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Neuroscience

कृंतक मस्तिष्क में प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति और उच्च संकल्प स्कैनिंग का उपयोग करना

doi: 10.3791/59685 Published: May 23, 2019

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि immunohistoरसायनशास्त्र और उच्च संकल्प के साथ संयोजन के रूप में अवरक्त रंगों का उपयोग करता है मस्तिष्क क्षेत्रों में परख प्रोटीन स्कैनिंग प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

तंत्रिका विज्ञान का अध्ययन है कि कैसे मस्तिष्क में कोशिकाओं के विभिंन कार्यों मध्यस्थता । ंयूरॉंस और गलिया में प्रोटीन अभिव्यक्ति मापने तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में सेलुलर समारोह संरचना और सेलुलर प्रोटीन की गतिविधि द्वारा निर्धारित होता है । इस अनुच्छेद में, हम का वर्णन कैसे immunocytochemistry पास के साथ संयुक्त किया जा सकता है अवरक्त उच्च-विभेदन के लिए अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक अर्द्ध मात्रात्मक उपाय प्रदान स्कैनिंग । इसी ब्रेन रीजन में सिंगल या डबल प्रोटीन एक्सप्रेशन के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता है । इस फैशन में प्रोटीन को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक हेरफेर, सीखने और स्मृति के आणविक हस्ताक्षर, आणविक रास्ते में गतिविधि, और कई मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका गतिविधि के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक सापेक्ष परिवर्तन प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सही प्रोटीन और सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करना, मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित किया जा सकता है । एक प्रयोगशाला में immunocytochemistry को लागू करने की आसानी को देखते हुए, निकट अवरक्त उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग न्यूरोसाइंटिस्ट की क्षमता का विस्तार कर सकते हैं एक सिस्टम स्तर पर न्यूरोलॉजिकल प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए.

Introduction

तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन के एक जांच की चिंताओं मस्तिष्क में कोशिकाओं को कैसे विशिष्ट कार्यों के माध्यम से मध्यस्थता1. इन प्रकृति में सेलुलर किया जा सकता है जैसे कैसे गलिया कोशिकाओं केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रतिरक्षा प्रदान या प्रयोगों है कि उद्देश्य समझाने के लिए कैसे पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में ंयूरॉंस की गतिविधि स्थानिक नेविगेशन के लिए सुराग शामिल कर सकते हैं । एक व्यापक अर्थों में, सेलुलर समारोह प्रोटीन है कि एक सेल में व्यक्त कर रहे हैं और इन प्रोटीन की गतिविधि द्वारा निर्धारित किया जाता है2. नतीजतन, मस्तिष्क की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति और/या प्रोटीन की गतिविधि को मापने तंत्रिका विज्ञान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

ब्रेन में प्रोटीन एक्सप्रेशन को मापने के लिए कई तकनीकें उपलब्ध हैं । इन vivo विधियों जैसे रिसेप्टर घनत्व3 और छोटे पेप्टाइड4के लिए माइक्रो डायलिसिस के लिए पोजिट्रॉन उत्सर्जन स्थलाकृति के रूप में शामिल हैं । अधिक सामांयतः, पूर्व vivo तरीकों प्रोटीन समारोह और अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । इनमें मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक5, वेस्टर्न ब्लॉट और एंजाइम से जुड़ी इम्यूनोसोतुला परख (एलिसा)6और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री7शामिल हैं । इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है । इस तकनीक में एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए एक प्रोटीन (या प्रतिजन) ब्याज का पता लगाने के लिए शामिल है (जैसे, सी-Fos) और प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर का पता लगाने के लिए एक संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (चित्रा 1). प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी-माध्यमिक एंटीबॉडी जटिल का पता लगाने को सक्षम करने के लिए, द्वितीयक एंटीबॉडी ऐसे सहिजन peroxidase (HRP) के रूप में उन से संयुग्मित एजेंटों ऑक्सीकरण हो गया है । यह कोशिकाओं है कि प्रकाश माइक्रोस्कोपी7का उपयोग कर पता लगाया जा सकता में precipitates के गठन के लिए अनुमति देता है । द्वितीयक एंटीबॉडी भी रसायन fluoresce उन्हें करने के लिए संयुग्मित हो सकता है (यानी, fluorophores). जब उत्तेजित इन रसायनों प्रकाश, जो प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी-माध्यमिक एंटीबॉडी परिसरों7का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता फेंकना । अंत में, कई बार प्राथमिक एंटीबॉडी एजेंटों और प्रतिदीप्ति रसायनों को कम करने के लिए उन से जुड़े सीधे माध्यमिक एंटीबॉडी7 के लिए की जरूरत नकार है (चित्रा 1).

दिलचस्प है, कई इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री तरीकों मस्तिष्क की कोशिकाओं में प्रोटीन के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन एक विशिष्ट कोशिका या मस्तिष्क क्षेत्र में प्रोटीन की मात्रा को निर्धारित करने की क्षमता नहीं है । कम प्रतिक्रियाओं से precipitates का पता लगाने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग ंयूरॉंस और glia के दृश्य के लिए अनुमति देता है, लेकिन इस विधि कोशिकाओं में या एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र में प्रोटीन अभिव्यक्ति बताना करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । सिद्धांत रूप में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी से उत्सर्जित प्रकाश प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी-माध्यमिक एंटीबॉडी परिसर का एक उपाय है । हालांकि, मस्तिष्क के ऊतकों में ऑटोफ्लोरेसेंस8मस्तिष्क के ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना मुश्किल बना सकता है । नतीजतन, मस्तिष्क ऊतक के फ्लोरोसेंट छवियों से उत्सर्जित प्रकाश शायद ही कभी मस्तिष्क में प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा का उपयोग किया जाता है ।

इन मुद्दों के कई उच्च संकल्प स्कैनिंग9,10के साथ संयोजन के रूप में पास अवरक्त immunocytochemistry का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है । इस अनुच्छेद में, हम का वर्णन कैसे immunocytochemistry निकट अवरक्त उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में fluorophores के साथ युग्मित उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ संयुक्त किया जा सकता है (जैसे, 10 – 21 μm) तेज छवियों कि अलग में प्रोटीन की अर्द्ध प्रमात्रीकरण के लिए अनुमति प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों ।

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Protocol

निंनलिखित प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) डेलावेयर विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित किया गया था । पुरुष Sprague Dawley चूहों लगभग 55-75 दिन पुराने इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया गया ।

1. मस्तिष्क निष्कर्षण और ऊतक तैयारी

  1. एनेस्थिसिया प्रेरण चैंबर में isoflurane के साथ चूहे anesthetize जब तक चूहा अब पैर चुटकी के लिए एक प्रतिक्रिया प्रदर्शित ।
  2. एक गिलोटिन का उपयोग कर तेजी से decapitation के माध्यम से चूहों बलिदान ।
  3. कमर के पीछे खोपड़ी पर त्वचा काट और खोपड़ी के ऊपर से स्पष्ट ।
  4. का प्रयोग करें rongeurs ध्यान से खोपड़ी के पीछे के हिस्से को हटाने के लिए, और फिर छोटे विदारक कैंची का उपयोग खोपड़ी के मध्य में कटौती, खोपड़ी के शीर्ष के खिलाफ हर समय ऊपर धकेल मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए ।
  5. का प्रयोग करें rongeurs दूर छील करने के लिए सही है और खोपड़ी का आधा छोड़ दिया मस्तिष्क को बेनकाब ।
  6. मस्तिष्क और तोड़ नसों के तहत स्कूप करने के लिए एक छोटे से रंग का प्रयोग करें, ध्यान से मस्तिष्क तरक्की और सूखी बर्फ पर ठंडा आइसोप्टेन में दिमाग फ्रीज (कम से 20 डिग्री सेल्सियस) । इस के बाद, एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में दिमाग की दुकान टुकड़ा करने की क्रिया तक ।
  7. एक cryostat में 30-50 μm पर ब्याज के क्षेत्रों में टुकड़ा दिमाग-9 डिग्री सेल्सियस और-12 डिग्री सेल्सियस के बीच बनाए रखा । सीधे एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में immunocytoरसायनशास्त्र परख के समय तक ग्लास स्लाइड और स्टोर पर स्लाइसें माउंट ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में रुचि के मस्तिष्क क्षेत्रों हिप्पोकैम्पस और amygdala थे ।

2. एकल Immunohistochemical प्रतिक्रिया

नोट: दोहरे immunohistochemical प्रतिक्रिया के लिए, इस प्रतिक्रिया को छोड़कर एकल immunohistochemical प्रतिक्रिया के रूप में एक ही है अलग मेजबान के दो प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, खरगोश और माउस) और दो द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए इसी प्राइमरी एक एकल होस्ट (जैसे, बकरी एंटीखरगोश और बकरी एंटीहाउस) से होना चाहिए । द्वितीयक एंटीबॉडी भी दो अलग स्पेक्ट्रा कि उच्च संकल्प स्कैनर में उपलब्ध है से होना है । उदाहरण के लिए, एक माध्यमिक एंटीबॉडी ६८० एनएम पर एक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पीक और एक माध्यमिक एंटीबॉडी 800CW (उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पीक ७८० एनएम पर) के साथ ।

  1. फ्रीजर से ग्लास स्लाइड निकालें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान को equilibrate अनुमति देते हैं ।
  2. धूआं हुड के अंतर्गत, कमरे के तापमान पर 1 − 2 ज के लिए ०.१ मीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मलेडिहाइड में मस्तिष्क के ऊतकों को ठीक करें ।
  3. ०.१ मीटर tris buffered खारा (टीबीएस) में स्लाइड खंगाल 10 मिनट के लिए तीन बार प्रत्येक । एक हल्के डिटर्जेंट (उदाहरण के लिए, ०.०१% डिटर्जेंट) में स्लाइडों को 30 − 60 मिनट के लिए इन्क्यूबिज़ करके कोशिका झिल्ली को रिस लेना ।
  4. प्रत्येक 15 मिनट के लिए तीन बार टीबीएस में स्लाइड कुल्ला ।
  5. सही एकाग्रता में PBS में ब्याज की प्रोटीन के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी । उदाहरण के लिए, तत्काल जल्दी जीन सी-Fos का पता लगाने के लिए, 1:500 की एकाग्रता में एक खरगोश प्राथमिक विरोधी सी-फॉस एंटीबॉडी तैयार करते हैं ।
  6. Pipette प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान सीधे मस्तिष्क के ऊतकों पर (लगभग २०० μL प्रति 3 इंच x 1 इंच स्लाइड) ।
  7. 1 − 2 ज के कमरे के तापमान पर या रात भर (~ 17 घंटे) 4 डिग्री सेल्सियस के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी तनुकरण में ग्लास स्लाइड पर मस्तिष्क के ऊतकों को सेने के लिए coverslips का उपयोग करें ।
  8. Coverslips निकालें और TBS कि डिटर्जेंट की एक छोटी राशि के लिए यह (जैसे, ०.०१% डिटर्जेंट, "TBS-T") के लिए चार बार 15 मिनट प्रत्येक के लिए जोड़ा गया है में स्लाइड धोने ।
  9. 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर एक द्वितीयक एंटीबॉडी में मस्तिष्क वर्गों को सेने के लिए coverslips का उपयोग करें ।
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी को सही कमजोर पड़ने के लिए और एक टीबीएस, डिटर्जेंट युक्त मंदक में है, और मेजबान सीरम का १.५% है । उदाहरण के लिए, 1:2000 के एक कमजोर पड़ने में एक बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी १.५% बकरी सीरम और ०.०५% डिटर्जेंट होते हैं ।
  10. प्रत्येक 20 मिनट के लिए चार बार TBS-T में स्लाइड् स खंगाल लें, और फिर प्रत्येक 20 मिनट के लिए चार बार टीबीएस में ।
  11. रात के अंधेरे में कमरे के तापमान पर सूखी स्लाइड्स । जब स्लाइड्स ड्राई हो जाती हैं, तो वे इमेजिंग के लिए तैयार हो जाती हैं ।

3. इमेजिंग

  1. नीचे का सामना करना पड़ ऊतक के साथ निकट अवरक्त स्कैनिंग इंटरफेस पर स्लाइड प्लेस । किसी चयन उपकरण का उपयोग करते समय या तो छवि एक ग्लास स्लाइड या एकाधिक स्लाइड् स ।
  2. छवि स्लाइड 0 एनएम के एक ऑफसेट और 21 μm के एक संकल्प के साथ उच्चतम गुणवत्ता सेटिंग का उपयोग । स्कैनिंग आम तौर पर इस्तेमाल किया स्कैनिंग उपकरण के आधार पर 13 − 19 घंटे ले जाएगा ।
  3. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (उदा, ImageStudio) में छवियों को देखने और अर्द्ध मात्रात्मक प्रोटीन विश्लेषण के लिए चिह्नित करने के लिए आयात करें ।

4. प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और उस कार्य क्षेत्र का चयन करें जिसमें छवि स्कैन की गई थी ।
  2. स्कैन को देखने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में स्कैन की गई छवि खोलें, और जो तरंग दैर्ध्य देखा जाता है, साथ ही इसके विपरीत, चमक, और वृद्धि raw छवि या कुल मात्रात्मक उत्सर्जन को बदलने के बिना दिखाया समायोजित करें ।
  3. परिमाण के लिए प्रमुख क्षेत्रों की पहचान और पृष्ठ के शीर्ष के साथ विश्लेषण टैब का चयन करें, तो आयत ड्रा का चयन करें (या दीर्घवृत्त ड्रा/
  4. आयत का आकार देखने के लिए, स्क्रीन के नीचे बाईं ओर आकृतियों का चयन करें, फिर नीचे दाईं ओर स्तंभों का चयन करें । आकृति आकार की पहचान करने के लिए ऊंचाई और चौड़ाई स्तंभ जोड़ें ।
    नोट: यह परिमाण आकार के लिए नियंत्रण महत्वपूर्ण है जब मात्रा की तुलना । यह वांछित परिमाणन स्थान के भीतर रखा समान आकार का उपयोग करने की सिफारिश की है, ताकि उस क्षेत्र के लिए उत्सर्जन का एक सटीक नमूना प्राप्त करने के लिए ।
  5. फिर आकार और दोहराने का नाम है । सभी क्षेत्रों के नमूनाकृत होने के बाद स्तंभ टैब से उपलब्ध डेटा एकत्रित और विश्लेषित किया जा सकता है.

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Representative Results

पहले उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्कैनिंग इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए उपयोग करने के लिए, प्रोटोकॉल काम करता है एक सत्यापित करना चाहिए । यह एक सत्यापन परख का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है, जहां एक ही जानवर से मस्तिष्क वर्गों प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इंक्यूबेटेड हैं, माध्यमिक एंटीशरीर अकेले, या न तो प्राथमिक और न ही माध्यमिक एंटीबॉडी । ऐसे मांयता परख के लिए परिणाम चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । इस अभिक्रिया में हम पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस तथा amygdala में तत्काल शीघ्र जीन ग-जून का पता लगा रहे थे । सी-जून अभिव्यक्ति केवल तब देखी गई जब मस्तिष्क के ऊतकों पर प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी लागू की गई ।

चित्र 3 में प्रमस्तिष्कखंड नाभिक में दोहरी प्रोटीन का पता चलता है । इस प्रयोग में हमने α-अमीनो-3-हाइड्रॉक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोऑक्टालेप्रोपिओनिक अम्ल (म्पा) ग्राही तथा एन-मिथाइल-डी-aspartate रिसेप्टर (एनएमडीए) के NR2A उपएकक को समान मस्तिष्क ऊतक में GluR1 की उपएकक की जांच की । इससे हमें amygdala के उप-नाभिक में AMPA/एनएमडीए रिसेप्टर्स के अनुपात की जांच करने की अनुमति दी गई । यह अनुपात लर्निंग और मेमोरी11,12का न्यूरोबायोलॉजिकल सिग्नेचर है । के रूप में 3 चित्रामें देखा जा सकता है, GluR2 के लिए संकेत (७८० एनएम हल्के हरे रंग में रंगीन छद्म) और NR2A (६८० एनएम प्रकाश लाल रंग में छद्म) मस्तिष्क के ऊतकों कि प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी को उजागर किया गया में मनाया जा सकता है ।

चित्रा 4 से पता चलता है कि कैसे मतलब है और प्रोटीन अभिव्यक्ति के सामान्यीकृत उपायों के अधर हिप्पोकैम्पस में उच्च संकल्प स्कैन से प्राप्त किया जा सकता है । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, एक आयत ब्याज के क्षेत्र में रखा जाता है (CA1 की आणविक परत) और आकार से प्रकाश की मतलब तीव्रता fluorophore अभिव्यक्ति का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्र 4a). बदले में, यह प्रोटीन अभिव्यक्ति (यानी, प्रतिजन-प्राथमिक एंटीबॉडी-सेकेंडरी एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स) का एक पैमाना है । आकृति को किसी ऐसे क्षेत्र में भी रखा जा सकता है जो सामान्यीकृत वक्र प्राप्त करने के लिए उच्च संकेत और निम्न संकेत व्यक्त करता है (चित्र 4B) । इस उदाहरण में, एक आयत CA1 के आणविक परत भर में रखा गया था, लेकिन द्रुमाकृतिक क्षेत्रों के रूप में अच्छी तरह से कवर किया है, जो सी के महत्वपूर्ण मात्रा में व्यक्त नहीं किया था इस परख में जून । तब वक्र के नीचे के क्षेत्र का उपयोग प्रोटीन व्यंजक के माप के रूप में किया जा सकता है । यदि एक प्रयोग में सेटअप उपचार समूहों (जैसे, तनाव जोखिम) और एक नियंत्रण शामिल है, मस्तिष्क में प्रोटीन अभिव्यक्ति में सापेक्ष परिवर्तन प्राप्त किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्राथमिक (1 सेंट) और माध्यमिक (2nd) एंटीबॉडी या सिर्फ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रिएक्शन का चित्रण। भरे हुए काले घेरे एक लेबल का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो एक ऑक्सीडाइजिंग एजेंट हो सकता है, जैसे सहिजन peroxidase या एक fluorophore जैसे बोरान-डाइपाइरामेथीन (BODIPY) । हरित वर्ग प्रतिजन का प्रतिनिधित्व करते हैं (ब्याज की प्रोटीन पर) इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रिएक्शन में पता लगाया जा रहा है ।

Figure 2
चित्रा 2 : सी का पता लगाने के लिए एक सत्यापन परख के चित्र जून । इस परख में, एक ही जानवर से ऊतक एक खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इलाज किया गया था कि सी पहचानता है-जून और बकरी एंटीबॉडी ७८० एनएम पर उत्सर्जन के साथ संलग्न fluorophore के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी (हरे रंग में रंगीन छद्म, बाएं पैनल) । आसंन ऊतक या तो माध्यमिक एंटीबॉडी अकेले (मध्य पैनल) या कोई एंटीबॉडी (सही पैनल) के साथ इलाज किया गया । स्केल पट्टी = 1 मिमी ।

Figure 3
चित्रा 3 : सत्यापन परख के लिए डबल लेबलिंग immunohistochemical प्रतिक्रिया में amygdala । एक ही चूहे से triplicate मस्तिष्क वर्गों या तो खरगोश एंटीबॉडी कि पहचानता है GluR1 और माउस एंटीबॉडी है कि NR2A पहचानता (बाएं पैनलों), माध्यमिक एंटीबॉडी (मध्य पैनलों), या कोई एंटीबॉडी (सही पैनलों) । GlurR1 बकरी विरोधी खरगोश 800cw माध्यमिक एंटीबॉडी (७८० एनएम, हरे रंग में छद्म) के साथ कल्पना की थी और NR2A एक बकरी antimouse 680rd माध्यमिक एंटीबॉडी (६८० एनएम, लाल रंग में छद्म) का उपयोग कर कल्पना था । स्केल पट्टी = 1 मिमी. ot = ऑप्टिक पथ; आईसी = आंतरिक कैप्सूल; ec = बाहरी कैप्सूल । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : मस्तिष्क के ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति के अर्द्ध मात्रात्मक उपाय प्राप्त करना । (A और B) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि स्कैनर से छवियों का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है में छवियों रन के स्क्रीनशॉट । ऊतक अधर हिप्पोकैम्पस से था और सी-जून कल्पना करने के लिए इलाज किया ।  इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस लेख में प्रस्तुत परिणामों से पता चलता है कि उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ संयोजन में के पास अवरक्त immunocytochemistry के अर्द्ध मस्तिष्क के ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक उपाय प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह भी एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में एक साथ दो प्रोटीन लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम पहले से कई मस्तिष्क क्षेत्रों9,10में तत्काल जल्दी जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए पास-अवरक्त immunohistochemistry रसायन का इस्तेमाल किया है । तत्काल जल्दी जीन तंत्रिका गतिविधि के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हम भी प्रोटीन अभिव्यक्ति के इन अर्द्ध मात्रात्मक उपायों के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए है कि हमें तत्काल जल्दी जीन के सहसंबद्ध स्तर के साथ मस्तिष्क क्षेत्रों समूह के लिए अनुमति दी (IEGs) के अधीन । हम कार्यात्मक संपर्क के एक उपाय के रूप में यह परीक्षण कैसे तनाव भावनात्मक सीखने और स्मृति9,10के दौरान भय सर्किट के भीतर नोड्स के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी को प्रभावित करता है के रूप में इस्तेमाल किया । हमने दिखाया कि कैसे AMPA/एनएमडीए अनुपात (सीखने और स्मृति के एक हस्ताक्षर) के पास का उपयोग कर मापा जा सकता है अवरक्त immunocytochemistry उच्च संकल्प के साथ13स्कैनिंग. इसी तरह की तकनीक से आणविक संकेतन को निर्धारित करने के लिए पैन और फॉस्फोप्रोटीन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह वेस्टर्न ब्लॉट14का उपयोग कर पूरा किया है । हालांकि, यह मोटी मस्तिष्क स्लाइस से बाहर मस्तिष्क क्षेत्रों विदारक की आवश्यकता है और छोटे मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए उत्तरदायी नहीं है । इस मुद्दे को दरकिनार उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ अवरक्त immunocytochemistry के साथ प्रयोग किया जा सकता है । अंत में, सभी immunocytochemistry छवियों डिजीटल रहे हैं, जो असीमित भंडारण और पिछले assays हैं की सुविधाजनक पुनः विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.

सभी तरीकों के साथ के रूप में वहां कमियां हैं । उच्च विभेदन वाले स्कैनरों में कोई आवर्धन नहीं होता और ऊतक का उपचार प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी तकनीकों के प्रयोग की जांच के लिए आसानी से अनुमति नहीं देता है । यहां तक कि मस्तिष्क से वैकल्पिक स्लाइस लेने का काम नहीं कर सकते, संनाभि माइक्रोस्कोपी perfused मस्तिष्क के ऊतकों में सबसे अच्छा काम कर सकते हैं, लेकिन उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ निकट अवरक्त इमेजिंग आमतौर पर फ्लैश जमे हुए दिमाग पर किया जाता है । विशिष्ट ंयूरॉंस में प्रोटीन अभिव्यक्ति (जैसे, interneuron बनाम पिरामिडी ंयूरॉन) या मस्तिष्क में विभिंन प्रकार के कोशिका (जैसे, ंयूरॉंस बनाम glia) का उपयोग कर निर्धारित नहीं किया जा सकता है के पास अवरक्त immunocytochemistry उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ । सत्यापन assays प्रदर्शन महत्वपूर्ण है के रूप में यह अभी भी मस्तिष्क के ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए एक अपेक्षाकृत नई विधि है ।

जब उचित इस्तेमाल किया, के पास अवरक्त immunocytochemistry उच्च संकल्प स्कैनिंग के साथ लाभ प्रदान करता है । मस्तिष्क के ऊतकों में autofluorescence के निकट अवरक्त रेंज में कम है, अर्द्ध प्रोटीन अभिव्यक्ति के मात्रात्मक उपाय प्राप्त किया जा सकता है, एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में दो प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्राप्त किया जा सकता है, और परख की छवियों को अनिश्चित काल के संग्रहीत किया जा सकता है । जब सही प्रोटीन के साथ बनती है और/या सांख्यिकीय विधि इस तकनीक के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तंत्रिका गतिविधि, आणविक संकेतन, और मस्तिष्क के भीतर कार्यात्मक कनेक्टिविटी ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस रिपोर्ट में अनुसंधान का वित्तपोषण डीके को दिए गए एनआईजीएमएस (1P20GM103653) से लक्षित अनुदान द्वारा किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Extraction
Anesthesia Induction Chamber Kent Scientific VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine Harvard Apparatus 73-1920
Friedman Rongeur Fine Science Tools 16000-14 used to remove back of skull
Delicate Dissecting Scissors Fischer Scientific 08-951-5 used to cut upward along midline of skull
Micro Spatula Fischer Scientific 21-401-5 used to scoop out brain
Glass Microscope Slides Fischer Scientific 12-549-6
Immunohistochemical Reaction
 Triton X-100 Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody 
Tween-20 Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scanner Licor Biotechnology Inc.
Image Studio Licor Biotechnology Inc.

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References

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Kimmelmann-Shultz, B., Mohmammadmirzaei, N., Caplan, J., Knox, D. Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59685, doi:10.3791/59685 (2019).More

Kimmelmann-Shultz, B., Mohmammadmirzaei, N., Caplan, J., Knox, D. Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59685, doi:10.3791/59685 (2019).

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