmitteln und Fluoreszenzchemikalien versehen, die direkt die Notwendigkeit von sekundären Antikörpern7 beeinträchtigen (Abbildung1).

Interessanterweise erlauben viele immunozytochemische Methoden die Visualisierung von Proteinen in Gehirnzellen, nicht aber die Fähigkeit, die Proteinmenge in einer bestimmten Zell-oder Hirnregion zu quantifizieren. Der Einsatz von Lichtmikroskopie zur Erkennung von Niederschlägen aus Reduktionsreaktionen ermöglicht die Visualisierung von Neuronen und Glia, aber diese Methode kann nicht verwendet werden, um Proteinexpression in Zellen oder in einer bestimmten Hirnregion zu quantifizieren. Theoretisch kann dafür die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, denn das Licht, das aus dem fluoreszierenden sekundären Antikörper emittiert wird, ist ein Maß für den proteinprimären Antikörper-Sekundenkomplex. Die Autofluoreszenz im Hirngewebe kann es jedoch schwierig machen, mit der Fluoreszenzmikroskopie die Proteinexpression im Hirngewebe 8zuquantifizieren. Daher wird Licht, das aus fluoreszierenden Bildern von Hirngewebe emittiert wird, nur selten zur Quantifizierung des Proteinausdrucks im Gehirn verwendet.

Viele dieser Probleme können mit Hilfe der Infrarot-Immunozytochemie in Verbindung mit hochauflösenden Scannenvon 9,10angegangenwerden. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Immunozytochemie in Verbindung mit Fluorophoren in den nahezu infrarotfarbenen Emissionsspektren mit hochauflösenden Scannen (z.B. 10 – 21 μm) kombiniert werden kann, um scharfe Bilder zu erhalten, die eine Halbquantifizierung des Proteins in unterschiedlichen Hirnregionen.

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Protocol

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Das folgende Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Delaware genehmigt. Männliche Sprague Dawley Ratten etwa 55 – 75 Tage alt wurden für dieses Protokoll verwendet.

1. Gehirnerschütterung und Zahnarztepräparation

  1. Anästhesie-Ratte mit Isoofluran in der Anästhesie-Induktionskammer, bis die Ratte keine Antwort mehr auf die Fußspinne ausweist.
  2. Opfere Ratten durch schnelle Enthaktung mit einer Guillotine.
  3. Die Haut auf den Schädel nach vorn nach vorn schneiden und von der Oberseite des Schädels entfernen.
  4. Verwenden Sie Rinnen, um sorgfältig zu entfernen, den hinteren Teil des Schädels, und dann mit kleinen zerkleinerten Schere abgeschnitten in der Mittellinie des Schädels, drücken nach oben gegen die Spitze des Schädels zu jeder Zeit, um zu vermeiden, dass das Hirngewebe.
  5. Verwenden Sie Rongeurs, um rechts und links die Hälfte des Schädels wegzuschalen, um das Gehirn zu entlarven.
  6. Verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um unter Gehirn und Schleiernerven zu schaufeln, vorsichtig das Gehirn zu heben und das Gehirn in Isodament zu kühlen auf Trockeneis (mindestens-20 ° C) zu frieren. Danach die Gehirne in einem Gefrierschrank von-80 ° C aufbewahren, bis sie geschnitten werden.
  7. Scheibenhirne in Weinregionen von Interesse bei 30 – 50 μm in einem Kryostat, der zwischen-9 ° C und-12 ° C gehalten wird. Leicht Scheiben auf Glasscheiben montieren und bis zur Zeit des Immunozytochemie-Sehs in einem Gefrierschrank von-80 ° C aufbewahren.
    NOTE: In diesem Protokoll waren Hirnregionen von Interesse, die Hippocampus und die Amygdala.

2. Einheitliche Immunhistochemische Reaktion

NOTE: Bei doppelter Immunhistochemie ist das Protokoll das gleiche wie die einzelne immunhistochemische Reaktion, mit Ausnahme dieser Reaktion haben zwei primäre Antikörper verschiedener Wirte (z.B. Kaninchen und Maus) und zwei sekundäre Antikörper für die entsprechenden Die Vorwahlen sollten von einem einzigen Wirt (z.B. Ziegenantirabbit und Ziegenantimaus) stammen. Die sekundären Antikörper müssen auch aus zwei verschiedenen Spektren stammen, die in hochauflösenden Scannern erhältlich sind. Zum Beispiel ein sekundärer Antikörper mit einem Emissionsspektrum von 680 nm und ein sekundärer Antikörper 800CW (Emissionsspektrum-Peak bei 780 nm).

  1. Entfernen Sie Glasrutschen aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sich 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen.
  2. Unter einer Rauchhaube fest das Hirngewebe in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphat-gepufferten Salinen (PBS) für 1 − 2 h bei Raumtemperatur.
  3. Spülen Sie Dias in 0,1 M Tris gepufferte Saline (TBS) dreimal für jeweils 10 min. Durchdringung der Zellmembranen durch Inkubationsrutschen in einem milden Reinigungsmittel (z.B. 0,01% Reinigungsmittel) für 30 − 60 min.
  4. Spülen Sie Dias in TBS dreimal für jeweils 15 min.
  5. Ermitteln Sie primären Antikörper für Proteine von Interesse an PBS in der richtigen Konzentration. Zum Beispiel, um das unmittelbare frühe Gen c-Fos zu erkennen, bereiten Sie ein Kaninchen primären Anti-c-Fos-Antikörper in einer Konzentration von 1:500.
  6. Pipette primäre Antikörper-Lösung direkt auf das Hirngewebe (ca. 200 μL pro 3 Zoll x 1 Zoll Dia).
  7. Verwenden Sie Coverslips, um das Hirngewebe auf Glasdias in der primären Antikörper-Verdünnung für 1 − 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht (~ 17 h) bei 4 ° C zu inkubieren.
  8. Entfernen Sie die Versionslippen und waschen Sie Dias in TBS, das eine geringe Menge Waschmittel (z.B. 0,01% Waschmittel, "TBS-T") viermal für je 15 min.
  9. Verwenden Sie Coverslips, um Hirnabschnitte in einem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 2 Stunden zu inkubieren.
    NOTE: Der sekundäre Antikörper muss zur richtigen Verdünnung und in einem Abdünnungsmittel mit TBS, Waschmittel und 1,5% Wirtsserum sein. So würde beispielsweise ein Ziegensekundenkörper in einer Verdünnung von 1:2000 1,5% Ziegenserum und 0,05% Reinigungsmittel enthalten.
  10. Spülen Sie Dias in TBS-T viermal für je 20 min und dann in TBS viermal für 20 min.
  11. Trockene Rutschen bei Raumtemperatur in der Dunkelheit über Nacht. Wenn die Rutschen trocken sind, sind sie bereit für die Bildgebung.

3. Bildgebung

  1. Legen Sie Dias auf die Nahinfrarot-Scanschnittstelle mit dem nach unten gerichteten Gewebe. Entweder eine Glasscheibe oder mehrere Dias gleichzeitig mit einem Auswahlwerkzeug abbilden.
  2. Bild-Dias mit der höchsten Qualitätseinstellung mit einem Offset von 0 nm und einer Auflösung von 21 μm. Das Scannen dauert in der Regel 13 − 19 h, je nach verwendetem Scangerät.
  3. Importieren Sie Bilder in die Bildanalyse-Software (z.B. ImageStudio), um sie für die semi-quantitative Proteinanalyse zu sehen und zu markieren.

4. Protein-Expressionsanalyse

  1. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software und wählen Sie den Arbeitsbereich , in den das Bild gescannt wurde.
  2. Öffnen Sie das gescannte Bild in der Bildanalyse-Software, um den Scan zu sehen, und passen Sie an, welche Wellenlängen angezeigt werden, sowie den Kontrast, die Helligkeit und die Vergrößerung, ohne das Rohbild oder die Gesamtquantifizierung zu verändern.
  3. Identifizieren Sie die Schlüsselregionen für die Quantifizierung und wählen Sie die Registerkarte Analyse am oberen Rand der Seite, dann wählen Sie Ziehung Rechteck (oder Zeichnen Ellipse/Zeichnen Sie Freehand), um ein Rechteck über den Bereich, der quantifiziert werden wird zu zeichnen.
  4. Um die Größe des Rechtecks zu sehen, wählen Sie Formen am unteren linken Rand des Bildschirms, dann wählen Sie die Säulen unten rechts. Fügen Sie die Höhen- und Breitenspalten hinzu, um die Formgröße zu ermitteln.
    NOTE: Wichtig ist, beim Vergleich der Quantifizierung die Formgröße zu kontrollieren. Es wird empfohlen, identische Formen zu verwenden, die innerhalb des gewünschten Quantifizierungsortes platziert sind, um eine genaue Probenahme der Emissionen für diese Region zu erhalten.
  5. Dann die Form benennen und wiederholen. Sobald alle Regionen gesampelt sind, können die Daten, die aus dem Spalten-Tab verfügbar sind, aggregiert und analysiert werden.

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Representative Results

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Vor dem Einsatz hochauflösender Scannern für Immunhistochemie sollte man überprüfen, ob das Protokoll funktioniert. Dies kann mit einem Validierungs-Test erreicht werden, bei dem Hirnabschnitte aus dem gleichen Tier mit primären und sekundären Antikörpern, sekundären Antikörpern allein oder weder primären noch sekundären Antikörpern inkubiert werden. Die Ergebnisse für einen solchen Validierungs-Test sind in Abbildung2 dargestellt. In dieser Reaktion erkannten wir das unmittelbare frühe Gen c-Jun im dorsalen Hippocampus und Amygdala. C-Jun-Ausdruck wurde erst beobachtet, wenn primäre und sekundäre Antikörper auf das Hirngewebe aufgetragen wurden.

Abbildung 3 zeigt die duale Proteindetektion in Amygdala-Kernen. In diesem Experiment haben wir die GluR1-Untereinheit des α-amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazolepropionsäure (AMPA) und die NR2A-Untereinheit des N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptors (NMDA) im gleichen Gehirn untersucht. Dies ermöglichte es uns, das Verhältnis von AMPA/NMDA-Rezeptoren in Subkernen der Amygdala zu untersuchen. Dieses Verhältnis ist eine neurobiologische Signatur des Lernens und des Gedächtnisses11,12. Wie in Abbildung3 zu sehen ist, ist das Signal für GluR2 (780 nm in grün gefärbt) und NR2A (680 nm in rot gefärbt) nur im Hirngewebe zu beobachten, das primären und sekundären Antikörpern ausgesetzt war.

Abbildung 4 zeigt, wie aus hochauflösenden Scans im ventralen Hippocampus mittlere und normalisierte Messgrößen der Proteinexpression gewonnen werden können. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software wird ein Rechteck in den Bereich des Interesses (molekulare Schicht von CA1) gelegt und die mittlere Lichtintensität aus der Form kann als Maß für den Fluorophore-Ausdruck verwendet werden (Abbildung 4A). Im Gegenzug handelt es sich dabei um ein Maß für die Proteinexpression (d.h. den antigen-primären Antikörper-Antikörper-Komplex). Die Form kann auch in einer Region platziert werden, die hohes Signal und niedriges Signal ausdrückt, um eine normalisierte Kurve zu erhalten (Abbildung 4B). In diesem Beispiel wurde ein Rechteck über die molekulare Schicht von CA1 gelegt, bedeckte aber auch die dendritischen Felder, die in diesem Test keine signifikanten Mengen c-Jun ausdrückten. Der Bereich unter der Kurve kann dann als Maß für die Proteinexpression genutzt werden. Wenn es sich bei der Einrichtung in einem Experiment um Behandlungsgruppen (z.B. Stressexposition) und eine Kontrolle handelt, können relative Veränderungen der Proteinexpression im Gehirn erreicht werden.

Figure 1
Bild 1 : Abbildung der immunhistochemischen Reaktion mit primären (1st) und sekundären (2.) Antikörpern oder nur primären Antikörpern. Gefüllte schwarze Kreise stellen ein Etikett dar, das ein oxidierendes Mittel wie Meerrettich Peroxidase oder ein Fluorophor wie Bor-Dipyrromethene (BODIPY) sein könnte. Grüne Quadrate stellen Antigen (auf dem Protein von Interesse) dar, das in der immunhistochemischen Reaktion nachgewiesen wird.

Figure 2
Bild 2 : Bilder eines Validierungs-Tests zur Erkennung von c-Jun. In diesem Test wurde Gewebe desselben Tieres mit einem Kaninchen primären Antikörper behandelt, der c-Jun und Ziegen-Antikanin-Bahn-Sekundarkörper mit angehängtem Fluorophor mit Emission von 780 nm (Pseudofarben in grüner, linker Tafel) erkennt. Das angrenzende Gewebe wurde entweder mit sekundärem Antikörper allein (Mittelfeld) oder ohne Antikörper (rechtes Panel) behandelt. Skalierbalken = 1 mm.

Figure 3
Bild 3 : Validierungsuntersicht für die Doppelbeschriftung immunhistochemische Reaktion in der Amygdala. Dreifacher Hirnabschnitte aus der gleichen Ratte wurden entweder Kaninchen Antikörper ausgesetzt, der GluR1 und Maus-Antikörper erkennt, der NR2A (linke Panels), sekundären Antikörper (mittlere Paneele) oder keinen Antikörper (rechte Panels) erkennt. GlurR1 wurde mit Ziegenkaninchen 800CW sekundärem Antikörper (780 nm, pseudofarben in grün) und NR2A mit einem Ziegenantimouse 680RD sekundären Antikörper (680 nm, pseudo in rot gefärbt) visualisiert. Skalierbalken = 1 mm. ot = Optiktrakt; ic = interne Kapsel; ec = externe Kapsel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 4
Bild 4 : Erlangung halbequantitativer Maßnahmen zur Proteinexpression im Hirngewebe. (A und B) Screenshots von gepunkteten Bildern in der Bildanalyse-Software, die zur Analyse von Bildern aus dem Scanner verwendet wird. Tissue wurde vom ventralen Hippocampus und behandelt, um c-Jun zu visualisieren.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Die in diesem Artikel vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die nahezu infrarote Immunozytochemie in Kombination mit hochauflösendem Scannen genutzt werden kann, um semiquantitative Maßnahmen der Proteinexpression im Hirngewebe zu erhalten. Es kann auch verwendet werden, um zwei Proteine gleichzeitig in der gleichen Hirnregion zu kennzeichnen. Wir haben zuvor die Infrarot-Immunhistochemie verwendet, um die sofortige frühe Genexpression in mehreren Hirnregionen9,10zumessen. Unmittelbare frühe Gene können als Maß für neuronale Aktivität verwendet werden. Wir haben diese halbintigen Maßnahmen der Proteinexpression auch statistischen Analysen unterzogen, die es uns ermöglichten, Hirnregionen mit korrelierten Niveaus von unmittelbaren frühen Genen (IEGs) zu gruppieren. Wir nutzten dies als ein Maß für die funktionelle Konnektivität, um zu untersuchen, wie Stress die funktionelle Konnektivität zwischen Knoten innerhalb des Angstkreises während des emotionalen Lernens und Gedächtnisses 9,10beeinflusst. Wir haben gezeigt, wie AMPA/NMDA-Verhältnisse (eine Signatur von Lernen und Gedächtnis) mit Hilfe von Infrarot-Immunozytochemie mit hochauflösenden Scannen 13 gemessen werden können. Eine ähnliche Technik kann verwendet werden, um Pfanne und Phospho-Proteine zu messen, um molekulare Signalgebung zu bestimmen. Dies wird mit dem Westernschlot 14 erreicht. Dies erfordert jedoch eine Abspaltung von Hirnregionen aus dicken Hirnscheiben und ist für kleine Hirnregionen nicht geeignet. Dieses Problem kann mit Hilfe einer nahezu infraroten Immunozytochemie mit hochauflösendem Scannen umgangen werden. Schließlich werden alle immunozytochemischen Bilder digitalisiert, was eine unbegrenzte Speicherung und komfortable Neuanalyse früherer Assays ermöglicht.

Wie bei allen Methoden gibt es auch hier Nachteile. Es gibt keine Vergrößerung in hochauflösenden Scannern und die Behandlung von Gewebe erlaubt nicht ohne Weiteres die Sondierung mit Fluoreszenzmikroskopischen Techniken. Selbst die Einnahme alternativer Scheiben aus dem Gehirn kann nicht funktionieren, da die konfokale Mikroskopie am besten in parvitalem Hirngewebe funktionieren kann, aber die Nahinfrarot-Bildgebung mit hochauflösenden Scannen wird in der Regel auf Flash-gefrorenen Gehirnen durchgeführt. Proteinausdruck in bestimmten Neuronen (z.B. Interneuron vs. pyramidenförmiges Neuron) oder verschiedenen Zelltypen im Gehirn (z.B. Neuronen vs. Glia) kann nicht mittels nahezu infraroteter Immunozytochemie mit hochauflösendem Scannen bestimmt werden. Die Durchführung von Validierungsuntersuchungen ist von entscheidender Bedeutung, da es sich dabei immer noch um eine relativ neue Methode zur Untersuchung der Proteinexpression im Hirngewebe handelt.

Bei geeigneter Anwendung bietet die Infrarot-Immunozytochemie mit hochauflösendem Scannen Vorteile. Die Autofluoreszenz im Hirngewebe wird im Infrarotbereich reduziert, halbquantitative Messungen der Proteinexpression können erreicht werden, die Expression von zwei Proteinen in der gleichen Hirnregion kann erreicht werden, und Bilder des Tests können unbegrenzt gespeichert werden. In Kombination mit der richtigen Protein-und statistischen Methode kann diese Technik verwendet werden, um Proteinexpression, neuronale Aktivität, molekulare Signalgebung und funktionelle Konnektivität im Gehirn zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Forschung in diesem Bericht wurde durch ein Zielzuschuss der NIGMS (1P20GM103653) an DK finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Extraction
Anesthesia Induction Chamber Kent Scientific VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine Harvard Apparatus 73-1920
Friedman Rongeur Fine Science Tools 16000-14 used to remove back of skull
Delicate Dissecting Scissors Fischer Scientific 08-951-5 used to cut upward along midline of skull
Micro Spatula Fischer Scientific 21-401-5 used to scoop out brain
Glass Microscope Slides Fischer Scientific 12-549-6
Immunohistochemical Reaction
 Triton X-100 Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody 
Tween-20 Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scanner Licor Biotechnology Inc.
Image Studio Licor Biotechnology Inc.

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References

  1. Kandel, E. R. Principles of Neural Science. McGraw Hill. New York. (2013).
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Kimmelmann-Shultz, B., Mohmammadmirzaei, N., Caplan, J., Knox, D. Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59685, doi:10.3791/59685 (2019).More

Kimmelmann-Shultz, B., Mohmammadmirzaei, N., Caplan, J., Knox, D. Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59685, doi:10.3791/59685 (2019).

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