Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kvantificering af subcellulære Ubiquitin-proteasome aktivitet i gnaver hjernen

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/59695
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Denne protokol er designet til effektivt at kvantificere ubiquitin-proteasome system (UPS) aktivitet i forskellige cellulære rum i gnaver hjernen. Brugere er i stand til at undersøge UPS funktion i nukleare, cytoplasmatiske og synaptiske fraktioner i det samme dyr, hvilket reducerer mængden af tid og antal dyr, der er nødvendige for at udføre disse komplekse analyser.

Abstract

Ubiquitin-proteasome-systemet er en central regulator af protein nedbrydning og en række andre cellulære processer i eukaryoter. I hjernen, stigninger i ubiquitin-proteasome aktivitet er afgørende for synaptisk plasticitet og hukommelse dannelse og afvigende ændringer i dette system er forbundet med en række neurologiske, neurodegenerative og psykiske lidelser. Et af spørgsmålene i at studere ubiquitin-proteasom fungerer i hjernen er, at det er til stede i alle cellulære rum, hvor protein målene, funktionelle rolle og mekanismer regulering kan variere meget. Som et resultat, evnen til direkte at sammenligne hjernen ubiquitin protein målretning og proteasomet katalytisk aktivitet i forskellige subcellulære rum inden for samme dyr er afgørende for fuldt ud at forstå, hvordan UPS bidrager til synaptisk plasticitet, hukommelse og sygdom. Den metode, der er beskrevet her, tillader indsamling af nukleare, cytoplasmiske og rå synaptiske fraktioner fra samme gnaver (rotte) hjerne, efterfulgt af samtidig kvantificering af proteasomet katalytisk aktivitet (indirekte, giver aktivitet af proteasomet kerne og sammenkædning-specifik ubiquitin-protein mærkning. Således kan metoden bruges til direkte at sammenligne subcellulære ændringer i ubiquitin-proteasome aktivitet i forskellige hjerneområder i det samme dyr under synaptisk plasticitet, hukommelse dannelse og forskellige sygdomstilstande. Denne metode kan også anvendes til at vurdere den subcellulære fordeling og funktion af andre proteiner inden for samme dyr.

Introduction

Ubiquitin-proteasome system (UPS) er et komplekst netværk af sammenkoblede proteinstrukturer og ligaser, der styrer nedbrydningen af de fleste kortlivede proteiner i cellerne1. I dette system er proteiner markeret til nedbrydning eller andre cellulære processer/skæbner ved den lille modifikator ubiquitin. Et målprotein kan erhverve 1-7 ubiquitin modifikationer, som kan linke sammen på en af syv lysin (K) sites (K6, K11, K27, K29, K33, K48 og K63) eller N-terminal methionin (M1; som kendt som lineær) i den foregående ubiquitin2. Nogle af disse polyubiquitin-Tags er nedbrydnings specifikke (K48)3, mens andre er stort set uafhængige af protein nedbrydningsprocessen (M1)4,5,6. Således er protein allestedsnærværende proces utrolig kompleks og evnen til at kvantificere ændringer i en bestemt polyubiquitin tag er afgørende for i sidste ende at forstå den rolle, som den givne ændring i cellulære funktion. Yderligere komplicerer studiet af dette system, proteasomet, som er den katalytiske struktur af UPS7, begge nedbryder proteiner, men kan også være involveret i andre ikke-proteolytiske processer8,9. Ikke overraskende da, siden sin første opdagelse, normal og afvigende ubiquitin-proteasome aktivitet har været impliceret i langsigtet hukommelse dannelse og en række sygdomstilstande, herunder mange neurologiske, neurodegenerative og psykiatriske lidelser10,11. Som et resultat, metoder, der effektivt kan kvantificere UPS aktivitet i hjernen er afgørende for i sidste ende at forstå, hvordan dette system er dysreguleret i sygdomstilstande og den endelige udvikling af behandlingsmuligheder rettet mod ubiquitin og/eller proteasomet funktion.

Der er en række problemer med at kvantificere ubiquitin-proteasome aktivitet i hjernevæv fra rotter og mus, som er de mest almindelige modelsystemer, der anvendes til at studere UPS funktion, herunder 1) mangfoldigheden af ubiquitin modifikationer, og 2) distribution og differentieret regulering af UPS fungerer på tværs af subcellulære rum12,13,14. F. eks. anvendte mange af de tidlige demonstrationer af ubiquitin-proteasomet-funktionen i hjernen under hukommelses dannelse hele celle lysater og indikerede tidsafhængige stigninger i både protein ubiquitination og proteasomet Activity15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. vi konstaterede imidlertid for nylig, at ubiquitin-proteasome-aktiviteten varierede bredt på tværs af subcellulære segmenter som respons på læring, med samtidige stigninger i nogle regioner og fald i andre, et mønster, der afviger betydeligt fra hvad der tidligere blev rapporteret i hele cellen lysater21. Dette er i overensstemmelse med begrænsningen af en hel celle tilgang, da det ikke kan adskille bidraget fra ændringer i UPS aktivitet på tværs af forskellige subcellulære segmenter. Selv om nyere undersøgelser har anvendt synaptisk fraktion protokoller til at studere ups specifikt på synapser som svar på læring22,23,24, de anvendte metoder til at måle nukleare og cytoplasmiske ubiquitin-proteasome ændringer i det samme dyr. Dette resulterer i et unødvendigt behov for at gentage eksperimenter flere gange, indsamle en anden subcellulær fraktion i hver. Dette resulterer ikke kun i et større tab af dyre liv, men det eliminerer evnen til direkte at sammenligne UPS aktivitet på tværs af forskellige subcellulære segmenter som reaktion på en given hændelse eller under en bestemt sygdomstilstand. I betragtning af at protein målene for ubiquitin og proteasomet varierer meget i hele cellen, er det afgørende at forstå, hvordan ubiquitin-proteasomet signalering afviger i særskilte subcellulære rum, for at identificere UPS'S funktionelle rolle i hjernen under hukommelse dannelse og neurologiske, neurodegenerative og psykiske lidelser.

For at imødegå dette behov har vi for nylig udviklet en procedure, hvor nukleare, cytoplasmiske og synaptiske fraktioner kan opsamles for en given hjerneregion fra det samme dyr21. For at begrænset mængden af protein, der kan opnås ved at indsamle flere subcellulære fraktioner fra den samme prøve, har vi desuden optimeret tidligere etablerede protokoller til assay in vitro proteasomet aktivitet og sammenkædning-specifikke protein allestedsnærværende i lyserede celler indsamlet fra gnaver hjernevæv. Ved hjælp af denne protokol, vi var i stand til at indsamle og direkte sammenligne indlærings afhængige ændringer i proteasomet aktivitet, K48, K63, M1 og samlede protein polyubiquitination niveauer i kernen og cytoplasmaet og på synapser i lateral amygdala af rotter. Her beskriver vi i detaljer vores procedure (figur 1), som i væsentlig grad kunne forbedre vores forståelse af, hvordan ups er involveret i langsigtet hukommelse dannelse og forskellige sygdomstilstande. Det skal dog bemærkes, at in vitro proteasom aktivitet diskuteret i vores protokol, mens almindeligt anvendt, ikke direkte måle aktiviteten af komplette 26S proteasom komplekser. Snarere, denne analyse måler aktiviteten af 20S kernen, hvilket betyder at det kun kan tjene som en proxy til at forstå aktiviteten af kernen selv i modsætning til hele 26S proteasomet kompleks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, herunder animalske emner er blevet godkendt af Virginia Polytechnic Institute og State University institutionel Animal Care og brug Committee (IACUC).

1. indsamling og dissektion af gnaver hjernevæv

Bemærk: Denne protokol kan anvendes på en række forskellige hjerneområder og anvendes med forskellige vævs indsamlingsprocedurer. Nedenfor er den procedure, der anvendes i vores laboratorium for subcellulære af rotte hjernevæv, ved hjælp af 8-9 uge gamle mandlige Sprague Dawley rotter. For at behandle alle celle segmenter i samme dyr, afsnit 1,3. skal følges, uanset hvilken vævs indsamlings procedure der anvendes.

  1. Uddrag rotte hjernen og Placer i en kryogen kop præ-kølet på tøris. Flash-fryse hjernen på tøris, eller bruge flydende nitrogen, hvis det er muligt, og overføre til en-80 °C fryser. Hjerner kan dissekteres samme dag eller på et senere tidspunkt.
  2. Fjern den frosne hjerne fra kryogen kop og Placer i en rotte hjerne matrix kølet med tøris. Hvert slot på matrixen svarer til 0,5 mm, som kan bruges til at bestemme den omtrentlige placering af interesseområdet (ROI).
    1. Ved hjælp af en rotte hjernen Atlas, indsætte en barberkniv i matrixen umiddelbart foran (anterior) af den forventede start af ROI. Indsæt derefter et barberblad straks ved den forudsagte ende (posterior) af ROI.
    2. Fjern skiven mellem Barber bladene ved hjælp af en skalpel, og Placer den på en mikroskop slide, der afkøles på tøris. Typisk er sektioner 2-3 mm tykke, men dette varierer afhængigt af ROI.
  3. Ved hjælp af en skalpel, dissekere ud ROI en halvkugle ad gangen. Placer hver halvkugle i separate 1,5 mL mikrocentrifuge glas, som er kølet af på tøris. Frosset væv kan straks anvendes til subcellulære fraktionering eller behandles på et senere tidspunkt, hvis de opbevares ved-80 °C.

2. nuklear og cytoplasmisk ekstraktion

Bemærk: Denne protokol bruger premade stamopløsninger af almindeligt laboratoriekemikalier, herunder 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 m dithiothreitol (DTT), 0,5 M ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA), 5 m NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) og 50% glycerol. Hvis endepunkt anvendes i proteasomet aktivitets analyser, kan glycerol og ATP tilsættes til alle buffere for at forhindre demontering af proteasomet komplekser under lysis.

  1. Klargør lyse bufferen. Der tilsættes 8,63 ml ultrarent (deioniseret og destilleret) vand til et sterilt 15 ml konisk rør.
    1. Til det koniske rør tilsættes 1.000 μL 0,1 M HEPES, 15 μL 1 M MgCl, 100 μL 1 M DTT og 50 μL af 10% NP-40.
    2. Tilsæt 100 μL proteasehæmmer cocktail og 100 μL fosfatasehæmmer cocktail. Kortvarigt vortex opløsningen til at blande og placere på våd is til at slappe af. Bemærk, at opløsningen kan have en gul nuance fra fosfatasehæmmeren.
      Bemærk: Brugen af proteasehæmmere er afgørende for at bevare protein og sikre specificiteten af in vitro proteasomet Activity assay. Disse hæmmere kan dog også resultere i en mindre reduktion i proteasomet aktivitet, hvilket betyder, at den aktivitet, der måles på in vitro-analysen, kan være en undervurdering af de faktiske aktivitetsniveauer.
  2. Klargør ekstraktions bufferen. Der tilsættes 5,925 ml ultrarent (deioniseret og destilleret) vand til et sterilt 15 ml konisk rør.
    1. Til det koniske rør tilsættes 2.000 μL 0,1 M HEPES, 1250 μL 50% glycerol, 15 μL 1 M MgCl2,5μl 1 m DTT, 5 μl 0,5 M EDTA og 600 μl af 5 m NaCl.
    2. Tilsæt 100 μL proteasehæmmer cocktail og 100 μL fosfatasehæmmer cocktail. Kortvarigt vortex opløsningen til at blande og placere på våd is til at slappe af. Bemærk, at opløsningen kan have en gul nuance fra fosfatasehæmmeren.
  3. Fjern 1,5 mL centrifuge Micro tube, der indeholder en halvkugle af ROI fra-80 °C fryser. Sørg for, at den anvendte halvkugle afbalanceres på tværs af udvindings forholdene for hver forsøgsgruppe. For eksempel, i en to-gruppe eksperiment, bruge den venstre halvkugle for de to første dyr i hver gruppe og den højre halvkugle for de næste to prøver, osv.
  4. Ved hjælp af en skalpel, overføre den frosne hjernevæv til en 2 mL glas Teflon homogenisator. Tilsæt 500 μL lysis-buffer til Teflon-røret.
    1. Ved hjælp af Pestle B homogeniseres det samme væv med 15 streger, indtil der ikke er nogen synlig mængde fast materiale. Brug en drejebevægelse (med eller mod uret) under hvert strøg.
  5. Ved hjælp af en pipette på 1.000 μL overføres den homogeniserede prøve til et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Anbring røret på våd is og Inkuber i 30 min.
  6. Placer røret i mikrocentrifuge og spin i 10 min ved 845 x g og 4 °c. Efter afslutning fjernes supernatanten forsigtigt ved pipettering og placeres i et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Dette er den Cytoplasmiske fraktion, som kan opbevares på is eller ved 4 °C indtil afsnit 2,9.
  7. Tilsæt 50 μL ekstraktions buffer til den resulterende pellet og resuspension ved pipettering. Du må ikke vortex pellet. Anbring røret med den opslæmmede pellet på is og Inkuber i 30 min.
  8. Anbring røret i mikrocentrifuge og spin i 20 min ved 21.456 x g, 4 °c. Efter afslutning fjernes supernatanten forsigtigt ved pipettering og placeres i et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Dette er den nukleare fraktion. Pellet kan nu kasseres.
  9. Måling af proteinkoncentrationen af cytoplasmatiske og nukleare ekstraktioner ved anvendelse af DC-protein analysen (i henhold til fabrikantens anvisninger) eller en tilsvarende analyse for prøver, som er indsamlet ved hjælp af ikke-ioniske rengøringsmidler. Fortsæt straks til proteasomet Activity assay (afsnit 4) eller Western blotting (punkt 5). Alternativt kan prøverne opbevares ved-80 °C, indtil det er nødvendigt.

3. samling af synaptisk fraktion

Bemærk: Denne protokol bruger premade stamopløsninger af almindeligt laboratoriekemikalier, herunder 1 M tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl og 10% SDS. Hvis endepunkt anvendes i proteasomet aktivitets analyser, kan glycerol og ATP tilsættes til alle buffere for at forhindre demontering af proteasomet komplekser under lysis

  1. Forbered TEVP-bufferen med 320 mM saccharose. Der tilsættes 60 ml ultrarent (deioniseret og destilleret) vand til et rent 100 ml bægerglas.
    1. Til bægerglasset tilsættes 1.300 μL 1 M tris (pH 7,5), 260 μL 0,5 M EDTA, 100 μL proteasehæmmer cocktail, 100 μL fosfatasehæmmer cocktail og 10,944 g saccharose. Bland med en Stir bar, indtil saccharose er helt opløst.
    2. Bring pH til ~ 7,4 ved at tilsætte saltsyre (HCL) dråbevis til opløsningen ved hjælp af en pipette.
    3. Opløsningen overføres til en 100 mL målekolbe. Bring volumen til 100 ml ved at tilføje ultrarent vand. Chill den endelige løsning på isen, indtil det er nødvendigt.
  2. Forbered homogeniserings bufferen. Der tilsættes 60 ml ultrarent (deioniseret og destilleret) vand til et rent 100 ml bægerglas.
    1. Til bægerglasset tilsættes 5.000 μL 1 M tris (pH 7,5), 3.000 μL 5 M NaCl, 100 μL proteasehæmmer cocktail, 100 μL fosfatasehæmmer cocktail og 2.000 μL 10% SDS. Bland med en Stir bar.
      Bemærk: Ionholdige rengøringsmidler kan interferere med proteasomet aktivitets analyser ved at resultere i denaturering af proteasomet-komplekset. Mængden af SDS kunne sænkes for at hjælpe med at bevare proteasomet funktion, hvis det ønskes.
    2. Bring pH til ~ 7,4 ved at tilføje HCL dråbevis til opløsningen ved hjælp af en pipette.
    3. Opløsningen overføres til en 100 mL målekolbe. Bring lydstyrken til 100 ml ved at tilsætte ultrarent vand. Opbevar den endelige opløsning ved stuetemperatur; Undlad at slappe af, da SDS vil udløse en opløsning.
  3. Fjern 1,5 mL centrifuge, der indeholder en halvkugle af ROI fra-80 °C fryser. Sørg for, at den anvendte halvkugle afbalanceres på tværs af udvindings forholdene for hver forsøgsgruppe. For eksempel, i en to-gruppe eksperiment, bruge den venstre halvkugle for de to første dyr i hver gruppe og den højre halvkugle for de næste to prøver, osv.
  4. Ved hjælp af en skalpel, overføre den frosne hjernevæv til en 2 mL glas Teflon homogenisator. Tilsæt 500 μL TEVP-buffer til Teflon-røret.
    1. Ved hjælp af Pestle B homogeniseres det samme væv med 15 streger, indtil der ikke er synlige overførsler af fast materiale. Brug en drejebevægelse (med eller mod uret) under hvert strøg.
  5. Ved hjælp af en pipette på 1.000 μL overføres den homogeniserede prøve til et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Prøven centrifugeres ved 1.000 x g i 10 min., 4 °c.
  6. Supernatanten opsamles og overføres til et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas med en pipette på 1.000 μL. Prøven centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min., 4 °c. Den originale pellet (P1) indeholder kerner og det store snavs og kan kasseres.
  7. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Dette er en Cytosolic fraktion. Tilsæt 50 μL homogenisering buffer til pellet (P2) og resuspension ved pipettering indtil intet solidt materiale er synligt.
  8. Prøven centrifugeres ved 20.000 x g i 10 min., 4 °c. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Dette er den rå Synaptosomal membran (synaptisk) fraktion. Pellet kan kasseres.
  9. Den synaptiske fraktions proteinkoncentration måles ved hjælp af DC-protein analysen (i henhold til producentens anvisninger) eller en tilsvarende analyse for prøver, som er indsamlet ved hjælp af Ioniske rengøringsmidler. Fortsæt straks til proteasomet Activity assay (afsnit 4) eller Western blotting (punkt 5). Alternativt kan prøverne opbevares ved-80 °C, indtil det er nødvendigt.

4. analyse af proteasome-aktivitet

Bemærk: Proteasome aktivitet kan måles i homogeniseret hjernevæv ved hjælp af en let modificeret version af 20S Proteasome aktivitetssæt. Denne analyse måler ikke direkte aktiviteten af komplette 26S proteasomet komplekser. Snarere, det måler aktiviteten af 20S kernen, hvilket betyder at det kun kan tjene som en proxy til at forstå aktiviteten af kernen selv i modsætning til hele 26S proteasomet kompleks. Succesen af denne analyse falder med gentagne fryse-tø cyklusser og/eller stigende niveauer af rengøringsmidler, især ionisk, og kræver brug af en plade læser med en 360/460 (excitation/emission) filter sæt og varme kapaciteter op til 37 °C.

  1. Indstillinger for plade læser: præ-varm til 37 °C og hold gennemkørslen.
    1. Indstil excitation til 360 og emission til 460. Hvis 96 brønd pladen, der anvendes, er klar, skal du indstille optik positionen til bunden. Hvis der anvendes en mørk/sort 96 brønd plade, indstilles optik positionen til toppen.
    2. Indstil ældre plade læser modeller til Auto-Gain under de fluorescerende læse muligheder; nyere modeller er forudindstillet til dette. Program en kinetiske Run med en tid på 2 h, scanning (læsning) hver 30 min.
  2. Den 10x-analyse buffer, der leveres i sættet, rekonstruere med 13,5 ml ultrarent vand. Tilsæt 14 μL 100 mM ATP til nu 1x buffer; Dette øger proteasomet aktivitet i prøverne betydeligt og forbedrer analysens pålidelighed. Den sidste 20S analyse buffer kan opbevares på is eller ved 4 °C, indtil det er nødvendigt, og er stabil i flere måneder.
  3. Rekonstruere AMC standard leveres i kit med 100 μL af DMSO. Udfør dette trin i mørke eller under svagt lys, da standarden er lysfølsom.
  4. Opret en stand kurve af AMC ved hjælp af den rekonstituerede standard, i mørke eller under svagt lys betingelser.
    1. I separate 0,5 mL mikrocentrifuge glas tilsættes 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 og 0 μL af AMC-standarden, hvilket svarer til 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 og 0 μM AMC-koncentration.
    2. Til disse rør, i samme rækkefølge, tilsættes 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 og 100 μL af 20S analyse buffer. Dette skaber en række høje til lave AMC koncentrationer, som vil blive anvendt til plade læseren kalibrering og analyse af proteasomet aktivitet i de homogeniserede prøver.
    3. Opbevar alle fortyndede standarder på is i mørket, indtil det er nødvendigt.
  5. Rekonstruere proteasom substrat (suc-LLVY-AMC), der leveres i kit med 65 μL DMSO. Udfør dette trin i mørke eller under svagt lys, da substratet er lysfølsomt. Opret en 1:20 fortynding af proteasom substrat i et nyt 1,5 mL mikrocentrifuge glas med 20S-analyse buffer. Opbevar det fortyndede substrat på is i mørket, indtil det er nødvendigt.
    Bemærk: For eksempel, hvis pladen vil have 10 prøver og 1 blank, skal du nok fortyndet substrat for 22 brønde (med dubletter) på 10 μL per brønd. Dette svarer til 220 μL har brug for + 30 μL for pipetteringsfejl, der kræver 12,5 μL substrat og 237,5 μL af 20S-analyse buffer.
  6. Tø de ønskede prøver (hvis de er frosne) og tilsæt et normaliseret beløb til en 96 brønd plade. Kør hvert eksempel i dubletter. Den nødvendige prøvemængde varierer afhængigt af vævs præparatet. Generelt er 10-20 μg tilstrækkelig til enhver subcellulær fraktion.
  7. Bring prøvens brønd volumen til 80 μl med ultrarent vand. Den tilsatte mængde afhænger af mængden af tilsat stikprøve. For eksempel, hvis prøve 1 var 4,5 μL protein og prøve 2 var 8,7 μL, så den nødvendige mængde vand vil være 75,5 μL og 71,3 μL hhv. I to separate brønde tilsættes 80 μL vand alene; disse vil være den analyse emner.
    Bemærk: For at begrænse ændringer i protein volumen på grund af pipetteringsfejl kan protein koncentrationerne normaliseres til den mindst koncentrerede prøve. Dette vil gøre det muligt at anvende samme prøvevolumen under alle forhold.
  8. Tilsæt 10 μL af 20S analyse buffer til hver brønd, herunder analyse emner. En repeater/automatiseret pipette anbefales her for at sikre ensartet analyse volumen på tværs af brønde.
  9. Valgfrit: På dette stadium, indføre in vitro manipulationer, hvis det ønskes; Dette vil kræve, at hver prøve har yderligere 2 brønde pr. behandling, herunder køretøjet. I så fald tilsættes 5-10 μL stof/stof af interesse til 2 af prøve brøndene og et tilsvarende volumen af kontrol/køretøj til en anden 2 brønde. Anbring pladen på den forvarmede plade læser eller i en 37 °C-inkubator i 30 minutter.
  10. Sluk lyset, eller Træd ind i et mørkt rum. Tilsæt alle 100 μL fortyndet AMC standarder til en ny brønd; hver standard vil have en enkelt brønd.
  11. I mørket tilsættes 10 μL fortyndet proteasomet substrat til brønde, der indeholder prøve-og analyse emner, men ikke til AMC-standarden. En repeater/automatiseret pipette anbefales her for at sikre ensartet analyse volumen på tværs af brønde.
  12. Anbring pladen i plade læseren, og start den kinetiske kørsel.
    Bemærk: Pladen behøver ikke at være under konstant agitation under den kinetiske kørsel, men brugeren kan vælge at hvis det ønskes
  13. Ved slutningen af den kinetiske løbetur, Eksporter RAW 360/460 fluorescerende værdier til Microsoft Excel.
    1. Gennemsnit sammen duplikerer brønde for hver standard, hver prøve og analysen blank for alle 5 scanninger. Rå fluorescerende værdier bør stige på tværs af scanninger for prøverne, men forbliver stabile (eller falde lidt) for standarder og analyse emner.
    2. Tag den højeste AMC standard godt gennemsnit og dividere med den kendte koncentration (20 μM). Opdel denne værdi ved at prøve koncentrationen anvendes i analysen for at få standardiseret AMC værdi. For hver prøve og analyse blank gennemsnit, dividere med den standardiserede AMC værdi.
    3. Tag denne endelige værdi og divider med den stikprøve koncentration, der anvendes i analysen, for at få den normaliserede værdi for hver prøve og analysen blank. Gør dette for alle 5 scanninger.
    4. Subtrahere den normaliserede analyse blank værdi fra hver normaliseret prøve værdi for alle 5 scanninger.

5. kvantificering af det sammenkoblings specifikke protein allestedsnærværende

  1. Kvantificering af forskellige polyubiquitin-Tags i forskellige subcellulære fraktioner indsamlet fra gnaver hjernevæv bør ske ved hjælp af en række standard Western-blotting-protokoller i kombination med unikke, Lift specifikke polyubiquitin-antistoffer.
    1. For denaturering blandes de normaliserede prøver med en tilsvarende mængde Laemmli-prøve buffer suppleret med β-mercaptoethanol til en procentdel på 5 volumenprocent pr. fabrikantens instruktion.
    2. Til kvantificering af alle ændringer af monoubiquitination og polyubiquitination uanset forbindelsen skal der anvendes et panubiquitin-antistof.
    3. For at genkende alle polyubiquiterede proteiner skal du bruge et ubiquitin-antistof, der ikke krydsreagerer med monoubiquitination.
    4. For sammenkædning-specifik polyubiquitination, brug antistoffer, der kan detektere lysin-27, lysin-48, lysin-63 og lineær (M1) polyubiquitination.
  2. For at forhindre krydskontaminering mellem udviklinger, som kan resultere i en falsk positiv eller forstyrre billeddannelse af en anden ubiquitin modifikation, Strip membraner mellem udviklingen ved hjælp af 0,1 M NaOH i 10 min.
    1. Membraner vaskes i TBS med 0,1% Tween to gange i 10 min og endt (ved hjælp af hvad blokerende middel foretrækkes i den vestlige blot protokol anvendes).
    2. Membranen skal inkubere med det sekundære antistof og reudvikles for at bekræfte, at membranen er blevet frataget de primære og sekundære antistoffer korrekt.
    3. Anbefalet: For en vellykket udvikling af forskellige ubiquitin-antistoffer uden kontaminering skal du bruge fluorescerende eller nær-infrarøde billedbehandlingssystemer. Dette ofte gange kan forhindre overførsel mellem antistoffer.
  3. Nogle ubiquitin Western blot billeder vil give kolonner af forskellige bands (såsom M1), mens andre producerer en smear-lignende mønster med få eller ingen klare linjer (fælles med K48). For kvantificering af afbildet ubiquitin vestlige blots, tegne en boks rundt om kolonnen, der udvider hele molekylære standarder stigen.
    1. Justér boksen op (eller ned), hvis ubiquitin farvning strækker sig gennem hele stigen; Dette er almindeligt for lysin-48 modifikationer og varierer meget på tværs af subcellulære rum.
    2. Fratræk baggrunden, som beregnes som den gennemsnitlige optiske tæthed af baggrunden umiddelbart omkring søjlen på alle sider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde blev der indsamlet nukleare, cytoplasmiske og synaptiske fraktioner fra den laterale amygdala af rotte hjernen (figur 1). Renhed af de enkelte fraktioner blev bekræftet via Western blotting, sondering med antistoffer mod proteiner, der skal beriges eller udtømmes i lysningen. I den første halvkugle, hvor en rå synaptisk fraktion blev indsamlet, postsynaptisk tæthed protein 95 (PSD95) var til stede i den synaptiske, men ikke nukleare, fraktion, med lavere niveauer i cytoplasmaet (figur 2a). Dette er i overensstemmelse med tidligere arbejde, der viser, at den synaptiske fraktion præparat isolerer både præsynaptiske og postsynaptiske komponenter25. Omvendt var det nukleare protein Histon H3 til stede i det nukleare, men ikke den synaptiske, fraktion, med lavere niveauer i cytoplasmaet (figur 2b). Tilstedeværelsen af PSD95 og H3 i cytoplasmaet er i overensstemmelse med deres cytoplasmiske oversættelse. Den cytoplasmiske protein β-Tubulin var til stede i vores cytoplasmiske fraktion, men var stort set fraværende fra det nukleare lysat (figur 2c), med lavere niveauer i den synaptiske region. Dette tyder på, at vi var i stand til at producere en nuklear fraktion, der var stort set fraværende af cytoplasmatiske proteiner. Tilstedeværelsen af Tubulin i den synaptiske region er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser26. Alle tre fraktioner viste tilsvarende niveauer af huset holde protein β-actin (figur 2D), som blev brugt som en lastning kontrol. Kollektivt, disse resultater bekræfter, at renheden af de nukleare, cytoplasmatiske og synaptiske fraktioner indsamlet fra en enkelt rotte lateral amygdala.

Dernæst blev alle lysater bekræftet for funktionel proteasomet aktivitet ved hjælp af den beskrevne modificerede version af in vitro 20s proteasomet Activity assay. I alle lysater blev analysens succes defineret som en stigning i de rå fluorescerende enheder (RFU), der blev detekteret fra den første scanning (0 min) til den femte/sidste scanning (120 min). For alle disse analyser, 10 μM AMC blev brugt som den højeste standard for normalisering af de rå fluorescerende enheder (RFU). I den rå synaptiske fraktion toppede RFU ved Scan 5 (figur 3a), hvilket resulterede i en NORMALISERET RFU på lige under 0,1 (figur 3b). I den cytoplasmiske fraktion steg RFU på tværs af scanninger (figur 3c) med en endelig NORMALISERET RFU på ~ 1,6 (figur 3D). Den nukleare fraktion viste også tidsafhængige ændringer i RFU (figur 3E) med en endelig NORMALISERET RFU på 0,3 (figur 3F). Forskellene i proteasomet aktivitet på tværs af segmenter sandsynligvis afspejler tilgængeligheden af proteasomer i fraktionen, som generelt er mest rigelige i cytoplasmaet og Nucleus27, segmenter, der har den højeste grad af aktivitet i vores Under forberedelse. Det laveste aktivitetsniveau i den synaptiske region er i overensstemmelse med det er det eneste lysat, der blev indsamlet ved hjælp af Ioniske rengøringsmidler, som kan reducere proteasom aktivitet på grund af hårdere Denaturerings tilstand. Det er vigtigt, at RFU ikke steg på tværs af tiden i analyse emnerne eller i lysater (synaptisk) inkuberet med den meget specifikke og potente proteasomet hæmmer clasto-lactacystin-β-lactone (figur 3g, β-Lac), der viser de endelige normaliserede RFU-niveauer af henholdsvis 0,01 og 0,001 (figur 3H). Dette antyder, at den observerede ændring i RFU skyldtes specifikt aktiviteten af proteasomet og ikke andre proteaser. Desuden, når analyseret på tværs af eksperimentelle betingelser, der var en stigning i nuklear, men ikke cytoplasmisk, proteasom aktivitet i lateral amygdala efter læring, som forekom samtidig med et fald i synaptisk proteasom aktivitet i sammenligning med kontroldyrene (figur 4). Tilsammen bekræfter disse resultater, at proteasomet aktivitet kunne måles nøjagtigt i alle tre subcellulære fraktioner indsamlet fra en enkelt rotte lateral amygdala.

En af fordelene ved proteasomet Activity assay er, at in vitro manipulationer kan introduceres til prøverne umiddelbart før tilsætning af proteasomet substrat, som gør det muligt at identificere specifikke molekyler, der kan regulere proteasomet i den pågældende subcellulære fraktion. Som et eksempel på dette, rollen af CaMKII (calcium/calmodulin afhængige protein kinase II) blev vurderet i den synaptiske fraktion, den hårdeste denatureret lysat indsamlet, da CaMKII menes at regulere proteasomet funktion på synapser. En 30 min inkubation med CaMKII-hæmmeren MYR-AIP (myristolayted autocamtide-2-relateret hæmmende peptid) resulterede i en signifikant formindsket stigning i proteasomet aktivitet på analysen, som kun nåede niveauer, der var ~ 61% af de ubehandlede kontrol (figur 5a). Omvendt resulterede den samme manipulation med cytoplasmatiske ikke i en ændring i proteasomet aktivitet fra vehikel behandlede brønde (figur 5b). Disse resultater bekræfter, at proteasomet aktivitet kan blive yderligere manipuleret in vitro, og at denne manipulation kan have forskellige virkninger afhængigt af den subcellulære fraktion indsamlet.

Ud over at kvantificere proteasomet aktivitet, kan den beskrevne protokol bruges til at måle subcellulære forskelle i forskellige ubiquitin modifikationer ved hjælp af Western blot procedurer. Det er vigtigt at bemærke, at de ubiquitin Tags, der kan påvises, er begrænset af tilgængeligheden af sammenkædning-specifikke antistoffer, som i øjeblikket omfatter K48, K63 og M1 for rotter (Bemærk: et K27 antistof er til rådighed, men ikke frembringe et detekterbart billede i nogen laterale amygdala fraktion eller hel celle lysater under en række betingelser). Samlet polyubiquitination, nedbrydning-uafhængig lineær/M1 og K63 allestedsnærværende og nedbrydning-specifik K48 allestedsnærværende blev påvist i alle subcellulære fraktioner. Vigtigere, når analyseret på tværs af forskellige eksperimentelle betingelser, der var en stigning i samlede (figur 6a), lineær (figur 6b), K63 (figur 6C) og K48 (figur 6d) polyubiquitination i den laterale amygdala nuklear fraktion efter læring i forhold til kontroldyrene. Samtidig faldt den samlede polyubiquitination i cytoplasmatiske-regionen, og K48 allestedsnærværende steg efter indlæring, mens synaptisk K63 allestedsnærværende blev reduceret. Tilsammen indikerer disse resultater, at der inden for samme dyr kan påvises subcellulære forskelle i sammenkædningen-specifik protein ubiquitination.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk for subcellulære fraktionering af rotte hjernevæv. Gnaver hjernen udvindes, hjerne regionen dissekeret og halvkugler split. Ved hjælp af en række buffere og centrifugerende trin opsamles nukleare og cytoplasmiske fraktioner fra en halvkugle, mens en rå synaptisk fraktion opsamles fra den anden. Begge fraktioner anvendes derefter til proteasomet aktivitets analyser og Western-blotting, til analyse af protein polyubiquitination niveauer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Bekræftelse af rå synaptisk, nuklear og cytoplasmisk fraktion renhed. (A) den synaptiske protein postsynaptiske density protein 95 (PSD95; 1:1000) var til stede i den synaptiske, men ikke nuklear fraktion med lavere niveauer i cytoplasmaet. (B) Histone H3 (1:500) var til stede i den nukleare, men ikke synaptiske, fraktion med lavere udtryk i cytoplasmaet. (C) β-Tubulin (1:1000) var til stede i cytoplasmic, men stort set fraværende fra den nukleare, fraktion med lavere udtryk i det synaptiske lysat. D) husholdning protein β-actin (1:1000) var til stede i alle subcellulære rum. Områder angiver den forventede størrelse af målproteinet. Dette tal er blevet modificeret fra Orsi, S.A. et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Kvantificering af proteasomet aktivitet i nukleare, cytoplasmiske og synaptiske fraktioner indsamlet fra det samme dyrs laterale amygdala. Under in vitro-aktiviteten af proteasom aktivitet øgedes relative fluorescerende enheder (RFU) fra begyndelsen (Scan 1) til enden (Scan 5) af analysen i de synaptiske (A), Cytoplasmiske (C) og nukleare (E) fraktioner. Kvantificering af denne ændring fra baseline indikerede en normaliseret RFU-værdi (i forhold til 10 μM AMC) på 0,1 i den synaptiske (B), 1,6 i cytoplasmatiske (D) og 0,3 i de nukleare (F) fraktioner. Proteasomet-hæmmeren βlac forhindrede RFUs i at ændre sig på tværs af sessionen (G-H). Dette tal er blevet modificeret fra Orsi, S.A. et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Subcellulære forskelle i proteasomet aktivitet i den laterale amygdala af samme dyr. En stigning i nuklear proteasom aktivitet blev påvist i uddannede (frygt konditionerede) dyr i forhold til kontrol, hvilket svarede til et fald i aktiviteten inden for den synaptiske fraktion. Cytoplasmisk proteasomet aktivitet forblev ved baseline. *P < 0,05 fra kontrol. Dette tal er blevet modificeret fra Orsi, S.A. et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : In vitro-manipulation af proteasomet aktivitet i indsamlede synaptiske og cytoplasmiske fraktioner. In vitro-manipulation af camkii signalering via inhibitor AIP reduceret proteasom aktivitet i den synaptiske (A), men ikke cytoplasmatiske (B), fraktion fra rotte lateral amygdala. Dette tal er blevet ændret fra Jarome, T.J. et al.23. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Subcellulære forskelle i sammenkædning-specifik protein allestedsnærværende i den laterale amygdala af samme dyr efter læring. (A) der var en stigning i den samlede allestedsnærværende i den nukleare fraktion efter indlæring, som korrelerede med et fald i cytoplasmisk fraktion. (B) der var en stigning i lineær allestedsnærværende i den nukleare, men ikke cytoplasmisk eller synaptisk, fraktion efter læring. C) der var en stigning i K63 allestedsnærværende i den nukleare fraktion efter indlæring, som korrelerede med et fald i den synaptiske fraktion. (D) K48 allestedsnærværende stigning i den nukleare og cytoplasmisk, men ikke synaptisk, fraktion efter læring. *P < 0,05 fra kontrol. Alle opnåede ubiquitin optiske tætheder blev normaliseret til β-actin niveauer (lavere repræsentative Western blot billeder i A), som blev brugt som en lastning kontrol. Dette tal er blevet modificeret fra Orsi, S.A. et al.21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi en effektiv metode til at kvantificere ændringer i ubiquitin-proteasome aktivitet på tværs af forskellige subcellulære segmenter i det samme dyr. I øjeblikket er de fleste forsøg på at måle subcellulære ændringer i aktiviteten af ubiquitin-proteasome systemet blevet begrænset til et enkelt rum pr. prøve, hvilket resulterede i behovet for at gentage eksperimenter. Dette fører til betydelige omkostninger og tab af dyrs liv. Vores protokol letter dette problem ved at opdele halvkugler, så forskellige cellulære fraktioner, der skal indsamles fra hver halvkugle af samme dyr. Ved hjælp af denne protokol, vi var i stand til at vise for første gang, at der i samme dyr ubiquitin-proteasome aktivitet differentielt ændringer i nukleare, cytoplasmiske og synaptiske fraktioner som reaktion på læring21.

Den vigtigste begrænsning af den protokol, der er beskrevet her, er det afhænger af mængden af hjernevæv (prøve) opnået. For eksempel, som skitseret ovenfor, denne protokol kræver opdeling halvkugler af en given hjerneregion. Dette kan dog ikke altid være muligt, såsom i tilfælde af visse områder, der kun er til stede på en halvkugle. I disse tilfælde kan protokollen ændres ved først at homogenisere hele hjernen region i TEVP buffer anvendes i den synaptiske fraktion trin (afsnit 3,1), da denne buffer er fri for alle denatureringsmidler. Prøven kan derefter opdeles i to lige store dele efter volumen. Den første del kan bruges til den synaptiske fraktion, efter protokollen som beskrevet. I anden halvdel af prøven kan det ikke-ioniske rengøringsmiddel NP-40 tilsættes til en endelig koncentration på 0,05% efterfulgt af centrifugering som beskrevet i afsnit 2,6. Dette vil tillade adskillelse af cytoplasmatiske proteiner i supernatanten og nukleare proteiner i pellet, som kan isoleres yderligere efter de resterende trin i punkt 2. En anden bekymring i vævs mængden er, at nogle hjerneregioner er meget små i størrelse, såsom prelimbic cortex. I disse tilfælde kan ovennævnte protokol dog stadig anvendes ved at reducere mængderne af de anvendte buffere, som skal bestemmes empirisk ud fra størrelsen af den indsamlede hjerneregion. Således kan denne protokol ændres til selv de vanskeligere hjerneområder, hvor mindre væv er til rådighed.

En af de store fordele ved den protokol, vi skitserer her, er, at den bruger fælles laboratorieudstyr og reagenser, der kan findes i de fleste faciliteter, hvilket gør det muligt for denne metode at kunne ændres til dem selv på et begrænset budget eller med begrænsede ressourcer. Selv om vi skitserer denne protokol som en metode til at måle subcellulære ændringer i ubiquitin-proteasome signalering, kan denne metode også anvendes på enhver anden protein-eller celle proces, hvor forståelsen af cellernes lokalisering og funktion er vigtigt. Således kan denne protokol have brede applikationer til at forstå de subcellulære funktioner af specifikke proteiner eller komplekser under læring og hukommelse eller forskellige sygdomstilstande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Startup midler fra College of Agricultural and Life Sciences og College of Science på Virginia Tech. T.M. er understøttet af George Washington Carver program på Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).

Tags

Neurovidenskab ubiquitin proteasome Nucleus synapse cytoplasma hukommelse hippocampus amygdala
Kvantificering af subcellulære Ubiquitin-proteasome aktivitet i gnaver hjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McFadden, T., Devulapalli, R. K.,… More

McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter