Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

doi: 10.3791/59685 Published: May 23, 2019

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.

Abstract

מדעי המוח הוא חקר כיצד תאים במוח בתווך פונקציות שונות. מדידת חלבון הביטוי בנוירונים ו glia היא קריטית לחקר מדעי המוח כפונקציה תאית נקבעת על ידי הרכב ופעילות של חלבונים סלולריים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד ניתן לשלב את היכולות האימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום כדי לספק מידה חצי כמותית של ביטוי חלבון באזורי מוח נפרדים. ניתן להשתמש בטכניקה זו לביטוי חלבון יחיד או כפול באותו אזור המוח. מדידת חלבונים בצורה זו יכולה לשמש כדי לקבל שינוי יחסי בביטוי חלבון עם מניפולציה ניסיוני, חתימה מולקולרית של למידה וזיכרון, פעילות במסלולים מולקולריים, ופעילות עצבית באזורי מוח מרובים. ניתן לקבוע באמצעות החלבונים והניתוחים הסטטיסטיים הנכונים, קישוריות פונקציונלית בין אזורי מוח. בהתחשב בקלות של יישום כימיה חיסונית במעבדה, שימוש באמצעות אימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום יכול להרחיב את יכולת הנוירומדען לבחון תהליכים נוירויולוגיים ברמת מערכות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המחקר של מדעי המוח חששות חקירה של איך תאים במוח מתווך פונקציות ספציפיות1. אלה יכולים להיות סלולריים בטבע כגון איך התאים גליה מעניקה חסינות במערכת העצבים המרכזית או יכול לכלול ניסויים שמטרתם להסביר כיצד הפעילות של נוירונים בהיפוקמפוס החלק המוביל לניווט מרחבי. במובן רחב, הפונקציה התאית נקבעת על ידי החלבונים המתבטאת בתא ואת הפעילות של חלבונים אלה2. כתוצאה מכך, מדידת הביטוי ו/או הפעילות של חלבונים בתאי המוח הם קריטיים לחקר מדעי המוח.

מספר טכניקות זמינות כדי למדוד ביטוי חלבון במוח. אלה כוללים בשיטות vivo כגון טופוגרפיה פליטת פוזיטרונים עבור צפיפויות הקולטן3 ו מיקרו-דיאליזה עבור פפטידים קטנים4. בדרך כלל, שיטות vivo ex משמשות כדי לבחון את תפקוד החלבון ואת הביטוי. אלה כוללים טכניקות ספקטרומטר המסה5, כתם מערבי ושיטת חיסוני מקושרת באמצעות אנזימים (אליסה)6, ואימונוציטוטוכימיה7. אימונוציטוכימיה נמצאת בשימוש נרחב בתחום המדעי המוח. טכניקה זו כוללת את השימוש בנוגדן העיקרי כדי לזהות חלבון (או אנטיגן) של עניין (g., c-Fos) ו נוגדן משני מצותת כדי לזהות את החלבון-העיקרי נוגדן קומפלקס (איור 1). כדי לאפשר זיהוי של החלבון-העיקרי נוגדן מורכב נוגדן, נוגדנים משניים יש סוכנים אוקסיגון כגון חזרת peroxidase (HRP) מעלה באוב להם. הדבר מאפשר היווצרות מאיצים בתאים שניתן לאתרם באמצעות מיקרוסקופ אור7. נוגדנים משניים יכולים להיות גם כימיקלים זרוח עלה באוב אותם (כלומר, fluorophores). כאשר מגורה אלה כימיקלים פולטים אור, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות חלבון-ראשי נוגדן משני מכלולי נוגדנים7. לבסוף, לפעמים נוגדנים ראשוניים יש הפחתת סוכנים וכימיקלים פלואורסצנטית המצורפת אליהם ישירות לאשר את הצורך נוגדנים משניים7 (איור 1).

מעניין, הרבה שיטות אימונוציטוטוקכימיה לאפשר ויזואליזציה של חלבונים בתאי המוח, אבל לא את היכולת לכמת את כמות החלבון בתא מסוים או באזור המוח. שימוש במיקרוסקופיה קלה לאיתור מאיצים מתגובות הפחתת מאפשר ויזואליזציה של נוירונים ו גליה, אבל שיטה זו אינה יכולה לשמש לכמת ביטוי חלבון בתאים או באזור המוח מסוים. בתאוריה, מיקרוסקופ ניאון ניתן להשתמש בשביל זה, כי האור הנפלט הנוגדן משני פלורסנט הוא מדד של החלבון-העיקרי נוגדנים משני נוגדנים מורכבים. עם זאת, פלואורסצנטית אוטומטי ברקמת המוח יכול להקשות על השימוש מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לכמת את הביטוי חלבון רקמת המוח8. כתוצאה מכך, אור הנפלט מתמונות פלורסנט של רקמת המוח משמש לעתים רחוקות כדי לכמת את הביטוי חלבון במוח.

רבים מהנושאים הללו ניתן לטפל באמצעות באמצעות אינפרא-אדום האימונוציטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה9,10. במאמר זה, אנו מתארים כיצד משולבים כימיה חיסונית עם fluorophores בספקטרום הפליטה הקרוב-אינפרא אדום ניתן לשלב עם סריקה ברזולוציה גבוהה (g., 10 – 21 μm) כדי לקבל תמונות חדות המאפשרות כימות החלבון בנפרד אזורי המוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול הבא אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת דלאוור. גברים בחולדות מג בני 55-75 ימים שימשו לפרוטוקול זה.

1. מיצוי המוח והכנת רקמות

  1. בחדר ההרדמה עד שחולדה כבר. לא מציגה תגובה לצביטה ברגל
  2. להקריב חולדות באמצעות עריפת ראש מהירה באמצעות גיליוטינה.
  3. חותכים את העור מאחורי הגולגולת לקדמי וברור מראש הגולגולת.
  4. השתמש rongeurs להסיר בזהירות את החלק האחורי של הגולגולת, ולאחר מכן באמצעות מספריים מחתך קטן לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, דוחף כלפי מעלה על החלק העליון של הגולגולת בכל עת כדי למנוע פגיעה רקמת המוח.
  5. השתמש rongeurs לקלף מימין ומשמאל חצי גולגולת כדי לחשוף את המוח.
  6. השתמשו במרית קטנה לסקופ תחת המוח והעצבים, העלה בזהירות את המוח והקפא את המוח באיזופנטאן צוננים על קרח יבש (לפחות 20 ° c). אחרי זה, לאחסן את המוח במקפיא של 80 ° c עד לחיתוך.
  7. פורסים את המוח באזורי עניין ב-30-50 יקרומטר בקריוסטט שנשמר בין-9 ° c ו-12 ° c. הרכב באופן ישיר פרוסות על שקופיות זכוכית ולאחסן במקפיא של 80 ° c עד הזמן של שיטת כימיה חיסונית.
    הערה: בפרוטוקול זה המוח אזורים של עניין היו ההיפוקמפוס ואת האמיגדלה.

2. התגובה האימונוהיסטוכימיה היחידה

הערה: עבור תגובה אימונוהיסטוכימיה כפולה, הפרוטוקול הוא זהה התגובה החיסונית היחידה למעט התגובה הזו יש שני נוגדנים העיקרי של מארחים שונים (למשל, ארנב ועכבר) ושני נוגדנים משניים עבור המתאים המקדימות צריכה להיות מפונדקאי יחיד (למשל, אנטישפן עז וantimouse עיזים). גם הנוגדנים המשניים צריכים להיות משני ספקטרום שונה הזמינים בסורקים ברזולוציה גבוהה. לדוגמה, נוגדן משני אחד עם השיא ספקטרום פליטה ב 680 ננומטר ומשני נוגדן 800CW (הספקטרום פליטה שיא ב 780 ננומטר).

  1. הסרת שקופיות זכוכית מן המקפיא ולאפשר שאיפה לטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
  2. מתחת למכסה המנוע, לתקן רקמת המוח ב 4% פאראמפורמלדהיד ב 0.1 מ פוספט מתכלה באגירה (PBS) עבור 1 על 2 על הטמפרטורה בחדר.
  3. לשטוף את השקופיות ב 0.1 מלוחים באגירה של M טריס (TBS) שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד. ממברנות תאים מחלחלים על-ידי דגירה של שקופיות בתכשיר ניקוי קל (לדוגמה, 0.01% דטרגנטים) עבור 30-60 דקות.
  4. לשטוף שקופיות ב-TBS שלוש פעמים עבור 15 דקות כל אחד.
  5. לדלל את הנוגדן העיקרי עבור חלבון הריבית ב-PBS בריכוז הנכון. לדוגמה, כדי לזהות את הגן המיידי c-Fos מוקדם, להכין ארנב הראשי נגד c-Fos נוגדן בריכוז של 1:500.
  6. הנוגדן הראשוני הפתרון העיקרי ישירות על רקמת המוח (כ 200 μL לכל 3 אינץ ' x 1 שקופית אינטש).
  7. השתמש כיסוי כדי לדגירה את רקמת המוח על שקופיות זכוכית דילול הנוגדן העיקרי עבור או 1 על 2-h בטמפרטורת החדר או לילה (~ 17 h) ב 4 ° c.
  8. הסר שמיכות ולשטוף שקופיות ב-TBS כי יש כמות קטנה של חומרי ניקוי שנוספו לו (למשל, 0.01% סבון, "TBS-T") ארבע פעמים עבור 15 דקות כל אחד.
  9. השתמש כיסוי כדי דגירה סעיפים המוח בנוגדן משני בטמפרטורת החדר עבור 2 h.
    הערה: הנוגדן המשני צריך להיות לדילול הנכון בדילול המכיל TBS, אבקת כביסה, ו 1.5% של סרום מארח. לדוגמה, נוגדן משני עז בדילול של 1:2000 יכיל 1.5% סרום עז ו 0.05% כביסה.
  10. לשטוף שקופיות ב-TBS-T ארבע פעמים עבור 20 דקות כל אחד, ולאחר מכן ב-TBS ארבע פעמים עבור 20 דקות כל אחד.
  11. שקופיות יבשות בטמפרטורת החדר. בחשיכה, בן לילה כאשר השקופיות יבשות, הן מוכנות לדימות.

3. הדמיה

  1. מניחים שקופיות על ממשק הסריקה הכמעט-אינפרא-אדום כאשר הרקמה פונה כלפי מטה. התמונה מחליקה זכוכית אחת או שקופיות מרובות בכל פעם באמצעות כלי בחירה.
  2. שקופיות תמונה באמצעות הגדרת האיכות הגבוהה ביותר עם היסט של 0 ננומטר ורזולוציה של 21 μm. הסריקה בדרך כלל לוקח 13-19 h בהתאם לציוד הסריקה המשמש.
  3. יבא תמונות לתוך תוכנת ניתוח התמונה (לדוגמה, ImageStudio) כדי להציג ולסמן עבור ניתוח חלבון חצי כמותי.

4. ניתוח ביטוי חלבון

  1. פתח את תוכנת ניתוח התמונה ובחר באזור העבודה שאליו התמונה נסרקה.
  2. פתחו את התמונה הסרוקה בתוכנת ניתוח התמונה כדי להציג את הסריקה, וכוונן אילו אורכי גל יוצגו, כמו גם את הניגודיות, הבהירות וההגדלה המוצגים מבלי לשנות את התמונה הגולמית או את הפליטה הכוללת.
  3. זהה את אזורי המפתח עבור כימות ובחר את הכרטיסיה ניתוח לאורך החלק העליון של הדף ולאחר מכן בחר בצייר מלבן (או צייר אליפסה/צייר ביד חופשית) כדי לצייר מלבן מעל האזור שיוכמת.
  4. כדי להציג את גודל המלבן, בחר צורות לאורך החלק השמאלי התחתון של המסך ולאחר מכן בחר בעמודות לאורך החלק התחתון הימני. הוספת עמודות גובה ורוחב כדי לזהות את גודל הצורה.
    הערה: חשוב לשלוט בגודל הצורה בהשוואת הקוונפיקציה. מומלץ להשתמש בצורות זהות ממוקמות בתוך מיקום הקוונפיקציה הרצוי, כדי לקבל דגימה מדויקת של פליטות עבור אזור זה.
  5. לאחר מכן, ציין את שם הצורה וחזור על כך. לאחר שכל האזורים נדגמו, ניתן לצבור ולנתח את הנתונים הזמינים מהכרטיסיה עמודות .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לפני שימוש בסריקה ברזולוציה גבוהה עבור אימונוהיסטוכימיה, יש לוודא כי הפרוטוקול פועל. זה יכול להתבצע באמצעות בדיקת אימות שבו סעיפים המוח מאותו בעל חיים מודבטים עם נוגדנים הראשי והמשני, הנוגדן המשני בלבד, או לא העיקרי או נוגדן משני. תוצאות עבור שיטת אימות מסוג זה מוצגות באיור 2. בתגובה זו אנו מזהים את הגן המיידי c-Jun מוקדם בהיפוקמפוס והאמיגדלה. ביטוי C-Jun נצפה רק כאשר נוגדנים ראשוניים ומשניים הוחלו על רקמת המוח.

איור 3 מראה זיהוי חלבון כפול בגרעין האמיגדלה. בניסוי זה אנו מGluR1 את יחידת המשנה של הקוד α-אמינו 3-5-מתיל-4-isoxazolepropionic חומצה (אמפא) הקולטן ואת NR2A יחידת המשנה של N-מתיל-D-aspartate קולטן (NMDA) קולטן באותה רקמת מוח. זה איפשר לנו לבחון את היחס של קולטני אמפא/NMDA בתת-הגרעין של האמיגדלה. היחס הזה הוא חתימה נוירוביולוגית של למידה וזיכרון11,12. כפי שניתן לראות באיור 3, האות עבור GluR2 (780 ננומטר אור מדומה בצבע ירוק) ו NR2A (680 ננומטר אור מדומה בצבע אדום) ניתן לצפות רק ברקמת המוח כי נחשף נוגדנים הראשי והמשני.

איור 4 מראה כיצד ממוצע ומידות מנורמלות של ביטוי חלבון ניתן לקבל מסריקות ברזולוציה גבוהה בהיפוקמפוס הגחוני. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, מלבן ממוקם באזור הריבית (שכבה מולקולרית של CA1) ועוצמת ממוצע של אור מן הצורה ניתן להשתמש כמדד של ביטוי fluorophore (איור 4A). בתורו, זה מידה של חלבון ביטוי (כלומר, אנטיגן-העיקרי נוגדן מורכב נוגדן). ניתן גם למקם את הצורה על-פני אזור המבטא אות גבוה ואות נמוך כדי לקבל עקומה מנורמלת (איור 4B). בדוגמה זו, מלבן הוצב על פני השכבה המולקולרית של CA1, אך כיסה גם את השדות הדנדריטים, אשר לא הביעו כמויות משמעותיות של c-Jun באופן זה. לאחר מכן ניתן להשתמש באזור שמתחת לעקומה כאמצעי לביטוי חלבון. אם הכיוונון בניסוי כולל קבוצות טיפול (למשל, חשיפה למתח) ושליטה, ניתן להשיג שינויים יחסיים בביטוי החלבונים במוח.

Figure 1
איור 1 : המחשה של התגובה האימונוהיסטוכימיה באמצעות העיקרי (1st) ו המשני (2nd) נוגדנים או רק נוגדן ראשוני. עיגולים שחורים מלאים מייצגים תווית, אשר יכול להיות סוכן אוקסיגון, כגון חזרת peroxidase או fluorophore כגון בורון-דיפירורומאפן (BODIPY). ריבועים ירוקים מייצגים אנטיגן (על חלבון של ריבית) להיות מזוהה בתגובה אימונוהיסטוכימיה.

Figure 2
איור 2 : תמונות של שיטת אימות עבור זיהוי של c-Jun. בתוך מעשה זה, רקמות מאותה חיה טופלו עם נוגדן ראשוני הארנב המכיר c-Jun ו עז antirabbit נוגדן משני עם fluorophore מצורף הפליטה ב 780 nm (פסאודו בצבע ירוק, שמאל פאנל). הרקמה הסמוכה טופלה עם נוגדנים משני בלבד (הפאנל האמצעי) או לא נוגדן (הפאנל הימני). סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ.

Figure 3
איור 3 : שיטת אימות לתיוג כפול של תגובת אימונוהיסטוכימיה באמיגדלה. טריפליאט סעיפים המוח מתוך עכברוש זהה נחשף לנוגדן הארנב המכיר GluR1 ומלא העכבר המכיר NR2A (שמאל פאנלים), נוגדן משני (לוחות הביניים), או לא נוגדן (לוחות הימני). GlurR1 היה מדומה עם עז נגד ארנב משני של מNR2A (780 ננומטר, בצבע מדומה בירוק) והוא היה דמיינו באמצעות עז antimouse 680RD שני נוגדן (680 nm, פסאודו בצבע אדום). סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. ot = מערכת אופטית; ic = כמוסה פנימית; ec = כמוסה חיצונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : קבלת אמצעים כמותיים למחצה של חלבון ביטוי ברקמת המוח. (A ו- B) צילומי מסך של תמונות הבקיע בתוכנה ניתוח תמונה המשמש לניתוח תמונות מהסורק. הרקמה הייתה מההיפוקמפוס הגחוני. וטופלה באופן חזותי בג-ג'ון  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התוצאות שהוצגו במאמר זה מראים כי קרוב-אינפרא-אדום אימונוציטוטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה ניתן להשתמש כדי לקבל אמצעים חצי כמותיים של ביטוי חלבון ברקמת המוח. זה יכול לשמש גם כדי לתייג שני חלבונים בו זמנית באותו אזור המוח. בעבר השתמשנו בשימוש קרוב-אינפרא אדום אימונוהיסטוכימיה כדי למדוד ביטוי גנטי מיידי מוקדם באזורים המוח מרובים9,10. גנים מוקדמים מיידיים יכולים לשמש כאמצעי לפעילות עצבית. כמו כן, אנו נתונים אלה מדדים חצי כמותיים של ביטוי חלבון לניתוחים סטטיסטיים שאפשרו לנו לקבץ אזורי מוח עם רמות מתואם של גנים מוקדמים מיידית (רגליים). השתמשנו בזה כאמצעי לחיבור פונקציונלי כדי לבחון כיצד מתח משפיע על קישוריות תפקודית בין צמתים בתוך מעגל הפחד במהלך למידה רגשית זיכרון9,10. אנו מראים כיצד למדוד את היחס של אמפא/NMDA (חתימה של למידה וזיכרון) באמצעות סריקה ברזולוציה גבוהה באמצעות אינפרא-אדום באמצעות סריקת מידה13. טכניקה דומה יכולה לשמש כדי למדוד פאן ו-פוספהו-חלבונים כדי לקבוע איתות מולקולרי. הדבר מתבצע באמצעות אבן חשופה מערבית14. עם זאת, זה דורש לבתר את אזורי המוח מתוך פרוסות מוח עבות לא קל לאזורי מוח קטנים. ניתן להקיף בעיה זו באמצעות סריקה באמצעות אינפרא-אדום-כימיה עם סריקת רזולוציה גבוהה. לבסוף, כל התמונות האימונוציטוטוכימיה הן דיגיטליות, אשר מאפשרת אחסון בלתי מוגבל וניתוח מחדש נוח של assays הקודם אומר.

כמו בכל השיטות יש חסרונות. אין הגדלה בסורקים ברזולוציה גבוהה והטיפול ברקמה אינו מאפשר בקלות לחטט בטכניקות מיקרוסקופיים של קרינה פלואורסצנטית. אפילו לקיחת פרוסות חלופיות מן המוח עשוי לא לעבוד, מאז המיקרוסקופיה יכול לעבוד בצורה הטובה ביותר ברקמת המוח מקורה, אבל הדמיה בקרבת אינפרא אדום עם סריקה ברזולוציה גבוהה נעשה בדרך כלל על המוח קפוא פלאש. ביטוי חלבון בנוירונים ספציפיים (למשל, בתאי תא לעומת תא העצב) או סוגי תאים שונים במוח (למשל, נוירונים vs. glia) לא ניתן לקבוע באמצעות סריקה באמצעות אינפרא אדום כמעט ברזולוציה גבוהה. ביצוע האימות מתבצע באופן קריטי מאחר שזוהי עדיין שיטה חדשה יחסית לבדיקת ביטוי חלבונים ברקמת המוח.

כאשר משתמשים בו כראוי, כימיה אימונוציטוטוכימיה כמעט אינפרא-אדום עם סריקה ברזולוציה גבוהה מציעה יתרונות. פלואורסצנטית אוטומטי ברקמת המוח מופחת בטווח הקרוב אינפרא-אדום, מדדים חצי כמותיים של ביטוי חלבון ניתן להשיג, ביטוי של שני חלבונים באותו אזור המוח ניתן להשיג, ותמונות של התיקון ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן. בשילוב עם החלבון הנכון ו/או השיטה הסטטיסטית ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לבחון את ביטוי החלבון, פעילות עצבית, איתות מולקולרי וקישוריות פונקציונלית בתוך המוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחקר בדו ח זה מומן על ידי מענק היעד של הכושים (1P20GM103653) הוענק DK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Extraction
Anesthesia Induction Chamber Kent Scientific VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine Harvard Apparatus 73-1920
Friedman Rongeur Fine Science Tools 16000-14 used to remove back of skull
Delicate Dissecting Scissors Fischer Scientific 08-951-5 used to cut upward along midline of skull
Micro Spatula Fischer Scientific 21-401-5 used to scoop out brain
Glass Microscope Slides Fischer Scientific 12-549-6
Immunohistochemical Reaction
 Triton X-100 Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody 
Tween-20 Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scanner Licor Biotechnology Inc.
Image Studio Licor Biotechnology Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kandel, E. R. Principles of Neural Science. McGraw Hill. New York. (2013).
  2. Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. Academic Press/Elsevier. (2009).
  3. Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. (2018).
  4. Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20, (1), 229-239 (2004).
  5. English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
  6. David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
  7. Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. (2010).
  8. Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197, (1), 48-55 (2011).
  9. Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
  10. Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23, (12), 689-698 (2016).
  11. Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
  12. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511, (7509), 348-352 (2014).
  13. Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, (2018).
  14. Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75, (2), 130-137 (2013).
שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kimmelmann-Shultz, B., Mohmammadmirzaei, N., Caplan, J., Knox, D. Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59685, doi:10.3791/59685 (2019).More

Kimmelmann-Shultz, B., Mohmammadmirzaei, N., Caplan, J., Knox, D. Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59685, doi:10.3791/59685 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter