Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subcellular Ubiquitin ölçümü-kemirgen beyinde proteasom aktivitesi

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/59695
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Bu protokol, kemirgen beynin farklı hücresel bölmeler içinde Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS) etkinliğini verimli bir şekilde ölçmek için tasarlanmıştır. Kullanıcılar, aynı hayvanlarda nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonlar içinde çalışan UPS 'i inceleyebilir, bu karmaşık analizleri gerçekleştirmek için gereken zaman ve hayvan sayısını azaltır.

Abstract

Ubiquitin-proteasom sistemi, protein bozulması ve ökaryotlar içindeki diğer hücresel süreçlerin önemli bir düzenleyicisidir. Beyinde, Ubiquitin-proteasom aktivitesinde artar sinaptik plastisite ve bellek oluşumu için kritik ve bu sistemde anormal değişiklikler nörolojik çeşitli ile ilişkilidir, nörodejeneratif ve psikiyatrik bozukluklar. Beyin içinde Ubiquitin-proteasome işleyişi okuyan sorunlardan biri, tüm hücresel bölmeler içinde mevcut olmasıdır, hangi protein hedefleri, fonksiyonel rol ve düzenleme mekanizmaları yaygın olarak değişebilir. Sonuç olarak, aynı hayvan içinde farklı hücre içi bölmeler içinde beyin Ubiquitin protein hedefleme ve proteasom katalitik aktivite doğrudan karşılaştırmak için yeteneği tam olarak nasıl UPS sinaptik plastisite katkıda anlaşılması için önemlidir, bellek ve hastalık. Burada açıklanan yöntem, aynı kemirgen (sıçan) beyinden gelen nükleer, sitoplazmik ve ham sinaptik fraksiyonlar toplamasının ardından, proteasom katalitik aktivitesinin eşzamanlı ölçülmesini (dolaylı olarak, proteasom çekirdeğinin etkinliğini sağlayarak) sağlar Sadece) ve bağlantıya özgü Ubiquitin proteini etiketleme. Böylece, yöntem doğrudan sinaptik plastisite, bellek oluşumu ve farklı hastalık durumları sırasında aynı hayvan farklı beyin bölgelerinde Ubiquitin-proteasome aktivite hücre altı değişiklikleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem, aynı hayvan içindeki diğer proteinlerin alt hücresel dağıtımı ve fonksiyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir.

Introduction

Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS), hücreler1' de en kısa ömürlü proteinlerin bozulmasını kontrol eden birbirine bağlı protein yapıları ve ligazların karmaşık bir ağıdır. Bu sistemde, proteinlerin bozulması veya diğer hücresel süreçler için işaretlenmiş/küçük değiştirici Ubiquitin tarafından kaderleridir. Bir hedef protein, bir önceki Ubiquitin2' de yedi lizin (K) sitelerden (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ve K63) veya N-terminal metiyoninin (M1; doğrusal olarak bilinen) birinde birlikte bağlanabilen 1-7 Ubiquitin modifikasyonları elde edebilir. Bu polyubiquitin etiketleri bazıları bozulmaya özeldir (K48)3, diğerleri büyük ölçüde protein bozulması süreci bağımsız iken (M1)4,5,6. Böylece, protein mayası süreci inanılmaz karmaşık ve belirli bir polyubiquitin etiketi değişiklikleri ölçmek için yeteneği sonuçta hücresel işleyişinde verilen değişikliğin rolünü anlamak için önemlidir. Bu sistemin çalışmayı daha da zorlaştıran, UPS7' nin katalitik yapısı olan proteasom, her iki proteini de düşürür, ancak diğer proteolitik olmayan süreçlerde de yer alabilir8,9. Daha sonra, ilk keşfi, normal ve anormal Ubiquitin-proteasom aktivitesi uzun süreli bellek oluşumu ve birçok nörolojik, nörodejeneratif ve psikiyatrik dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar Devletler, karışmıştır beri şaşırtıcı değil bozukluklar10,11. Sonuç olarak, beyindeki UPS aktivitesini etkili ve verimli bir şekilde ölçen Yöntemler, sonuçta bu sistemin hastalık Devletlerinde nasıl disdüzenli olduğunu ve Ubiquitin ve/veya hedef alan tedavi seçeneklerinin nihai gelişimini anlamak için önemlidir proteasom işleyişi.

1) Ubiquitin modifikasyonları çeşitliliği ve 2) dağılımı dahil olmak üzere, UPS fonksiyonunu incelemek için kullanılan en yaygın model sistemleri olan fareler ve farelerden gelen beyin dokusunda Ubiquitin-proteasom aktivitesinin ölçüldiği bir dizi sorun vardır. UPS 'in hücre içi bölmeler arasında işleyişi diferansiyel Yönetmeliği12,13,14. Örneğin, bellek oluşumu sırasında beyinde Ubiquitin-proteasom fonksiyonunun erken gösterilerinin çoğu, her iki protein mayası ve proteozom aktivitesinde zaman bağımlı artışları ve belirtilen tüm hücre endoglikozidazları kullanılır15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. ancak, son zamanlarda bu Ubiquitin-proteasome aktivite yaygın olarak öğrenme yanıt olarak alt hücre bölmeleri arasında çeşitli bulundu, bazı bölgelerde eşzamanlı artışlarla ve diğerlerinden azalır, önemli ölçüde farklıdır bir desen daha önce tüm hücre endoglikozidazları21bildirildi. Bu, tüm hücre yaklaşımlarının sınırlandırılmasıdır, çünkü bu, UPS aktivitesindeki değişikliklerin farklı alt hücresel bölmeler boyunca katkılarını ayıramaz. Yine de daha yeni çalışmalar araştırmada sinapses özellikle de UPS çalışmak için sinaptik kesir protokolleri istihdam var22,23,24, yöntemleri ölçmek için occlude kullanılan yöntemler aynı hayvanda nükleer ve sitoplazmik Ubiquitin-proteasom değişiklikleri. Bu, her biri farklı bir hücre altı fraksiyonu toplama, deneyler birden çok kez tekrarlamak için gereksiz bir ihtiyaç sonuçlanır. Bu, sadece hayvan hayatlarını daha büyük bir kayıpla sonuçlanır, ancak belirli bir olaya veya belirli bir hastalık durumunda yanıt olarak farklı hücre içi bölmeler arasında UPS etkinliğini doğrudan karşılaştırmak için yeteneğini ortadan kaldırır. Ubiquitin ve proteasomun protein hedeflerini göz önünde bulundurarak hücre boyunca yaygın olarak farklılık gösterir, nasıl Ubiquitin-proteozom sinyalizasyon farklı alt hücre bölmeler farklıdır anlamak UPS işlevsel rolünü belirlemek için önemlidir beyin bellek oluşumu ve nörolojik, nörodejeneratif ve psikiyatrik bozukluklar sırasında.

Bu gereksinimi ele almak için, Geçenlerde aynı hayvan21gelen belirli bir beyin bölgesi için nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonları toplanan olabilir bir prosedür geliştirdik. Ayrıca, aynı örnekten birden fazla hücre altı fraksiyonları toplama elde edilebilir protein sınırlı miktarda hesaba, biz tahlil in vitro proteozom aktivite ve bağlantı spesifik için önceden kurulan protokolleri optimize kemirgen beyin dokusundan toplanan lysed hücrelerinde protein mayası. Bu protokolü kullanarak, biz toplamak ve doğrudan proteasom aktivite, K48, K63, M1 ve Atom ve sitoplazmada genel protein polyubiquitination düzeylerinde öğrenme bağımlı değişiklikleri karşılaştırmak başardık ve fareler lateral amigdala sinaps. Burada, UPS 'in uzun süreli bellek oluşumu ve çeşitli hastalık Devletlerinde nasıl yer aldığı konusunda anlayışımızı önemli ölçüde iyileştiren prosedürlerimizi ayrıntılı olarak tarif ediyoruz (Şekil 1). Ancak, bizim protokolde tartışılan in vitro proteasom aktivite, yaygın olarak kullanıldığında, doğrudan tam 26S proteozom kompleksleri aktivitesini ölçmek değil unutulmamalıdır. Yerine, bu tahlil 20s çekirdek etkinliğini ölçer, sadece bir vekil olarak tüm 26S proteozom kompleks aksine çekirdek kendisi etkinliğini anlamak için hizmet edebilir anlamına gelir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan konuları da dahil olmak üzere tüm prosedürler Virginia Politeknik Enstitüsü ve Devlet Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.

1. kemirgen beyin dokusu toplama ve diseksiyon

Not: Bu protokol çeşitli beyin bölgelerine uygulanabilir ve çeşitli doku toplama prosedürleri ile kullanılabilir. Aşağıda 8-9 hafta eski erkek Sprague Dawley fareler kullanarak, sıçan beyin dokusu hücre altı için laboratuvarımızda kullanılan prosedürdür. Aynı hayvanın tüm hücresel bölmeler işlemek için, Bölüm 1,3. kullanılan doku toplama prosedürü ne olursa olsun takip edilmelidir.

  1. Sıçan beyni ayıklamak ve kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş bir kriyojenik fincan içine yer. Flaş-Kuru buz üzerinde beyin dondurmak, ya da varsa sıvı nitrojen kullanın ve a-80 °C derin dondurucu transfer. Beyin aynı gün veya daha sonraki bir zamanda disseke olabilir.
  2. Dondurulmuş beyin kriyojenik fincan ve yerden Kuru buz ile soğutulmuş bir sıçan beyin matrisine çıkarın. Matrisdeki her yuva, faiz bölgesinin (YG) yaklaşık konumunu belirlemek için kullanılabilecek 0,5 mm 'ye karşılık gelir.
    1. Bir sıçan beyin Atlası kullanarak, bir jilet içine hemen ön (ön) ROı ve tahmin başlangıcı Daha sonra, YG 'nin öngörülen ucunda (posterior) hemen bir jilet takın.
    2. Bir neşter kullanarak jilet bıçakları arasındaki dilimi çıkarın ve kuru buz üzerinde soğutulmuş bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin. Genellikle, bölümler 2-3 mm kalınlığında ancak bu YG 'ye göre değişir.
  3. Bir neşter kullanarak, bir defada bir yarımküre YG dışarı çıkarın. Her Yarımküre ayrı 1,5 mL mikrosantrifüjli tüpler Kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş yerleştirin. Dondurulmuş doku,-80 °C ' de saklandığı takdirde, hemen alt hücreli fraksiyonlama veya daha sonra işlenmiş olarak kullanılabilir.

2. nükleer ve sitoplazmik ekstraksiyon

Not: Bu protokol, 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 m dithiothreitol (DTT), 0,5 m ethylenediaminetetraasetic ASIT (EDTA), 5 m NaCl,% 10 NP-40 (IGEPAL) ve% 50 gliserol dahil olmak üzere ortak Laboratuar Kimyasalları premade stok çözümleri kullanır. Eğer uç nokta proteasom aktivite sürecinde kullanılırsa, lizol sırasında proteasom kompleksler demontaj önlemeye yardımcı olmak için tüm tamponlara gliserol ve ATP eklenebilir.

  1. Lysis arabelleğini hazırlayın. Steril 15 ml konik tüp için ultra saf (deiyonize ve distile) su 8,63 ml ekleyin.
    1. Konik tüp için 1.000 μL 0,1 M HEPES, 15 μL 1 M MgCl, 100 μL 1 M DTT ve 50 μL% 10 NP-40 ekleyin.
    2. 100 μL proteaz inhibitörü kokteyli ve 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyli ekleyin. Kısaca mix ve chill ıslak buz üzerine yerleştirmek için çözüm Vortex. Çözelti fosfataz inhibitörü sarı bir renk tonu olabilir unutmayın.
      Not: Proteaz inhibitörlerinin kullanımı protein korumak ve in vitro proteozom aktivite tahlil özgüllüğü sağlamak için esastır. Ancak, bu inhibitörler de proteasom aktivite hafif bir azalma neden olabilir, aktivite in vitro tahlil üzerinde ölçülen gerçek aktivite düzeylerinin bir hafife olabilir anlamı.
  2. Ayıklama arabelleği hazırlayın. Steril 15 ml konik tüp için ultra saf (deiyonize ve distile) su 5,925 ml ekleyin.
    1. Konik tüp için 2.000 μL 0,1 M HEPES, 1250 μL% 50 gliserol, 15 μL 1 M MgCl2, 5 μL 1 m DTT, 5 μl, 0,5 m EDTA ve 600 μL 5 m NaCl ekleyin.
    2. 100 μL proteaz inhibitörü kokteyli ve 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyli ekleyin. Kısaca mix ve chill ıslak buz üzerine yerleştirmek için çözüm Vortex. Çözelti fosfataz inhibitörü sarı bir renk tonu olabilir unutmayın.
  3. 1,5 mL santrifüj mikrotüpünü-80 °C dondurucudan YG 'nin bir yarımküre içeren çıkarın. Kullanılan Yarımküre her deneysel grup için ekstraksiyon koşulları arasında karşı dengeli emin olun. Örneğin, iki grup denemede, her grupta ilk iki hayvan için sol Yarımküre ve sonraki iki numune için sağ Yarımküre vb. kullanın.
  4. Bir neşter kullanarak, dondurulmuş beyin dokusu Transfer 2 mL Cam Teflon Homogenizer. Teflon tüpüne 500 μL Lysis tampon ekleyin.
    1. Havaneli B kullanarak, aynı dokuyu, hiçbir görünür miktarda katı malzeme buluncaya kadar 15 vuruş kullanarak homojenleştirin. Her kontur sırasında bir dönüm hareketi (saat yönünde veya saat yönünde) kullanın.
  5. 1.000 bir μL pipet kullanarak homojenize numuneyi yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüp ıslak buz üzerine yerleştirin ve 30 dakika boyunca inkübe.
  6. 845 x g ve 4 °c ' de 10 dakika boyunca mikrosantrifüjte boru yerleştirin ve döndürün. Tamamlandıktan sonra, dikkatli pipetleme ve yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüjü tüp içine yerine süpernatant çıkarın; Bu sitoplazmik kesir, buzda depolanabilir ya da 4 °C ' ye kadar Bölüm 2,9.
  7. 50 μL ekstraksiyon arabelleği elde edilen Pelet ve pelletini pipetleme ile ekleyin. Pellet girdap yapmayın. Buz üzerine resuspended Pelet içeren tüp yerleştirin ve 30 dakika boyunca inküye.
  8. Tüp mikrosantrifüjte yerleştirin ve 21.456 x g, 4 °c ' de 20 dakika döndürün. Tamamlandıktan sonra, dikkatli pipetleme ve yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüjü tüp içine yerine süpernatant çıkarın; Bu nükleer kesir. Pelet artık atılabilir.
  9. Ölçüm protein konsantrasyonu sitoplazmik ve nükleer ekstraksiyonları DC protein tahlil kullanarak (üreticinin talimatlarına göre), veya numuneler için herhangi bir eşdeğer tahlil olmayan-iyonik deterjanlar kullanılarak toplanan. Hemen proteasom aktivite tahlil (Bölüm 4) veya Batı Blot (Bölüm 5) devam edin. Alternatif olarak, örnekler gerekli olana kadar-80 °C ' de depolanabilir.

3. Synaptic kesir koleksiyonu

Not: Bu protokol, 1 M Tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl ve% 10 SDS dahil olmak üzere ortak laboratuar kimyasallarının önceden üretilmiş stok çözümlerini kullanır. Eğer uç nokta proteasom aktivitesinde kullanılırsa, lizol sırasında proteasom kompleksler demontaj önlemeye yardımcı olmak için tüm tamponlara gliserol ve ATP eklenebilir

  1. 320 mM sucrose ile TEVP arabelleği hazırlayın. 60 ml Ultra saf (deiyonize ve distile) su temiz 100 ml Beaker ekleyin.
    1. Beaker, eklemek 1.300 μL 1 M Tris (pH 7,5), 260 μL, 0,5 M EDTA, 100 μL proteaz inhibitör kokteyl, 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyl ve 10,944 g sakaroz. Sakaroz tamamen çözülene kadar bir karıştırın Bar ile karıştırın.
    2. Bir pipet kullanarak solüsyona hidroklorik asit (HCl) dropwise ekleyerek pH ~ 7,4 getirin.
    3. Solüsyonu 100 mL Volumetrik Flask 'e aktarın. Ultra saf su ekleyerek 100 ml 'ye hacim getirin. Buzun üzerindeki son solüsyonu gerekli olana kadar rahatlayın.
  2. Homojenizasyon tamponunu hazırlayın. 60 ml Ultra saf (deiyonize ve distile) su temiz 100 ml Beaker ekleyin.
    1. 1 M Tris (pH 7,5), 3.000 μL 5 M NaCl, 100 μL proteaz inhibitörü kokteyli, 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyli ve 2.000 μL% 10 SDS 5.000 μL ekleyin. Bir karıştırın Bar ile karıştırın.
      Not: İyonik deterjanlar, proteasom kompleksinin denatlaşmasına neden olan proteasom aktivitesine müdahale edebilir. İstenirse, proteasom fonksiyonunu korumaya yardımcı olmak için SDS hacmi azaltılabilir.
    2. Bir pipet kullanarak çözüme HCl dropwise ekleyerek ~ 7,4 pH getirin.
    3. Solüsyonu 100 mL Volumetrik Flask 'e aktarın. Ultra saf su ekleyerek hacmi 100 ml 'ye getirin. Son çözümü oda sıcaklığında saklayın; SDS çözeltinin dışına çökecek gibi Chill etmeyin.
  3. 1,5 mL Santrifüjü-80 °C dondurucudan YG 'nin bir yarımküünü içeren çıkarın. Kullanılan Yarımküre her deneysel grup için ekstraksiyon koşulları arasında karşı dengeli emin olun. Örneğin, iki grup denemede, her grupta ilk iki hayvan için sol Yarımküre ve sonraki iki numune için sağ Yarımküre vb. kullanın.
  4. Bir neşter kullanarak, dondurulmuş beyin dokusu Transfer 2 mL Cam Teflon Homogenizer. Teflon tüpüne 500 μL TEVP tampon ekleyin.
    1. Havaneli B kullanarak, katı malzemenin hiçbir görünür transferleri mevcut kadar 15 vuruş kullanarak aynı doku homojenize. Her kontur sırasında bir dönüm hareketi (saat yönünde veya saat yönünde) kullanın.
  5. 1.000 bir μL pipet kullanarak homojenize numuneyi yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 10 dk, 4 °C için 1.000 x g 'de santrifüjün.
  6. Süpernatant toplayın ve bir 1.000 μL pipet kullanarak yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüjü tüpüne aktarın. Numuneyi 10 dk, 4 °C için 10.000 x g 'de santrifüjün. Orijinal Pelet (P1) çekirdekleri ve büyük enkaz içerir ve atılabilir.
  7. Süpernatant yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüp aktarın. Bu bir Sitosolik kesir. 50 μL homojenizasyon arabelleği Pelet (P2) ekleyin ve hiçbir katı malzeme görünür olana kadar pipetleme ile pelletini.
  8. Numuneyi 10 dk, 4 °C için 20.000 x g 'de santrifüjün. Süpernatant yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüp aktarmak; Bu ham Synaptosomal membran (Synaptic) kesir. Pelet atılabilir.
  9. Ölçmek sinaptik fraksiyonunun protein konsantrasyonu DC protein tahlil kullanarak (üreticinin talimatlarına göre), ya da numuneler için herhangi bir eşdeğer tahlil iyonik deterjanlar kullanılarak toplanan. Hemen proteasom aktivite tahlil (Bölüm 4) veya Batı Blot (Bölüm 5) devam edin. Alternatif olarak, örnekler gerekli olana kadar-80 °C ' de depolanabilir.

4. proteasome aktivite tahlil

Not: Proteasom aktivitesi, 20S proteasome Activity Kit 'in biraz değiştirilmiş versiyonunu kullanarak homojenize beyin dokusunda ölçülebilir. Bu tahlil doğrudan tam 26S proteozom kompleksleri etkinliğini ölçmez. Yerine, bu 20s çekirdek etkinliğini ölçer, sadece bir vekil olarak tüm 26S proteozom kompleks aksine çekirdek kendisi etkinliğini anlamak için hizmet edebilir anlamına gelir. Bu testin başarısı tekrarlayan donma-çözme döngüleri ve/veya deterjanlar, özellikle iyonik artan seviyeleri ile düşüş ve bir 360/460 ile bir plaka okuyucu kullanımı gerektirir (uyarma/emisyon) filtre seti ve Isıtma yetenekleri kadar 37 °C.

  1. Plaka okuyucu ayarları: 37 °C ' ye kadar önceden ısınır ve koşudan tutun.
    1. 360 ve emisyon 460 için uyarma ayarlayın. 96 iyi plaka kullanıldığında açık ise, optik konumu altolarak ayarlayın. Koyu/siyah 96 iyi plaka kullanılırsa, optik pozisyon üstayarlayın.
    2. Floresan okuma seçenekleri altında Auto-Gain için eski plaka okuyucu modelleri ayarlayın; Yeni modeller bunun için önceden ayarlanmıştır. Program 2 h bir zaman ile kinetik bir çalışma, tarama (okuma) her 30 dakika.
  2. 13,5 ml Ultra saf su ile kit içinde sağlanan 10X tahlil tamponu yeniden oluşturur. Şimdi 1x tampona 14 μL 100 mM ATP ekleyin; Bu önemli ölçüde numunelerde proteasom etkinliğini artırır ve tahlil güvenilirliğini artırır. Son 20S assay tamponu buzda veya 4 °C ' de gerekene kadar saklanabilir ve birkaç ay boyunca kararlı olur.
  3. 100 μL DMSO ile kit içinde sağlanan ayc standardını yeniden oluşturur. Standart ışık hassasiyetli olduğu için bu adımı karanlıkta veya düşük ışık koşullarında gerçekleştirin.
  4. Reconstituted standart, karanlıkta veya düşük ışık koşullarında kullanarak bir stand eğrisi oluşturma.
    1. Ayrı 0,5 mL mikrosantrifüjli tüplerde, 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,8 ve 0 μM ABC konsantrasyonuna karşılık gelen, 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,4, 0,5 ve 0 μL ayc standardını ekleyin.
    2. Bu tüpler için, aynı sırada, eklemek 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 ve 100 μL 20S assay tampon. Bu, homojen numunelerde plaka okuyucu kalibrasyonu ve proteasom aktivitesinin analizi için kullanılacak yüksek düşük ayc konsantrasyonlarına sahip bir dizi oluşturur.
    3. Gerektiğinde tüm seyreltilmiş standartları karanlıkta buzda saklayın.
  5. 65 μL DMSO ile kit içinde sağlanan proteasom substrat (suc-LLVY-ayc) yeniden oluşturur. Bu adımı karanlıkta veya düşük ışık koşullarında, substrat ışık hassasiyetli olarak gerçekleştirin. 20 ' lik assay tampon kullanarak yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüjli tüpte proteasom substrat bir 1:20 seyreltme oluşturun. Seyreltilmiş substrat gerektiğinde karanlıkta buzun üzerinde saklayın.
    Not: Örneğin, plaka 10 numune ve 1 boş olursa, 10 μL 'de de 22 kuyu (çoğaltır) için yeterli seyreltilmiş substrat gerekir. Bu 220 μL 'ye eşittir, pipetleme hataları için + 30 μL gerekir, 12,5 μL substrat ve 237,5 μL 20s assay tampon gerektirir.
  6. İstenilen numuneleri (dondurulmuş ise) çözün ve 96 iyi plakaya normalleştirilmiş bir miktar ekleyin. Her örneği yinelemeler içinde çalıştırın. Gerekli numune miktarı doku preparine göre değişir. Genellikle, 10-20 μg herhangi bir hücre altı fraksiyonu için yeterlidir.
  7. Örnek kuyu hacmini Ultra Saf suyla 80 μL 'ye getirin. Eklenen miktar, eklenen örnek hacmine bağlıdır. Örneğin, örnek 1 4,5 μL protein ve örnek 2 ise 8,7 μL ise, gerekli su miktarı sırasıyla 75,5 μL ve 71,3 μL olacaktır. İki ayrı kuyunda, tek başına 80 μL su ekleyin; Bu tahlil boşluklar olacaktır.
    Not: Pipetleme hataları nedeniyle protein hacminde yapılan değişiklikleri sınırlamak için, protein konsantrasyonları en az konsantre numunenin normalleştirilebilir. Bu, tüm koşullarda aynı örnek birimin kullanımına izin verir.
  8. Her iyi, assay boşluklar da dahil olmak üzere 20S assay tampon 10 μL ekleyin. Bir Repeater/otomatik pipet kuyular arasında tutarlı tahlil hacmi sağlamak için burada tavsiye edilir.
  9. Isteğe bağlı: Bu aşamada istenirse in vitro manipülasyonları tanıtın; Bu, her numunenin araç dahil olmak üzere tedavi başına ek 2 kuyuları olmasını gerektirecektir. Eğer öyleyse, ekleyin 5-10 μL ilaç/bileşik faiz 2 örnek kuyuları ve bir eşdeğer hacim kontrol/araç için başka bir 2 kuyu. Plakayı önceden ısıtılmış plaka okuyucuya veya 37 °C ' ye 30 dakika süreyle inküvatörün üzerine yerleştirin.
  10. Işıkları kapatın veya karanlık bir oda girin. Tüm 100 μL seyreltilmiş ayc standartlarını yeni bir kuyulara ekleyin; her standart tek bir kuyu olacak.
  11. Karanlıkta, numune ve tahlil boşlukları içeren kuyulara 10 μL seyreltilmiş proteasom substrat ekleyin, ancak ayc standardına değil. Bir Repeater/otomatik pipet kuyular arasında tutarlı tahlil hacmi sağlamak için burada tavsiye edilir.
  12. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve kinetik koşuya başlayın.
    Not: Plaka kinetik koşmak sırasında sürekli ajitasyon altında olması gerekmez, ancak, Kullanıcı isterseniz seçebilirsiniz
  13. Kinetik çalışma sonunda, RAW 360/460 floresan değerleri Microsoft Excel 'e dışa aktarın.
    1. Ortalama birlikte her standart, her örnek ve tüm 5 taramaları için tahlil Blank için yinelenen kuyular. RAW floresan değerleri numuneler için taramalar arasında artmalıdır ancak standartlar ve tahlil boşlukları için istikrarlı (veya biraz azalma) kalır.
    2. En yüksek ayc standart iyi ortalamasını alın ve bilinen konsantrasyon (20 μM) ile Böl. Standartlaştırılmış değeri almak için tahlil kullanılan örnek konsantrasyon tarafından bu değeri bölmek. Her örnek ve assay boş ortalama için, standartlaştırılmış ayc değerine göre Böl.
    3. Bu son değeri alın ve her örnek ve tahlil Blank için normalleştirilmiş değeri elde etmek için tahlil kullanılan örnek konsantrasyon tarafından bölmek. Tüm 5 taramaları için bunu yapın.
    4. Normalleştirilmiş assay boş değeri her normalleştirilmiş örnek değeri tüm 5 taramaları için çıkarın.

5. bağlantı-spesifik protein Ubiquitination ölçümü

  1. Kemirgen beyin dokusundan toplanan farklı hücreli fraksiyonlar içinde çeşitli polyubiquitin etiketlerinin ölçülmesini, benzersiz, bağlantı spesifik polyubiquitin antikorları ile birlikte standart Batı şişme protokolleri çeşitli kullanılarak yapılmalıdır.
    1. Denaturing için, normalleştirilmiş numuneleri, üreticinin talimatı başına, hacim olarak% 5 oranında β-mercaptoetanol ile tamamlayıcı olan Laemmli numune tamponunun eşit hacmine sahip olarak karıştırın.
    2. Bağlantı ne olursa olsun tüm monoubiquitination ve polyubiquitination modifikasyonları için bir Pan-Ubiquitin antikor kullanın.
    3. Tüm polyubiquitinated proteinleri tanımak için, monoubiquitination ile çapraz reaksiyon göstermez bir Ubiquitin antikor kullanın.
    4. Bağlantı spesifik polyubiquitination için, lizin-27, lizin-48, lizin-63 ve doğrusal (M1) polyubiquitination algılayabilir antikorlar kullanın.
  2. Gelişmeler arasında çapraz kontaminasyon önlemek için, hangi bir yanlış pozitif neden olabilir veya farklı bir Ubiquitin modifikasyon görüntülemede müdahale, 10 dakika 0,1 M NaOH kullanarak gelişmeler arasında şeritler membranlar.
    1. TBS 'de membranları% 0,1 ile iki kez 10 dakika boyunca yıkayın ve yeniden engelleyin (kullanılan Batı leke protokolünde her türlü engelleme ajanı tercih edilir).
    2. Membranın primer ve ikincil antikorların düzgün bir şekilde çıkartıldığından emin olmak için, zarı ikincil antikor ile yeniden geliştir.
    3. Tavsiye edilen: Kirlenme olmaksızın farklı Ubiquitin antikorlarının başarılı bir şekilde geliştirilmesi için floresan veya yakın kızılötesi görüntüleme sistemlerini kullanın. Bu sıklıkla antikorlar arasında daha fazla engel olabilir.
  3. Bazı Ubiquitin Batı leke görüntüleri farklı bantları (M1 gibi) sütunlar sağlayacak diğerleri birkaç veya net çizgiler (K48 ile ortak) ile smear benzeri bir desen üretmek. Görüntülenmiş Ubiquitin Batı blots ölçümü için, tüm moleküler standartları merdiven genişletir sütunun etrafında bir kutu çizin.
    1. Ubiquitin boyama tüm merdiven boyunca uzatırsanız kutuyu yukarı (veya aşağı) ayarlayın; Bu Lysine-48 modifikasyonları için yaygındır ve hücre içi bölmeler arasında yaygın olarak değişir.
    2. Arka planda, her tarafta sütunu hemen çevreleyen arka plan ortalama optik yoğunluğu olarak hesaplanır dışarı çıkarın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklanan prosedürü kullanarak, sıçan beynin lateral amigdala nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonları toplandı (Şekil 1). Bireysel fraksiyonları saflık Batı blotting ile teyit edildi, zenginleştirilmiş veya lysate tükenmelidir proteinlere karşı antikorlar ile yoklama. Ham sinaptik fraksiyonu toplanan ilk yarımküte, postsinaptik yoğunluk protein 95 (PSD95) sinaptik vardı, ancak nükleer değil, kesir, sitoplazmada alt seviyeleri ile (Şekil 2a). Bu sinaptik kesir hazırlama hem presinaptik ve postsinaptik bileşenleri yalıtır gösteren önceki çalışma ile tutarlı25. Tersine, nükleer protein histon H3 nükleer, ancak sinaptik, kesir, sitoplazmada alt seviyeleri ile vardı (Şekil 2B). Sitoplazmada PSD95 ve H3 varlığı sitoplazmik çevirisiyle uyumludur. Sitoplazmik protein β-tubulin sitokasmik fraksiyonda vardı, ancak büyük ölçüde nükleer lysate yoktu (Şekil 2C), sinaptik bölgede alt seviyeleri ile. Bu, büyük ölçüde sitoplazmik proteinlerin bulunmayan bir nükleer fraksiyonunu üretebiliyoruz. Sinaptik bölgede tübülin varlığı önceki çalışmalar ile tutarlı26. Her üç fraksiyonları, bir yükleme kontrolü olarak kullanılan protein β-aksini (Şekil 2D) tutan konut benzer düzeylerde gösterdi. Toplu olarak, bu sonuçlar, tek bir sıçan lateral amigdala toplanan nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonları saflığının teyit.

Sonra, tüm endoglikozidazları fonksiyonel proteasom aktivite için tanımlanan değiştirilmiş sürümünü kullanarak doğrulandı in vitro 20s proteozom aktivite assay. Tüm Lysates, testin başarısı, ilk tarama (0 dk) beşinci/final tarama (120 dk) tespit ham floresan birimler (RFU) bir artış olarak tanımlanmıştır. Tüm bu analizler için, ham floresan ünitelerinin (RFU) normalleşmesi için en yüksek standart olarak 10 μM ayc kullanılmıştır. Ham sinaptik fraksiyonda, RFU tarama 5 (Şekil 3A), sadece altında 0,1 (Şekil 3B) normalleştirilmiş RFU sonuçlanan numaraya. Sitoplazmik fraksiyonda, RFU taramalar arasında arttı (Şekil 3c) son NORMALLEŞTIRILMIŞ RFU ile ~ 1,6 (şekil 3D). Nükleer fraksiyonu da RFU zaman bağımlı değişiklikler gösterilir (Şekil 3E), son NORMALLEŞTIRILMIŞ rfu 0,3 Ile (Şekil 3F). Bölmeler arasında proteasom aktivitesinde farklılıklar büyük olasılıkla sitoplazmada ve çekirdek27en bol olan fraksiyonda proteasomların mevcudiyeti yansıtır, bizim bizim faaliyet en yüksek seviyeye sahip bölmeler Hazırlık. Sinaptik bölgedeki en düşük aktivite düzeyi, sert denatlık koşula bağlı olarak proteasom aktivitesini azaltabilen iyonik deterjanlar kullanılarak toplanan tek lysate olmakla uyumludur. Önemlisi, RFU assay boşluklar veya endoglikozidazları zaman içinde artış vermedi (sinaptik) son derece spesifik ve güçlü proteozom inhibitörü clasto ile inkübe-lactacystin-β-lactone (Şekil 3G, β-Lac), son normalleştirilmiş RFU seviyeleri görüntüleniyor 0,01 ve 0,001, sırasıyla (Şekil 3H). Bu, RFU 'da gözlenen değişikliğin özellikle proteasom ve diğer proteazların aktivitesine bağlı olduğunu göstermektedir. Ayrıca, deneysel koşullar arasında analiz edildiğinde, nükleer bir artış vardı, ama sitoplazmik değil, lateral amigdala öğrenme aşağıdaki proteasom aktivite, hangi aynı anda sinaptik proteasom aktivitesinde bir azalma ile ortaya çıktı hayvanları kontrol etmek için kıyaslama (Şekil 4). Toplu olarak, bu sonuçlar proteasom aktivitesinin doğru tek bir sıçan lateral amigdala toplanan üç alt hücreli kesirler ölçülür olduğunu teyit.

Proteasom aktivite tahlil avantajlarından biri in vitro manipülasyonlar hemen önce proteozom substrat ek olarak örneklere tanıtılabilir olduğunu, hangi proteozom düzenleyen belirli moleküllerin tanımlanması sağlar Bu özel alt hücre kesir. Bu bir örnek olarak, CaMKII rolü (kalsiyum/calmodulin bağımlı protein kinaz II) sinaptik fraksiyonda değerlendirildi, toplanan en sert denatlı lysate, çünkü CaMKII Sinaplar proteasom fonksiyonunu düzenleyen düşünülmektedir. Camkıa inhibitörü MYR-AıP ile bir 30 dk inkübasyon (myristolayted autocaytid-2 ilgili inhibitör peptid) tahlil üzerinde proteasom aktivite önemli ölçüde azalmış artış sonuçlandı, hangi sadece seviyeleri ulaştı ~ 61% tedavi edilmemiş (Şekil 5A). Bunun tersi olarak, sitoplazmlara uygulanan aynı manipülasyon, aracın tedavi edilen kuyulardan proteasom aktivitesinde bir değişikliğe neden olmamıştır (Şekil 5B). Bu sonuçlar, proteasom aktivitesinin daha ileri düzeyde manipüle edilebilir olduğunu ve bu manipülasyon toplanan hücre altı fraksiyonuna bağlı olarak farklı etkilere sahip olabilir onaylayın.

Proteasom aktivitesinin ölçülmesini ek olarak, açıklanan protokol Batı leke prosedürleri kullanılarak çeşitli Ubiquitin değişikliklerinde subhücresel farklılıkları ölçmek için kullanılabilir. Bu tespit edilebilir Ubiquitin etiketleri şu anda K48, K63 ve M1 fareler için dahil bağlantı spesifik antikorlar, kullanılabilirliği ile sınırlı olduğunu dikkat etmek önemlidir (Not: bir K27 antikor mevcuttur, ancak herhangi bir algılanabilir görüntü üretmek vermedi çeşitli koşullar altında lateral amigdala kesir veya tüm hücre endoglikozidazları). Genel polyubiquitination, bozulma-bağımsız doğrusal/M1 ve K63 mayası ve bozulma özgü K48 mayası tüm hücre altı kesirler saptandı. Daha da önemlisi, farklı deneysel koşullarda analiz edildiğinde, genel olarak bir artış (Şekil 6a), doğrusal (Şekil 6B), K63 (Şekil 6c) ve K48 (Şekil 6d) lateral amigdala polyubiquitination oldu Nükleer kesir kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında öğrenme aşağıdaki. Aynı zamanda, sitoplazmik bölgede, genel polyubiquitination azaldı ve K48 mayası öğrenme sonrasında arttı, sinaptik K63 mayası azalırken. Toplu olarak, bu sonuçlar, bağlantı özgü protein mayası aynı hayvan hücre altı farklılıkları içinde doğru algılanabilir olduğunu gösterir.

Figure 1
Şekil 1 : Sıçan beyin dokusu hücre altı fraksiyonlama için şematik. Kemirgen beyin ayıklanır, beyin bölgesi disseke ve hemheres bölünmüş. Bir dizi tampon ve santrifükleme adımlarını kullanarak, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların bir yarımküden toplanarak bir ham sinaptik fraksiyonu diğerine toplanır. Her iki fraksiyonları daha sonra proteasom aktivitesi için kullanılan ve Batı blotting, tahlil protein polyubiquitination seviyeleri için. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : Ham sinaptik, nükleer ve sitoplazmik kesirli saflığın onayı. (A) sinaptik protein postsinaptik yoğunluk protein 95 (PSD95; 1:1000) sinaptik, ancak değil nükleer fraksiyonu sitoplazmada alt seviyeleri ile vardı. (B) Histone H3 (1:500) nükleer, ancak sinaptik değil, sitoplazmada alt ifade ile fraksiyonu vardı. (C) β-tubulin (1:1000) sitoplazmda vardı, ancak büyük ölçüde nükleer, sinaptik lysate düşük ifade ile fraksiyonu yok. (D) tüm hücre içi bölmeler içinde temizlik proteini β-aktik (1:1000) bulunuyordu. Alanlar hedef protein beklenen boyutunu gösterir. Bu rakam Orsi, S.A. ve ark.21' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Aynı hayvanın lateral amigdala 'dan toplanan nükleer, sitoplazmik ve sinaptik Kesirlerde proteasom aktivitesinin ölçülmesini. İn vitro proteozom aktivite tahlil sırasında, bağıl floresan birimleri (RFU) başından itibaren artmış tespit (tarama 1) sonuna kadar (tarama 5) sinaptik (A), sitoplazmik (C) ve nükleer (E) fraksiyonları tahlil. Temelden bu değişikliğin ölçülmesini, sinaptik (B), 1,6 sitoplazmik (D) ve 0,3 nükleer (F) fraksiyonları içinde 0,1, normalleştirilmiş bir RFU değeri (10 μM ASC göreli olarak) belirtildi. Proteasom inhibitörü βlac, RFUs 'un oturum boyunca değiştiğini engelledi (G-H). Bu rakam Orsi, S.A. ve al.21' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Aynı hayvanın lateral amigdala içinde proteasom aktivite Subcellular farklılıkları. Nükleer proteasom aktivitesinde bir artış, sinaptik fraksiyonda faaliyet azalmasına karşılık gelen kontrollere göre eğitimli (korku şartlı) hayvanlarda tespit edildi. Sitoplazmik proteasom aktivitesi temel olarak kalmıştır. *P < kontrol 'den 0,05. Bu rakam Orsi, S.A. ve al.21' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Toplanan sinaptik ve sitoplazmik fraksiyonlar içinde proteasom aktivitesinin in vitro manipülasyon. In vitro manipülasyon camkii inhibitör AIP üzerinden sinyal sinaptik (A), ancak sitoplazmik (B), sıçan lateral amigdala kesir proteasom etkinliğini azalttı. Bu rakam Jarome, T.J. ve al.23' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Öğrenme sonrasında aynı hayvanın lateral amigdala bağlantı özgü protein mayası içinde subcellular farklar. (A) bu sitoplazmik fraksiyonda bir azalma ile ilişkili öğrenme, aşağıdaki nükleer fraksiyonda genel mayası bir artış vardı. (B) nükleer doğrusal mayası bir artış vardı, ancak sitoplazmik veya sinaptik değil, kesir öğrenme takip. (C) sinaptik fraksiyonda bir azalma ile ilişkili öğrenme aşağıdaki nükleer fraksiyonda K63 mayası bir artış vardı. (D) K48 mayası nükleer ve sitoplazmik artmış, ama sinaptik değil, kesir öğrenme takip. *P < kontrol 'den 0,05. Elde edilen tüm Ubiquitin optik yoğunlukları, yükleme kontrolü olarak kullanılan β-aktin seviyelerine (a 'da alt temsilci Batı leke görüntüleri) normale döndü. Bu rakam Orsi, S.A. ve al.21' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, aynı hayvanın farklı hücre içi bölmeleri boyunca Ubiquitin-proteasom aktivitesinde yapılan değişikliklerin ölçülmeleri için etkili bir yöntem gösteriyoruz. Şu anda, Ubiquitin-proteasome sisteminin aktivitesinde hücre altı değişiklikleri ölçme girişimleri çoğu örnek başına tek bir bölme ile sınırlıdır, denemeler tekrarlamak gerek sonuçlanan. Bu önemli maliyetlere ve hayvan yaşamının kaybına yol açar. Protokollerimiz, aynı hayvanın her yarımküünden toplanacak farklı hücresel fraksiyonları sağlayan, hemherleri bölmek suretiyle bu sorunu azaltır. Bu protokolü kullanarak, biz ilk kez göstermek için başardık aynı hayvan Ubiquitin-proteasome aktivite farklılaşmış nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonları21öğrenmeye yanıt olarak değişiklikler.

Burada açıklanan protokolün ana sınırlaması, elde edilen beyin dokusu (numune) miktarına bağlıdır. Örneğin, yukarıda özetlendiği gibi, bu protokol belirli bir beyin bölgesini bölme yarımküresi gerektirir. Ancak, bu her zaman mümkün olmayabilir, örneğin sadece bir yarımküte mevcut olan belirli alanların durumunda gibi. Bu durumlarda, protokol ilk olarak sinp tamponunda kullanılan tüm beyin bölgesini homojenleştirerek değiştirilebilir (Bölüm 3,1), bu tampon tüm denatüre ajanlar ücretsiz olduğundan. Örnek daha sonra birim tarafından iki eşit parçaya bölünebilir. İlk bölümü, açıklandığı gibi protokol aşağıdaki sinaptik fraksiyonu için kullanılabilir. Numunenin ikinci yarısı için, ıonik olmayan deterjan NP-40, son konsantrasyon% 0,05 ' e eklenebilir ve ardından Bölüm 2,6 ' de açıklandığı gibi santrifüjleme yapılabilir. Bu, sitoplazmik proteinlerin süpernatant ve nükleer proteinlere, Bölüm 2 ' deki kalan adımların ardından daha da izole edilebilir olan Pellet içine ayrılması sağlar. Doku miktarı başka bir endişe bazı beyin bölgeleri boyutu çok küçük olduğu, gibi prelimbic korteks gibi. Ancak, bu durumlarda, yukarıdaki protokol hala kullanılan arabelleklerin hacimlerini azaltarak kullanılabilir, hangi ampirik toplanan beyin bölgesinin boyutuna göre belirlenmelidir. Böylece, bu protokol daha az doku mevcut daha zor beyin bölgeleri bile değiştirilebilir.

Burada anahat protokolünün önemli avantajlarından biri, bu metodolojinin kısıtlı bir bütçede ya da sınırlı kaynaklarla bile değiştirilebilir olmasını sağlayan, çoğu tesiste bulunan ortak laboratuvar donanımları ve reaktifler kullandığından. Ayrıca, bu protokolün, Ubiquitin-proteasom sinyallerinde subhücresel değişikliklerin ölçülmesi için bir yol olarak özetlerken, Bu metodoloji aynı zamanda hücresel lokalizasyon ve fonksiyon anlayışının diğer protein veya hücresel sürecine de uygulanabilir önemlidir. Bu nedenle, bu protokol, öğrenme ve bellek veya farklı hastalık durumları sırasında belirli proteinler veya kompleksleri alt hücresel işlevlerini anlamak için geniş uygulamalara sahip olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, tarım ve Yaşam Bilimleri Koleji ve Virginia Tech Bilim Koleji başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir. tan, Virginia Tech 'de George Washington Carver programı tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Fisher 15575020 Various other vendors
20S Proteasome Activity Kit Millipore Sigma APT280 Other vendors carry different versions
ATP Fisher FERR1441 Various other vendors
Beta-actin antibody Cell signaling 4967S Various other vendors
Beta-tubulin antibody Cell signaling 2128T Various other vendors
BioTek Synergy H1 plate reader BioTek VATECHH1MT3 Other vendors carry different versions
B-mercaptoethanol Fisher ICN19024280 Various other vendors
Clasto lactacystin b-lactone Millipore Sigma L7035 Various other vendors
Cryogenic cup Fisher 033377B Various other vendors
DMSO DMSO D8418 Varous other vendors
DTT Millipore Sigma D0632 Various other vendors
Glycerol Millipore Sigma G5516 Various other vendors
H3 antibody Abcam ab1791 Various other vendors
HEPES Millipore Sigma H3375 Various other vendors
Hydrochloric acid Fisher SA48 Various other vendors
IGEPAL (NP-40) Millipore Sigma I3021 Various other vendors
K48 Ubiquitin Antibody Abcam ab140601 Various other vendors
K63 Ubiquitin Antibody Abcam ab179434 Various other vendors
KCl Millipore Sigma P9541 Various other vendors
KONTES tissue grinder VWR KT885300-0002 Various other vendors
Laemmli sample buffer Bio-rad 161-0737 Various other vendors
Linear Ubiquitin Antibody Life Sensors AB-0130-0100 Only M1 antibody
MgCl Millipore Sigma 442611 Various other vendors
Microcentrifuge Eppendorf 2231000213 Various other manufacturers/models
myr-AIP Enzo Life Sciences BML-P212-0500 Carried by Millipore-Sigma
NaCl Millipore Sigma S3014 Various other vendors
Odyssey Fc Imaging System LiCor 2800-02 Other vendors carry different versions
Phosphatase Inhibitor Millipore Sigma 524625 Various other vendors
Precision Plus Protein Standard Bio-rad 161-0373 Various other vendors
Protease Inhibitor Millipore Sigma P8340 Various other vendors
PSD95 antibody Cell signaling 3450T Various other vendors
SDS Millipore Sigma L3771 Various other vendors
Sodium hydroxide Fisher SS255 Various other vendors
Sucrose Millipore Sigma S0389 Various other vendors
TBS Alfa Aesar J62938 Varous other vendors
Tris Millipore Sigma T1503 Various other vendors
Tween-20 Fisher BP337-100 Various other vendors
Ubiquitin Antibody Enzo Life Sciences BML-PW8810 Various other vendors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115 (2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349 (2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150 (2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).

Tags

Nörobilim sayı 147 Ubiquitin proteasome çekirdek sinaps sitoplazma hafıza hipokampus amigdala
Subcellular Ubiquitin ölçümü-kemirgen beyinde proteasom aktivitesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McFadden, T., Devulapalli, R. K.,… More

McFadden, T., Devulapalli, R. K., Jarome, T. J. Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59695, doi:10.3791/59695 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter