Summary
Burada, İmmünohistokimya ve yüksek çözünürlüklü beyin bölgelerinin proteinleri için tarama ile birlikte yakın kızılötesi boyalar kullanan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Nörobilim, beyindeki hücrelerin çeşitli fonksiyonları nasıl Arabulmaya çalışışıdır. Hücresel fonksiyon hücre proteinlerinin bileşimi ve aktivitesi ile belirlendiği için nöronlar ve glia 'da protein ifadesinin ölçülmesi Nörobilim çalışması için önemlidir. Bu yazıda, immünosittokimya 'nın farklı beyin bölgelerinde yarı niceliksel bir protein ifadesi sağlamak için yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü taramayla nasıl birleştirildiğini açıklayacağız. Bu teknik aynı beyin bölgesinde tek veya çift protein ifadesi için kullanılabilir. Bu moda proteinleri ölçme deneysel manipülasyon ile protein ifadesinde göreceli bir değişiklik elde etmek için kullanılabilir, öğrenme ve bellek moleküler imza, moleküler yollardan aktivite, ve birden fazla beyin bölgelerinde nöral aktivite. Doğru proteinleri ve istatistiksel analizi kullanarak, beyin bölgeleri arasında fonksiyonel bağlantı da tespit edilebilir. İmmünosittokimya bir laboratuvarda uygulama kolaylığı göz önüne alındığında, yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü tarama ile immünsitokimya kullanarak bir sistem düzeyinde nörobiyolojik süreçleri incelemek için Nörobilim yeteneği genişletebilirsiniz.
Introduction
Nörobilim çalışma beyin hücrelerin belirli fonksiyonları aracı nasıl bir soruşturma endişeleri1. Bu nasıl glia hücrelerinin merkezi sinir sisteminde dokunulmazlık görüşmek gibi doğada hücresel olabilir ya da dorsal hipokampus nöronların aktivitesinin mekansal navigasyon neden açıklamak amacı deneyler içerebilir. Geniş anlamda, hücresel fonksiyon, bir hücrede ifade edilen proteinler ve bu proteinlerin aktivitesi2ile belirlenir. Sonuç olarak, beyin hücrelerinde proteinlerin ifade ve/veya etkinliğini ölçmek Nörobilim çalışması için önemlidir.
Beyindeki protein ifadesini ölçmek için bir dizi teknik mevcuttur. Bu reseptör yoğunlukları için pozitron emisyon topografyası gibi in vivo yöntemleri içerir3 ve küçük peptitler için mikro-diyaliz4. Daha sık, ex vivo yöntemleri protein fonksiyonu ve ifade incelemek için kullanılır. Bunlar arasında kütle spektrometresi teknikleri5, Batı leke ve enzim bağlantılı İmmünosorbent tahlil (ELISA)6ve immünositokimya7yer aldı. İmmünositokimya Nörobilim alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknik, bir protein (veya antijen) ilgi (örn., c-fos) ve proteinli primer antikor kompleksi (Şekil 1) tespit etmek için konjonk ikincil antikor algılamak için birincil antikor kullanımını içerir. Protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksinin algılanmasını sağlamak için, ikincil antikorlar, onlara konjuze edilen horserpu peroksidaz (HRP) gibi maddelere oksitleyici sahiptir. Bu ışık mikroskobu7kullanılarak tespit edilebilir hücrelerde çökeller oluşumu için izin verir. İkincil antikorlar da onlara (yani, fluorophores) conjuated kimyasallar floresan olabilir. Ne zaman bu kimyasallar uyarıcı protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksleri7algılamak için kullanılabilir ışık, yayar. Son olarak, bazen primer antikorlar azalan ajanlar ve floresan kimyasallara bağlı olarak ikincil antikorlara olan ihtiyacını doğrudan ihmal ediyorlar7 (Şekil 1).
İlginçtir, birçok immünosittokimya yöntemleri beyin hücrelerinde proteinlerin görselleştirme için izin, ancak belirli bir hücre veya beyin bölgesinde protein miktarını ölçmek için yeteneği. Azaltma reaksiyonlarının çökmesini algılamak için ışık mikroskobu kullanarak nöronların ve glia görselleştirme için izin verir, ancak bu yöntem hücrelerde veya belirli bir beyin bölgesinde protein ifadesi ölçmek için kullanılamaz. Teorik olarak, fluoresan mikroskobu için kullanılabilir, çünkü floresan ikincil antikor yayılan ışık protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksi bir ölçüsüdür. Ancak, beyin dokusunda otofloresans, beyin dokusunda protein ifadesini ölçmek için Floresan Mikroskobu kullanmak zor yapabilir8. Sonuç olarak, beyin dokusu floresan görüntülerden yayılan ışık nadiren beyinde protein ifadesi ölçmek için kullanılır.
Bu konuların çoğu yüksek çözünürlüklü tarama9,10ile birlikte yakın kızılötesi immünosittokimya kullanılarak ele alınabilir. Bu yazıda, yakın kızılötesi emisyon spektrumunda fluorophores ile birleşen immünositozin, yüksek çözünürlüklü tarama (örneğin, 10 – 21 μm) ile birleştirilip farklı beyin bölgeleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol Delaware Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (IAUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol için yaklaşık 55 – 75 gün eski erkek Sprague Dawley fareler kullanıldı.
1. beyin ekstraksiyon ve doku hazırlama
- Anestezi indüksiyon odasında isofluran ile sıçan artık ayak tutam bir yanıt sergiler kadar fare anestezize.
- Bir Giyotin kullanarak hızlı deplitasyon ile fareler feda.
- Kafatası arka ön ve kafatası üst açık deri kes.
- Dikkatli bir şekilde kafatası arka parçasını kaldırmak için rongeurs kullanın ve sonra küçük Diseksiyon makas kullanarak kafatası orta çizgi aşağı kesmek, beyin dokusu zarar görmesini önlemek için her zaman kafatası üst karşı yukarı iterek.
- Beyin ortaya çıkarmak için kafatasının yarısını sağ ve sol soyulmak için rongeurs kullanın.
- Beyin altında kepçe için küçük bir spatula kullanın ve sinirleri sever, dikkatle beyin yükseltmek ve kuru buz üzerinde soğutulmuş isopentane beyni dondurmak (en az-20 °C). Bundan sonra, beyin a-80 ° c dondurucuya kadar dilimleme kadar saklayın.
- -9 °C ve-12 °C arasında tutulan bir kriyostat içinde 30 – 50 μm ' lik ilgi bölgelerindeki beyni dilimleyin. Doğrudan cam slaytlar üzerine dilimleri monte ve a-80 °c buzluğu immünositokimya tahlil zamana kadar saklayın.
Not: Bu protokolde beyin bölgelerinde Hippocampus ve amigdala vardı.
2. tek Immünhistokimyasal reaksiyon
Not: Çift immünhistokimyasal reaksiyon için, protokol tek immünhistokimyasal reaksiyon ile aynıdır, ancak bu reaksiyon farklı konakların iki primer antikoruna sahiptir (örneğin, tavşan ve fare) ve karşılık gelen iki ikincil antikorlar tek bir konak (örneğin, keçi antirabbit ve keçi antimouse) olmalıdır. İkincil antikorlar da yüksek çözünürlüklü tarayıcılar mevcuttur iki farklı Spectra olması gerekir. Örneğin, 680 Nm 'de bir emisyon spektrumunun zirvesine sahip bir ikincil antikor ve bir ikincil antikor 800CW (780 nm 'de emisyon spektrumunun zirvesinde).
- Dondurucudan cam slaytları çıkarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
- Bir duman kaputu altında, 0,1 M fosfat tampon tuzlu (PBS) Oda sıcaklığında 1 − 2 h için% 4 civarında formaldehite beyin dokusu düzeltin.
- 0,1 M Tris tamponlu tuz (TBS) içinde 10 dakika boyunca üç kez durulayın. 30 − 60 dakika boyunca hafif bir deterjanla (örn.% 0,01 deterjan) slaytları inküten hücre membranlarını geçirgen.
- TBS 'deki slaytları her biri 15 dakika boyunca üç kez durulayın.
- Doğru konsantrasyon PBS ilgi protein için primer antikor seyreltilme. Örneğin, hemen erken gen c-fos algılamak için, 1:500 bir konsantrasyon bir tavşan primer Anti c-fos antikor hazırlayın.
- Doğrudan beyin dokusu üzerine pipet primer antikor çözeltisi (yaklaşık 200 μL başına 3 inç x 1 inç slayt).
- 4 °C ' de oda sıcaklığında 1 − 2 saat ya da gece (~ 17 saat) için primer antikor seyreltme sırasında beyin dokusunu cam slaytlarda tutmak için kapak fişi kullanın.
- Her biri için dört kez (örneğin,% 0,01 deterjan, "TBS-T") eklenen küçük bir deterjan miktarı olan TBS 'de kapak kuponları ve yıkama kaydırakları çıkarın.
- 2 h için oda sıcaklığında ikincil bir antikor içinde beyin bölümlerini kulkaymak için Cover, kullanın.
Not: İkincil antikor, doğru seyreltme ve TBS, deterjan ve ana serumun% 1,5 ' ü içeren bir seyreltilme olmalıdır. Örneğin, 1:2000 ' in seyreltilmesi sırasında bir keçi ikincil antikor% 1,5 keçi serumu ve% 0,05 deterjan içerir. - TBS-T ' y i her biri 20 dakika boyunca dört kez ve sonra TBS 'de 20 dakika boyunca dört kez durulayın.
- Karanlık bir gecede oda sıcaklığında kuru slaytlar. Slaytlar kuru olduğunda, görüntüleme için hazırdır.
3. görüntüleme
- Doku aşağı bakacak şekilde yakın kızılötesi tarama arayüzü üzerine slaytlar yerleştirin. Bir seçim aracını kullanarak bir defada bir cam slayt veya birden fazla slayt görüntü.
- 0 Nm uzaklığı ve 21 μm çözünürlüğe sahip en yüksek kalitede ayarı kullanarak görüntü slaytları. Tarama genellikle kullanılan tarama ekipmanınıza bağlı olarak 13 − 19 h alacaktır.
- Görüntü analiz yazılımına (örn. ImageStudio) görüntüleri içe aktarın ve yarı nicel protein analizini görüntüleyin ve işaretleyin.
4. protein Ifadesi Analizi
- Görüntü analiz yazılımını açın ve görüntünün tarandığı çalışma alanını seçin.
- Taramayı görüntülemek için görüntü analiz yazılımında taranan görüntüyü açın ve Ham görüntüyü veya toplam nicelik emisyonu değiştirmeden gösterilen kontrast, parlaklık ve büyütme gibi hangi dalga boylarının görüntülendiği ayarlayın.
- Ölçüme yönelik anahtar bölgeleri tanımlayın ve sayfanın üst kısmındaki analiz sekmesini seçin, ardından dikdörtgen çizin (veya elipsi çizin/FreeHandçizin), nicelleştirilir alan üzerinde bir dikdörtgen çizin.
- Dikdörtgenin boyutunu görüntülemek için ekranın sol alt tarafındaki şekiller 'i seçin, ardından sağ alt tarafında sütunlar 'ı seçin. Şekil boyutunu tanımlamak için Yükseklik ve Genişlik sütunları ekleyin.
Not: Ölçü miktarını karşılaştırırken şekil boyutunu kontrol etmek önemlidir. O bölge için emisyonların doğru bir şekilde örnekleme elde etmek için, istenilen miktarın içinde yer alan özdeş şekiller kullanılması önerilir. - Sonra şekli adlandırın ve tekrarlayın. Tüm bölgeler örneklendikten sonra sütunlar sekmesinden kullanılabilen veriler toplanabilir ve analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İmmunhistokimya için yüksek çözünürlüklü tarama kullanmadan önce, bir protokol çalıştığını doğrulamak gerekir. Bu aynı hayvanın beyin bölümleri birincil ve ikincil antikorlar, ikincil antikor tek başına, ya da ne birincil ne de ikincil antikor ile inkübe bir doğrulama tahlil kullanılarak gerçekleştirilebilir. Böyle bir doğrulama tahlil sonuçları Şekil 2' de gösterilir. Bu reaksiyonda, dorsal hipokampus ve amigdala 'da hemen erken gen c-Jun tespit edildi. C-Jun ifadesi sadece beyin dokusuna primer ve ikincil antikorlar uygulandığında gözlenmiştir.
Şekil 3 , amigdala çekirdeğinde çift protein tespiti gösterir. Bu denemede α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazolepropionik asit (AMPA) reseptörün GluR1 altbirim 'i ve aynı beyin dokusunda N-metil-D-aspartat reseptörü (NMDA) reseptörinin NR2A alt grubunu tespit ettik. Bu bize amygdala alt çekirdekleri AMPA/NMDA reseptörlerinin oranını incelemek için izin verdi. Bu oran, öğrenme ve bellek11,12nörobiyolojik bir imzandır. Şekil 3' te görüldüğü gibi, GluR2 için sinyal (780 nm ışık sözde yeşil renkli) ve NR2A (680 Nm ışık pseudo kırmızı renkli) sadece primer ve ikincil antikorlara maruz kalan beyin dokusunda görülebilir.
Şekil 4 , ventral hipokampus yüksek çözünürlüklü taramalar protein ifade ne kadar ortalama ve normalleştirilmiş ölçümleri elde edilebilir gösterir. Görüntü analiz yazılımını kullanarak, bir dikdörtgen ilgi bölgeye (CA1 molekül tabakası) yerleştirilir ve şekil ışık yoğunluğu fluorophore ifade ölçüsü olarak kullanılabilir (Şekil 4A). Buna sırayla, bu protein ifadesi bir ölçüsüdür (yani, antijen-primer antikor-ikincil antikor kompleksi). Şekil Ayrıca, normalleştirilmiş bir eğri elde etmek için yüksek sinyal ve düşük sinyal ifade eden bir bölge boyunca yerleştirilebilir (Şekil 4b). Bu örnekte, bir dikdörtgen CA1 molekül tabakası arasında yerleştirilmiş, ancak dendritik alanları da, bu tahlil c-Jun önemli miktarlarda ifade etmedi kaplanmıştır. Eğrinin altındaki alan daha sonra protein ifadesinin bir ölçüsü olarak kullanılabilir. Bir denemede kurulum tedavi grupları (örneğin, stres pozlama) ve bir kontrol içeriyorsa, beyinde protein ifadesinde göreli değişiklikler elde edilebilir.
Şekil 1 : Primer (1 St) ve ikincil (2ND) antikorları veya sadece primer antikor kullanarak immünhistokimyasal reaksiyonunun Illustration. Dolu siyah çevrelerde bir etiket temsil eder, bu gibi bir oksitleyici ajan olabilir horserpu peroksidaz veya Boron-dipyrromethene gibi bir fluorophore (BODIPY). Yeşil kareler immünohistokimyasal reaksiyonda algılanan antijen (faiz proteini) temsil eder.
Şekil 2 : C-Haziran tespiti için bir doğrulama tahlil görüntüleri. Bu tahlil, aynı hayvanın doku c-Jun ve keçi antirabbit ikincil antikor ile 780 nm emisyon ile ekli fluorophore tanıyan bir tavşan primer antikor ile tedavi edildi (yeşil renkli sahte, sol panel). Bitişik doku ya ikincil antikor tek başına (orta panel) ya da hiçbir antikor (sağ panel) ile tedavi edildi. Ölçek çubuğu = 1 mm.
Şekil 3 : Amigdala çift etiketleme immünhistokimyasal reaksiyon Için doğrulama tahlil. Aynı sıçan triplicate beyin bölümleri ya GluR1 ve NR2A (sol paneller), ikincil antikor (orta paneller), ya da hiçbir antikor (sağ paneller) tanıyan fare antikor tanıyan tavşan antikor maruz kaldı. GlurR1 keçi Anti tavşan 800CW ikincil antikor ile görselleştirildi (780 nm, pseudo yeşil renkli) ve NR2A bir keçi antimouse 680RD ikincil antikor kullanılarak görselleştirildi (680 Nm, sahte kırmızı renkli). Ölçek çubuğu = 1 mm. ot = optik sistem; IC = iç kapsül; EC = harici kapsül. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Beyin dokusunda protein ifadesinin yarı nicel önlemleri elde edilmesi. (A ve B) tarayıcıdan görüntüleri çözümlemek için kullanılan görüntü analiz yazılımında atılan görüntülerin ekran görüntüleri. Doku ventral hipokampus 'tan oldu ve c-Jun ' a görselleştirmek için tedavi edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede sunulan sonuçlar, yüksek çözünürlüklü tarama ile birlikte yakın kızılötesi immünsitokimya beyin dokusunda protein ifadesi yarı niceliksel önlemler elde etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Aynı beyin bölgesinde aynı anda iki proteini etiketlemek için de kullanılabilir. Daha önce birden fazla beyin bölgelerinde hemen erken gen ifadesi ölçmek için yakın kızılötesi immünhistokimya kullandık9,10. Hemen erken genler nöral aktivite ölçüsü olarak kullanılabilir. Ayrıca bu yarı-niceliksel ölçümlerin, beyin bölgelerini hemen erken genlerin (Iegs) ilişkili düzeyleriyle gruplandırmamıza izin veren istatistiksel analizlere de maruz kaldık. Bu fonksiyonel bağlantı bir ölçü olarak nasıl stres duygusal öğrenme ve bellek9,10sırasında korku devresi içinde düğümler arasında işlevsel bağlantı etkiler incelemek için kullanılır. AMPA/NMDA oranlarının (öğrenme ve hafızanın imzası) yüksek çözünürlüklü tarama13ile yakın kızılötesi immünosittokimya kullanılarak nasıl ölçüleceğini gösterdik. Benzer bir teknik, moleküler sinyalizasyon belirlemek için Pan ve phospho-proteinleri ölçmek için kullanılabilir. Bu Batı leke14kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, bu kalın Beyin dilimleri dışında beyin bölgeleri diseksiyon gerektirir ve küçük beyin bölgeleri için izin verilmez. Bu sorun, yüksek çözünürlüklü tarama ile yakın kızılötesi immünosittokimya kullanılarak kaçınılabilir. Son olarak, tüm immünosittokimya görüntüleri, sınırsız depolama ve önceki analizlerinin uygun yeniden analizi için izin verir, dijimleştirilmiş.
Tüm yöntemlerle olduğu gibi dezavantajları vardır. Yüksek çözünürlüklü tarayıcılardan büyütme yoktur ve doku tedavisi floresan mikroskobik teknikleri kullanarak probleme için kolayca izin vermez. Konfokal mikroskopisi perfkullanılmış beyin dokusunda en iyi çalışabilir, ancak yüksek çözünürlüklü tarama ile yakın kızılötesi görüntüleme genellikle flaş dondurulmuş beyinleri yapılır çünkü beyin alternatif dilimleri almak, işe yaramazsa olabilir. Spesifik nöronlar (örneğin, interneuron vs. piramit neuron) veya beyinde farklı hücre tipleri (örneğin, nöronlar vs. glia) protein ifadesi, yüksek çözünürlüklü tarama ile yakın kızılötesi immünosittokimya kullanılarak belirlenemez. Bu hala beyin dokusunda protein ifadesi incelemek için nispeten yeni bir yöntem olduğu gibi doğrulama incelenmesi gerçekleştirmek önemlidir.
Uygun kullanıldığında, yüksek çözünürlüklü tarama ile yakın kızılötesi immünosittokimya avantajları sunar. Beyin dokusunda autofluorescence yakın kızılötesi aralığında azalır, protein ifadesinin yarı nicel önlemleri elde edilebilir, aynı beyin bölgesinde iki proteinin ifadesi elde edilebilir, ve tahlil görüntüleri sonsuza kadar depolanabilir. Doğru protein ve/veya istatistiksel yöntem ile eşleştirilmiş zaman bu teknik protein ifadesi incelemek için kullanılabilir, nöral aktivite, moleküler sinyalizasyon, ve beyin içinde işlevsel bağlantı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu raporda yapılan araştırmalar, NIGMS 'den (1P20GM103653) DK 'ya verilen bir hedef hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
