Summary
이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.
Abstract
이 프로토콜에서는 생리학적으로 대표적인 미세 환경에서 항암 치료제의 높은 처리량 스크리닝을 허용하기 위해 384 웰 매달려 있는 액적 내에서 종양 스페로이드 생성 절차를 설명합니다. 우리는 환자 유래 암 줄기 세포 스페로이드의 형성뿐만 아니라, 약물 치료 다음 철저한 분석을 위해 이러한 스페로이드의 조작을 설명합니다. 구체적으로, 우리는 스페로이드 형태, 증식, 생존력, 약물 독성, 세포 표현형 및 세포 국소화 데이터의 수집을 설명합니다. 이 프로토콜은 384웰 매달려 있는 드롭 플랫폼을 사용하여 쉽게 구현할 수 있는 분석 기술에 중점을 두어 처리량이 높은 약물 스크리닝에 이상적입니다. 우리는 난소암 연구와 암 줄기 세포 연구에서이 모델의 중요성을 강조하는 동안, 384 웰 플랫폼은 다른 암 유형 및 질병 모델의 연구에 적합, 많은 분야에 플랫폼의 유용성을 확장. 이 플랫폼은 쉽게 구현된 생리학적 대표 3D 배양을 통해 맞춤화된 약물 스크리닝의 속도와 스크리닝 결과의 품질을 개선함으로써 새로운 치료법 및 환자 별 개발에 도움이 될 것으로 예측됩니다. 치료 전략을 수립하여 광범위한 임상 적 영향을 미칩니다.
Introduction
전 세계적으로 암 관련 사망률은 2018년 980만 명에 이르렀으며, 개선된 치료법개발의 필요성을 강조하고 있다. 안타깝게도, 새로운 항암제 개발을 위한 개선된 전략의 필요성을 나타내는 약 6억 5천만 달러의 비용이 드는 단일 약물의 개발로 인해 암 치료제 개발 비용이 증가하고 있습니다. 암 줄기 세포 (CSC), 증가 화학 저항을 특징으로3,자기 갱신 하는 능력, 그리고 새로운 종양을 종자 하는 능력4 종양 재발에 대 한 책임 것으로 생각 된다4,전이5,및 화학 저항4,6, 이는 모두 종양의 악성 용량에 기여하므로 높은 사망자 수입니다. 난소암에서, 이 세포는 복강내의 악성 복수액에서 풍부하게 발견되며, 이는 나쁜 임상 결과와 관련된 상태이다1. CSC의 악성 기능의 결과로, 전통적인 화학요법과 함께 사용하기 위하여 새로운 CSC 표적으로 하는 약을 개발하는 추진이 있었습니다. 포함 하는 CSC 표적 약물의 개발에 수반 하는 몇 가지 도전이 있다: 1) 시험관에서 CSC를 확장 하 고 유지 에 어려움; 2) 환자 샘플의 부족; 3) 배양 플랫폼의 생리적 관련성; 4) 환자 들 간의 약물 감수성의 이질성. 이 프로토콜은 이러한 각 과제를 극복할 수 있는 높은 처리량의 3D 문화 플랫폼 구현에 대해 설명합니다. 특히, 이 시스템은 소수의 환자 유래 난소 CSC를 사용하여 신속한 약물 스크리닝을 허용하며, 다운스트림 분석 기술에 매우 적합합니다. 난소암과 CSC를 연구하는 데 이상적이지만, 당사의 플랫폼은 복잡한 3D 환경에서 다른 암 과 분화 세포 유형을 연구하는 데에도 유용합니다.
복합 3차원(3D) 모델은 암세포, 비암 지지 세포 및 세포외 매트릭스(ECM) 단백질로 구성된 3D 틈새 시장인 종양 미세환경(TME) 단백질을 연구하는 데 매우 중요합니다. 이러한 3D 환경은 시험관내 전통적인 2D 세포 배양에 비해 독특한 세포 형태, 세포 세포 및 세포 매트릭스 상호작용, 세포분화, 세포 이동, 세포 밀도 및 확산 구배를 초래한다 4. 이러한 모든 요인은 3D 배양 내의 차동 약물 반응에서 절정을이며, 약물 내성 및 생리적 관련성증가를 나타내며 7,8. CSC 분화 및 화학 저항성에서 3D TME의 역할로 인해 생리학적 미세 환경에서 약물을 대상으로 하는 CSC를 선별하는 것이 중요합니다. CSC 약물 스크리닝 플랫폼의 생리학적 관련성을 개선하는 것은 환자 특정 약물 스크리닝, 약물 개발, 치료 전략의 제형 및 궁극적으로 임상 결과를 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 약물 스크리닝에 사용되는 플랫폼이 높은 처리량과 다운스트림 분석 방법과 호환되어 유망한 약물의 비용, 시간및 임상 번역 시간을 최소화하는 것이 똑같이 중요합니다 9.
현재, 복합TME는 생리학적을 제공하기 때문에 뮤린 합성 종양 모델, 세포주 유래 이종이식 및 환자 유래 이종이식(PDX) 모델(12)과같은 생체 내 모델을 통한 약물 스크리닝 적용을 가장 잘 유지한다. 조건. 그러나, 이러한 모델들의 낮은 처리량 특성은 비용, 시간 및 기술적 기술 세트뿐만 아니라 신속하고 높은 처리량약물 스크리닝 애플리케이션에서 그들의 유용성을 제한한다. 이러한 생체내 모델에 대한 대안으로, 하이드로겔8,미세유체 장치 내 배양 또는 '오르간 온 칩' 장치10,14,및 비부착 배양3,8을 이용한 많은 시험관내 3D 모델 비용, 시간 및 필요한 기술 집합 측면에서 진입 장벽이 낮기 때문에 개발되었습니다.
하이드로겔 배양 플랫폼은 매트릭스 조성물, 기계적 특성 및 매트릭스구조(15)에걸쳐 제공되는 미세 제어에 유리하다; 그러나, 그들은 고밀도 세포 배양(14)을억제 할 수 있습니다. 또한, 하이드로겔로부터 의한 수확 세포는 수확 방법15의잠재적으로 유해한 영향으로 인해 하류 분석을 복잡하게 할 수 있다. 반면, 미세유체 장치는 동일한 장치 내에서 출력 검출을 허용하고, 시약의 소비를 최소화하고, 반응 시간을 줄이며, 폐기물을 최소화하며, 생리학적으로 관련된 스케일에서 세포 배양을 가능하게 하는 마이크로스케일 장치이며, 급속 한 확산14. 이러한 특성으로 인해 약물 독성, 효능 및 약물 동태학을 조사하기 위한 유망한 플랫폼이 됩니다. 그러나 효율적이고 정량화 가능하며 재현 가능하며 사용자 친화적인 3D 세포 배양뿐만 아니라 부피가 크고 비용이 많이 드는 펌핑 시스템의 과제는 고처리량 연구에서 미세 유체 응용을 제한했습니다10. 효율적인 검출 설정및 필드 전반에 걸친 잠재적으로 어려운 구현은 또한 미세 유체 시스템10의광범위한 채택을 방해했다.
반대로 회전 믹서(nutators), 초저 부착 플레이트 및 매달려 있는 물방울에서 비부착 조건에서 생성된 스페로이드는 사용자 정의 매트릭스 성분을 포함하지 않습니다. 이러한 방법론은 특히 비 부착 조건이 스페로이드가 복강 내에서 성장하는 조건을 대표하기 때문에 난소암을 연구하는 데 특히 관련이있습니다5. 이러한 비 부착 배양 방법 내에서, 영양기와 매달려 드롭 스페로이드는 초저 부착 플레이트에서 생성 된 스페로이드에 비해 더 높은 압축, 리모델링 및 화학 저항을 나타내는 것으로 나타났습니다, 증가 생리학적 제안 관련성16,17,18,19. 더 작은 우물 크기와 최소한의 필요한 셀 번호에서 높은 처리량 스크리닝을 위한 증가된 용량으로 인해, 매달려 있는 드롭 플레이트의 스페로이드 생성은 약물 스크리닝을 위한 이상적인 플랫폼입니다. 여기에서, 우리는 384 잘 매달려 있는 낙하 판에 있는 조정 가능한 3D 생리학 플랫폼을 제시합니다, 그 구현하기 쉽고 다운스트림 분석에 높게 순종합니다, 난소암과 난소 CSCs의 높은 처리량 약 검열을 위해 이상적 만들기.
우리의 3D 생리학적 플랫폼은 생리적 세포-세포 접촉, 확산 구배, 세포 밀도 및 자연적으로 생성된 ECM 단백질을 포함하여 3D 배양의 모든 장점을 제공하며, 이는 현실적인 약물 반응에 기여할 수 있습니다16, 17,18,19. 추가적으로, 환자 파생된 CSCs를 가진 이 스페로이드를 생성해서, 우리는 많은 기술적인 복제를 동시에 가진 약1에 환자 특정 반응을 결정할 수 있습니다, 참을성 있는 종양 내의 찾아질 수 있는 이질성을 극복하기 위하여 샘플20. 더욱이, 3D 문화는 CSC 인구3,16의 유지관리를 향상시키는 것으로 나타났으며, 따라서 7의 풍부한 CSC 인구를 대표한다. 이는 생존 가능성 및 CSC 비율의 유세포 분석 분석을 포함한 쉬운 다운스트림 분석과 결합되어 CSC 표적화 약물 효능을 최적으로 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 이 생리학적 플랫폼은 실험 중 여러 시점의 이미징과 호환되며, 세포 사멸 및 증식 평가, 면역조직화학을 위한 세포 조직 및 형태학, 조건부 ELISA를 위한 수용성 신호 중간, 유세포 분석및 PCR 에 따른 유전자 발현을 가진 세포 표현형.
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Protocol
모든 환자 샘플은 승인된 IRB 프로토콜에 따라 승인된 환자로부터 수집되며, 그 샘플은 종양 디벌킹 및 복수 수집 후 비식별화됩니다.
1. 384 웰 행잉 드롭 플레이트에서 작은 세포 번호에서 스페로이드의 생성
- 멸균 탈이온화(DI) 물로 채워진 초음파 처리기에 매달린 드롭 플레이트를 놓고 20분 동안 초음파 처리합니다.
- 장갑을 낀 손으로 초음파 검사기에서 접시를 제거하고 흐르는 DI 물로 씻으하십시오.
- 단백질 흡착과 우물에 대한 구형 준수를 방지하기 위해 접시가 0.1 % Pluronic 산의 욕조에 앉아 있게하십시오.
- 장갑을 낀 손으로 접시를 제거하고 흐르는 DI 물로 플레이트의 양면을 완전히 헹구십시오.
- 생체 안전 캐비닛 내부의 플레이트를 적극적으로 두드리거나 흔들어 멸균 환경에서 우물에서 물을 제거합니다.
- 플레이트를 살균하고 오염을 최소화하기 위해 각 측면에 30-60 분 동안 UV 광 아래에 플레이트를 놓습니다.
참고: 플레이트는 또한 멸균을 위해 챔버내의 에틸렌 옥사이드 가스에 노출될 수 있다. - 멸균 오토클레이브 DI 워터 4-5 mL로 6웰 플레이트의 각 우물을 채우고 뚜껑과 6웰 플레이트 바닥 사이에 매달린 드롭 플레이트를 끼웁니다. 매달려 있는 드롭 플레이트의 테두리 주위에 800-1,000 μL의 멸균 DI 물을 추가하여 증발로 인해 손실되는 부피를 최소화하기 위해 습하고 안정적이며 멸균 된 환경을 제공합니다 (그림1 A-C).
- 2D 성장 세포의 경우, 성장의 로그 단계에서 세포를 덮는 배지를 흡인하고 1x 인산완충 식염수(PBS)로 세척하여 성장 배지에서 태아 소 혈청(FBS)의 흔적을 제거하여 트립신의 작용을 방해한다.
- PBS를 흡인하고 100 mm 조직 배양 접시에 0.25% 트립신-EDTA의 1.5-2 mL을 첨가한다. 37°C로 설정된 인큐베이터에서 5분 동안 세포를 인큐베이터.
참고: 세포는 다른 비율로 분리할 수 있습니다, 그래서 플레이트는 5 분 후에 세포 분리를 지키기 위하여 벤치탑 빛 현미경에 검사되어야 합니다. - 트립신을 중화하기 위해 FBS 또는 혈청을 함유 한 세포 배지 6-8 mL을 추가하고 10 mL 의 혈청 학적 파이프로 세포를 수집하고 15 mL 원추형 튜브에 보관하십시오.
- 혈세포계의 각 면에 셀 현탁액의 10 μL을 로딩하여 세포를 카운트하고 관련 계수 프로토콜을 따릅니다.
- 1차 또는 전이성 고형 종양또는 2D 배양되지 않은 복수로부터 수집된 환자 유래 세포의 경우, 앞서 설명한 혈청자유 배지(SFM)에서 단일 세포 현탁액을 준비한다 3.
- 앞서 설명한 바와 같이 종양 조직을 처리하고 적절한 동결 배지21,22에서나중에 사용하기 위해 단일 세포 현탁액을 저장한다.
- 고형 종양 조직의 경우, 밀도 구배21,22로부터원하는 세포를 분리하기 전에 40 μm 필터를 통해 면도날 및 필터 생성 용액으로 기계적으로 다진다.
- 복수시료의 경우, 원심분리에 의한 세포 집중, 암모늄-염화물 칼륨(ACK) 완충액에서 적혈구를 용해시키고, 1x PBS로 세척한 다음, 40 μm 필터와 28 G 바늘을 4회22회통과한다.
- 난소 CSC의 격리를 위해, 상세히 아래에 설명된 대로 유세포측정을 가진 세포를 분류하십시오.
- 갓 분리된 단일 세포는 저장을 위해 동결되고 실험에 필요할 때 해동됩니다.
- 도금을 위한 셀 현탁액을 준비하려면 도금에 필요한 셀 용액의 원하는 부피를 계산합니다: 드롭당 20 μL X 총 액적 수 = 총 용액 부피 필요.
- 세포 농도를 20 μL당 원하는 세포 농도로 희석한다(즉, 20 μL 드롭에서 100세포).
- 도금 전에 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 부드럽게 혼합하여 세포의 균일한 분포를 보장하고 액적 간의 균일성을 향상시킵니다.
참고: 세포 현탁액의 과잉 혼합은 매달려 있는 드롭 스페로이드에 있는 세포 죽음 및 파편으로 이끌어 낼 수 있습니다. - 약 45°의 각도로 파이펫 의 끝을 잘 놓고 셀 용액의 파이펫 20 μL을 각 매달려 있는 드롭에 잘 놓습니다.
참고: 도금 패턴은 필요한 스페로이드의 수에 따라 조정할 수 있습니다. 다른 모든 우물에서 도금 스페로이드는 많은 양의 스페로이드가 실험에서 필요하지 않을 때 안전하며, 이는 방울의 우발적인 병합을 방지하기 때문입니다(그림1D,E). 실험에 많은 양의 스페로이드가 필요한 경우, 모든 면에 한 줄의 국경 우물을남기고 모든 것을 잘 플레이트합니다(그림 1F). - 6웰 플레이트의 뚜껑을 매달아 놓은 드롭 플레이트 위에 놓고 수분 손실에 민감하지 않은 신축성 있는 열가소성 스트립을 사용하여 가장자리를 밀봉하고 물방울의 추가 증발을 방지합니다. 표준 CO2 가습 인큐베이터(5% CO2,37°C)에서 배양한다.
- 잘 함유된 각 스페로이드에 2-3 μL을 첨가하여 필요한 영양소를 위한 세포 배양 배지를 보충하기 위해 2-3일에 한 번씩 매달아 드랍시다.
참고: 이미징 후, 이미징 중 공기 노출이 증발로 이어지기 때문에 매달린 방울을 공급하는 것이 좋습니다.
2. 매달려 드롭 스페로이드 플레이트에 세포 배양 배지 추가
- 생물안전성 캐비닛 내에서 열가소성 스트립 및 뚜껑을 제거하고 매달아 놓는 각 웰에 적절한 배양 배지의 2-3 μL을 추가합니다.
참고: 추가된 볼륨은 드롭 크기와 수유 사이의 시간에 따라 달라집니다. - 먹이후, 상단 뚜껑으로 접시를 덮고 접시를 인큐베이터에 다시 넣기 전에 외부 가장자리에 신선한 열가소성 스트립을 적용합니다.
3. 스페로이드 형태학의 위상 대조 이미징
- 생체 안전 성 캐비닛에서 플레이트 가장자리 주위에서 열가소성 스트립을 제거합니다.
- 뚜껑이 여전히 제자리에 있는 생물 안전 성 캐비닛에서 384 웰 매달려 있는 드롭 스페로이드 플레이트를 조심스럽게 제거하고 에피인광 현미경의 현미경 트레이에 놓습니다.
- 이미징 소프트웨어의 라이브 이미징 옵션을 4배, 10x 또는 20x로 사용하여 매달려 있는 드롭 스페로이드를 관찰하고 원하는 이미지를 촬영합니다.
- 이미지를 저장한 후, 상기와 같이 플레이트를 생체 안전성 캐비닛 및 이송 셀로 되돌려 놓습니다.
- 신선한 열가소성 스트립으로 접시를 다시 밀봉하고 밀봉 된 접시를 인큐베이터에 다시 놓습니다.
4. 스페로이드 내의 증식 및 생존 가능성의 정량화
- 플레이트 스페로이드는 검사되어야 하는 각 시점(즉, 1일차 및 7일째)에 대해 >10의 기술적 복제본을 얻기에 충분한 수의 웰로 되어 있다.
참고: 이 분석에 사용되는 웰은 일반적으로 resazurin 염료에서 잠재적인 오염 물질 때문에 다시 사용되지 않습니다. - 증식 분석을 위해 지정된 우물에 2 μL의 여과 된 resazurin 기반 용액을 추가하고 미리 결정 된 잠복기 동안 그 우물을 먹이고 배양하십시오.
참고: 이 배양 시간은 세포 유형 및 스페로이드의 세포 수에 따라 달라질 수 있습니다. 1시간 배양 후 측정을 시작한 다음 제어 우물 고원의 신호 판독이 있을 때까지 30분마다 다시 측정하여 증식 실험을 시작하기 전에 필요한 인큐베이션 시간을 결정하는 것이 좋습니다. 분석 수치는 원하는 만큼 여러 번 취할 수 있습니다. 배양은 전형적으로 100개의 암세포로 개시된 스페로이드에 대해 4시간이다. - 먼저 마이크로 플레이트 리더를 켜고 먼저 관련 플레이트 리더 소프트웨어를 처음 판독하기 최소 15분 전에 기계가 온도가 판독값에 영향을 미칠 수 있기 때문에 내부 온도를 22°C에서 예열하고 고정할 수 있도록 합니다.
- 530/25 nm 여기및 590/35 nm 방출 파장이 있는 384웰 플레이트 프로토콜을 열면 광학이 바닥으로 설정되고 게인은 35로설정되고 속도는 정상으로 설정되고 형광으로 설정된 읽기 유형은 .
- 잠복기 후, 생물 안전 성 캐비닛에 매달려 드롭 샌드위치를 열고 플레이트 리더에 여전히 제 자리에 뚜껑이있는 384 웰 플레이트를 가져온다.
- 384웰 플레이트에 뚜껑이 있는 플레이트 판독기 트레이에 놓으면 기계가 예열되면 연장되고 확인을 클릭하여 플레이트를 읽습니다.
- 웰 플레이트를 6웰 베이스로 되돌려 인큐베이터에 놓습니다. 하루 동안 모든 시간 포인트를 읽은 경우, 인큐베이터에 다시 배치하기 전에 접시를 다시 밀봉하십시오.
- 팝업 창에 실험을 저장한 다음 플레이트 1용 PowerExports를 실행하려면 예를 클릭하여 플레이트 리더 소프트웨어의 데이터를 조직을 위한 스프레드시트로 출력합니다.
- 각 조건에 대한 평균 형광 값은 다양한 실험 조건에서 확산의 배 변화를 보고하기 위해 대조조건의 평균에 의해 정규화한다.
- 1일째와 7일을 비교할 때, 1일째 평균 형광으로 나누어 정상화하여 시간이 지남에 따라 배 의 배 변화를 얻는다.
- 평균의 표준 오차를 사용하여 오차 막대를 계산하고 학생의 두 꼬리 T 시험과 같은 적절한 통계 테스트를 가진 실험 그룹 간의 통계적 유의를 결정합니다.
5. 스페로이드의 약물 독성 평가
-
약국
- 스페로이드 형성 후 언제든지, 2 μL 투여량이 원하는 최종 약물 농도의 10배를 함유하도록 원하는 농도로 희석된 약물을 전달한다.
참고: 이는 액적으로부터 2 μL의 증발을 가정하여 약물 치료 후 종료량이 20 μL이되도록 한다. 예를 들어, 시스플라틴의 50 μM 투여량은 500 μM의 제조된 용액을 가질 것이다. 물방울이 20 μL 이상을 포함하는 경우, 약물 및/또는 첨가된 부피의 농도를 그에 따라 조정해야 합니다. - 세포 배양 배지의 2 μL로 대조군 샘플을 치료하십시오.
참고: 시스플라틴은 물에 용해됩니다. 따라서, 대조군은 세포 배양 배지의 2 μL; 그러나, 약물 비모가 상이한 용매(예를 들어, DMSO)인 경우, 대조군은 약물 치료에 사용되는 것과 동일한 농도의 DMSO를 가진 세포 배양 배지여야 한다. - 상 현미경검사법으로 약물 잠복기 동안 치료된 약물 및 대조군 스페로이드를 계속 모니터링하여 전술한 바와 같은 물질 독성의 효과뿐만 아니라 세포 생존가능성을 모니터링하는 데 따른 반응기염의 효과를 시각적으로 기록한다.
참고: 전형적으로, 약은 48-72 hs 후에 측정된 매달려 있는 낙하 및 독성에 있는 5-7 일 후에 추가됩니다 그러나 이것은 실험에 따라 변화될 수 있습니다. 약물은 안정된 스페로이드가 형성되는 즉시, 일반적으로 1-4 일 사이에 추가 될 수 있습니다.
- 스페로이드 형성 후 언제든지, 2 μL 투여량이 원하는 최종 약물 농도의 10배를 함유하도록 원하는 농도로 희석된 약물을 전달한다.
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세포 계수에 의한 약물 독성 정량화
- 약물 치료의 종료 시점에서, 제어 및 약물 처리 우물에서 각각 10 스페로이드를 수집하고 자신의 미세 원심 분리 튜브에 스페로이드의 각 세트를 증착 1,000 μL 파이펫을 사용하여.
- 반복된 파이펫팅을 통해 스페로이드를 단일 세포로 분해합니다.
참고: 반복된 파이펫팅으로 인한 잠재적인 세포 손상을 줄이기 위해 트립신과 같은 효소를 함유한 효소 소화는 파이펫팅(23) 전에 단일 세포 용액의 생성을 용이하게 하기 위해 수행될 수 있다. 파이펫팅으로 인한 세포 사멸의 최소화는 세포 유형에 따라 달라지며 그에 따라 최적화되어야 합니다. 분리로 인한 사망에 대해 우려하는 경우, 스페로이드 분리를 필요로하지 않는 대체 방법에 대한 resazurin 염료 및 세포 독성 분석분석분석을 참조하십시오. - 400 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하여 미세 원심 분리튜브의 바닥에 세포를 수집하고 상월체를 흡인합니다.
- 각 튜브에 20 μL의 신선한 용지 또는 1x PBS를 넣고 잘 섞습니다.
- 트립판 블루를 2μL의 비율로 추가하여 20 μL의 셀 서스펜션에 트리판 블루 얼룩을 더합니다.
- 10 μL의 세포와 Trypan 파란색 현탁액을 혈전계의 각 챔버에 로드하고 빛 현미경으로 세포를 계산하며, 죽은 세포를 나타내는 파란색 스테인드 세포와 살아있는 세포를 나타내는 스테인드 세포를 계산합니다.
- 라이브 셀 % = (라이브 셀 의 수 총 셀 수) x 100.
6. 조직학적 기법을 가진 스페로이드 특성화
참고: 이바노프 등24: 1) 20 웰 당 28 μL을 보유 할 수있는 20 웰 금형을 복제하기 위해 생체 적합성 폴리머에 인쇄 된 두 가지 금형 옵션이 있습니다 2) 63 웰 당 9 μL을 보유 할 수있는 63 웰 금형 (그림2D).
- 70% 에탄올로 닦아내고 몰드 주변에 테두리를 단단히 부착하고 금형을 똑바로 세워 서 살균하십시오. 두 금형 모두 약 3mL의 유체(20개의 스페로이드 어레이의 경우 3.203mL, 63개의 스페로이드 어레이의 경우 3.196mL)에 적합합니다.
- 10,000 cSt Si 오일로 스페로이드 어레이를 뾰족한 면봉을 사용하여 가볍게 코팅하여 후속 단계에서 시편 처리 젤 을 쉽게 제거할 수 있습니다.
- 뚜껑을 풀고 전자레인지를 통해 액화될 때까지 10-20s까지 예열합니다.
- 2.6~2.8mL의 용융 가공 젤을 테두리 상단과 거의 평평해질 때까지 금형에 넣습니다.
- 몇 분 후에 응고되면, 몰드로부터 테두리를 분리한 다음 어레이 몰드를 반전시켜 가공 겔 주조를 제거한다.
- 금형과 테두리 사이에 트위저 팁을 삽입하여 조심스럽게 분리한 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 즉시 분리하지 않으면 금형에서 캐스트를 빼냅니다.
- 1,000 μL 파이펫으로 100 또는 150 mm 세포 페트리 접시에 단일 우물의 내용물파이프를 하여 매달려 있는 드롭 플레이트에서 스페로이드를 수확하고, 스페로이드를 시각적으로 분리한다.
- 파이펫 5 μL의 유정 함량은 어레이 웰 중 하나에 식별된 스페로이드를 포함하며, 어레이가 채워질 때까지.
- 스페로이드가 어레이 의 바닥에 정착되었는지 확인하기 위해 3 분 정도 기다린 후 용융 처리 젤을 각 우물에 부드럽게 피펫팅하여 스페로이드를 방해하지 않도록주의하십시오.
- 추가 처리 젤을 추가하여 어레이 의 상단을 평평하게 하고 일단 냉각되면 고화 된 스페로이드 어레이를 처리를 위해 표지 된 카세트에 놓습니다.
- 라벨이 부착된 카세트를 4% 포르말린으로 하룻밤 동안 4°C에서 고정한 다음 가공준비가 될 때까지 4°C에서 70% 에탄올로 보관합니다.
- 표준 1 h 파라핀 프로그램으로 처리한 다음 처리된 배열이 블록 면에 가장 가까운 웰의 바닥을 똑바로 향하도록 스페로이드 배열을 임베드합니다.
- 어레이가 가능한 한 평평하게 내장되어 있는지 확인하고 바닥 면이 블록의 바닥과 플러시되고 블록을 얼음 위에 놓습니다.
- 블록을 마이크로톤에 로드하고 블레이드가 로드된 블록 면과 평행하도록 블록을 조정합니다.
- 배열 웰의 바닥에 도달할 때까지 배열(샘플 깊이 = 15 μm)을 절단하여 원형 웰이 절단 샘플에 표시되도록 합니다.
- 5 μm 샘플 깊이로 전환하고 리본을 슬라이스하고 수집합니다. 스페로이드 깊이에 도달했는지 확인하기 위해 몇 조각마다 현미경으로 확인하십시오. 일단 스페로이드에 도달하면 스페로이드가 더 이상 보이지 않게 될 때까지 각 후속 슬라이드를 수집합니다.
- 표준 H&E 프로토콜로 각 슬라이드에 얼룩을 지십시오.
7. 살아있는 세포 독성 분석
- 각 매달린 방울에, 살아있는 세포 염료, 칼세인-AM을 최종 농도 2 μM에 추가하고, 죽은 세포 염료, 에티듐 호모디머-1을 4 μM의 최종 농도에 첨가하고, 낙하량이 20 μL임을 명심한다.
참고: 볼륨을 최소한으로 유지하고 일반적으로 결합된 염료 2 μL을 추가하십시오. - 뚜껑이 있는 6웰 플레이트에 끼운 인큐베이터에 접시를 다시 놓고 37°C에서 45분 동안 스페로이드를 배양합니다.
참고: 스페로이드의 크기에 따라이 배양 시간은 크게 다릅니다. 예를 들어, 400 μm 미만의 스페로이드는 일반적으로 30-45 분의 배양 시간만 필요로하는 반면, 800 μm에 가까운 큰 스페로이드는 최대 90 분의 배양 시간이 필요합니다. 인큐베이션 시간은 개인의 실험에 최적화되어야 합니다. - 후속 이미징을 위해, 생물 안전 성 캐비닛에 1,000 μL 파이펫으로 스페로이드를 수확하고 각 스페로이드를 미리 세척 된 유리 현미경 슬라이드에 적재하십시오.
- 유리를 통해 이미지 스페로이드, 반전 공초점 현미경에.
참고: 스페로이드가 수확되는 실험실에 공초점 현미경의 근접에 따라, 스페로이드는 슬라이드에 배치된 매체의 원래 물방울에서 이미지화되거나 스페로이드 수송을 위해 더 많은 안정성이 필요한 경우 2% 아가로오스에 싸여 있을 수 있습니다. - 현미경 소프트웨어에서 다차원 수집 모드를 사용하여 10배 배율의 DIC 조명을 사용하여 스페로이드를 찾은 다음 z 평면을 스캔하여 스페로이드를 포함하는 높이를 식별합니다.
- Z 시리즈를 클릭하고 z-scan의 상한과 하한을 스페로이드 상단보다 약간 높고 스페로이드 의 하단보다 약간 낮게 설정합니다.
- 칼세인-AM(살아있는 세포; 녹색)의 경우 488 nm에서 스페로이드를 자극하고, 에티듐 호모디머-1(죽은 세포; 적색)의 경우 소프트웨어에서 권장하는 스텝 크기, 최대 이득 및 각 색상에 대한 최소한의 노출로 561 nm를 자극합니다.
- 획득을 클릭하여 스페로이드 내의 살아있는 세포와 죽은 세포의 합성 z 스택 이미지를 가져옵니다.
- 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 라이브/데드 비율을 정량화하여 라이브 셀에 해당하는 채널의 픽셀 강도 백분율과 합성에서 죽은 셀에 해당하는 채널의 픽셀 강도 백분율을 정량화합니다. z-프로젝션 이미지.
참고: 2D 프로젝션으로 3D 구조를 정량화하는 데 한계가 있기 때문에, 살아있는 형광과 죽은 형광을 정량화하는 대체 방법은 매달려 있는 드롭 플레이트 내에서 칼세인-AM 및 에티듐에 포함된 프로토콜에 따라 플레이트 리더를 사용하는 것입니다. 호모디머-1 키트.
8. 면역 형광
- 낮은 용융 2 % 아가로즈 용액을 가열, 그래서 용액은 점성 바로 위의 녹는 점성이며, agarose의 부드러운 침대를 만들기 위해 현미경 슬라이드에 배치
- 2% 아가로즈의 연약한 침대에 떨어뜨리기를 통해 PBS의 20 μL을 밀어서 스페로이드를 수확합니다.
참고: 이것은 아가로오스가 스페로이드가 내장되기 전에 굳어지지 않도록 신속하게 수행해야합니다. - 아가로즈가 식고 5분 미만의 내에 갇힌 수확된 스페로이드로 젤을 식히고 나면, 4% 중성 완충 포르말린을 추가하여 스페로이드를 고치세요. 또는 얼음 차가운 메탄올을 넣고 아가로즈 내장 스페로이드를 -20 °C에서 30 분 동안 고정시다.
- 1x PBS로 5분 동안 3x를 씻고, 각 세척 후 PBS를 버리십시오.
- 10% 혈청(즉, 말 세럼)과 0.15% 비누 용액(트리톤 X-100)을 1x PBS로 RT에서 1시간 동안 차단합니다.
- 1x PBS로 5분 동안 3x를 씻고, 각 세척 후 PBS를 버리십시오.
- 권장 또는 미리 결정된 항체 희석(즉, 1:100 희석시 형광 표지된 파할로이드)에서 원하는 형광 항체를 가진 스테인 스페로이드는 실온에서 적어도 90분 동안 배양하고 빛으로부터 덮여 있다.
참고: 프로토콜은 항체 및 표적 및 항체 희석에 따라 달라질 수 있으며 실험에 따라 최적화될 필요가 있다. - 이미징 스페로이드를 위해 이전 섹션에서 설명한 방법을 사용하여 반전된 공초점 현미경으로 형광염색 스페로이드를 시각화합니다.
- 합성 z-스택 이미지는 스페로이드에서 3D 형태를 보여줍니다.
9. 유세포분석으로 암 줄기세포 집단의 수집 및 분석
- 유세포분석용 스페로이드 준비
- 1,000 μL 파이펫을 사용하여 매달려 있는 낙하 플레이트의 각 우물에서 스페로이드를 수집하고 반복된 파이펫팅으로 분리를 위해 15 mL 원심분리튜브에 보관합니다.
- 위에서 설명한 대로 세포 수와 농도를 결정하기 위해 Trypan Blue를 사용하여 혈전계에서 가능한 세포를 계산합니다.
- 5개의 미세원심지 튜브로 Aliquot 세포 현탁액을 각각 최소 50,000개의 세포를 함유한다.
- 400 x g의 모든 튜브를 미세 원심 분리기에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 각 튜브에서 상류를 흡인하고 완충액 100 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 라벨 튜브 "비염색", "DAPI", "APC-iso", "DEAB", "ALDH/CD133".
- APC-이소타입 항체의 0.5 μL을 APC-이소관에 추가하고, 직렬 희석 및 제조업체의 권고에 따라 ALDH/CD133 튜브에 CD133 항체의 1 μL을 추가합니다.
- DEAB 시약 5 μL과 ALDH 0.5 μL을 DEAB 튜브에 추가하고 ALDH/CD133 튜브에 1 μL의 ALDH를 추가합니다.
- 모든 튜브를 약 2s에 대해 소용돌이시키고 37°C에서 45분 동안 배양한다.
- 모든 튜브를 다시 소용돌이시키고 400 x g에서 마이크로 원심 분리기에서 5 분 동안 원심 분리기를.
- FACS 튜브를 "얼룩이 없음", "DAPI", "APC-iso", "DEAB", "ALDH/CD133"에 라벨을 부착하고 절연 폼 용기를 채우십시오.
- 400 μL FACS 버퍼 (2 % FBS를 가진 1 x PBS)와 FACS DAPI 버퍼의 400 μL의 다른 모든 튜브 (300 μM 4',6-diamidino-2-phenylindole를 가진 FACS 버퍼)에서 "얼룩지지 않은"제어를 흡인하고 다시 중단하십시오.
- 유세포계에서 분석될 때까지 튜브를 얼음이 있는 용기에 놓습니다.
참고: 난소암 줄기 세포를 분류하기 위해, 세포계가 ALDH+ 및 CD133+로 측정하는 모든 세포를 게이트로 수집하여 0.5% 비특이적 APC 신호및 0.15% 비특이적 ALDH+ 신호를 포함하도록 설정하였다. 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 적어도 10,000개의 셀을 분석해야 합니다. 자세한 내용은 최근 간행물3,17에서찾을 수 있습니다.
- FlowJo의 ALDH+/CD133+ 인구 분석
- FlowJo 아이콘을 두 번 클릭하여 프로그램을 열고 흐름 세포 분석 소프트웨어에서 얻은 .fcs 파일을 작업 공간으로 드래그합니다.
- 스테인되지 않은 파일을 두 번 클릭하고 y축을 측면 산란 높이(SSC-H)와 x축을 앞으로 분산 높이(FSC-H)로 설정합니다.
- 각 축 옆에 있는 T 버튼을 클릭하여 배율과 변환을 조정하여 다양한 셀 채우기 간의 분리를 최대화합니다.
- 다각형 게이팅 버튼을 클릭하고 셀 모집단 주위에 다각형 게이트를 그리고 모집단 '셀'에 레이블을 지정합니다.
- 작업 영역에서 셀 채우기를 두 번 클릭하여 '셀' 채우기 내의 셀만 보려면 FSC 축을 클릭하여 축 채널을 FSC 폭으로 변경한 다음 SSC 축을 클릭하고 축 채널을 FSC-H로 변경합니다.
- 사각형 게이트 도구를 선택하고 y축 전체를 아우르는 가장 조밀한 셀 모집단 주위에 사각형을 그려 창 의 오른쪽을 향한 잠재적인 이중을 배제하고 이 게이트를 '단일 셀'이라고 레이블을 지정합니다.
- 셀 게이트와 중첩된 단일 셀 게이트를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 복사하여 작업 영역의 각 샘플 아래에 붙여넣습니다.
- 작업 공간의 DAPI 샘플 아래에 중첩된 단일 셀 게이트를 두 번 클릭하여 해당 샘플 튜브에서 단일 셀 모집단을 보고 FSC 축을 클릭하고 축 채널을 DAPI- 영역 채널로 변경합니다.
- SSC 축을 클릭하고 축 채널을 히스토그램으로변경합니다.
참고: 라이브 셀은 DAPI를 제외할 때 왼쪽으로, 죽은 셀은 DAPI를 받아 그래프의 오른쪽쪽으로 나타납니다. - DAPI 축 옆의 T 버튼을 클릭하고 축 사용자 지정을 클릭하여 축 을 조정하여 배율을 조정하여 DAPI 양수 피크와 DAPI 음수 피크 간의 분리를 최대화합니다.
참고: 크기 조정 옵션이 있는 창이 나타납니다. 종종 배율 필드를 Biex로 설정하고 추가 음수 수십 년 및 너비 기준을 조정하면 가장 큰 분리가 발생합니다. - 팝업 창에서 적용을 클릭하여 크기 조정 변경을 적용하고 범위 게이트 단추를 선택한 다음 라이브 셀 모집단에 해당하는 DAPI 음수 피크위로 분산합니다.
- 이 게이트에 '라이브 셀'에 레이블을 지정하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 '라이브 셀' 게이트를 복사하여 'APC-ISO, DEAB' 및 'ALDH/CD133' 튜브 아래의 '단일 셀' 게이트 아래에 붙여각 샘플 튜브에서 동일한 부분을 선택합니다.
- 그런 다음 APC-iso 샘플 파일 아래에 중첩된 라이브 셀 채우기를 두 번 클릭하고 x축을 ALDH- 영역 채널 및 y축을 APC - 영역 채널로 전환합니다.
- 다시 말하지만 T 단추를 클릭하여 축 축 을 조정하고 각 축의 축을 사용자 지정하여 이벤트가 플롯의 왼쪽 아래 영역에 지역화되도록하고 쿼드 게이트 옵션을 선택하고 플롯 창을 클릭하여 사분면 게이트를 설정합니다. .
- 인구의 약 0.5%가 플롯 창또는 'APC 양수' 사분면의 왼쪽 상단에 위치되도록 게이트의 교차점을 조정합니다.
참고: 이 0.5%는 APC 등형의 비특이적 염색을 나타낸다. - 작업 영역에서 각 사분면 레이블을 개별적으로 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 적절하게 이름을 바꿉니다. 제어 또는 명령은 작업 공간에서 각 사분면 게이트 레이블을 클릭하고 복사합니다.
참고: 'Q1'은 CD133+ 셀을 나타낸다. 'Q2'는 CD133+ 및 ALDH+' 세포를 나타낸다. 'Q3'는 ALDH+ 세포를 나타낸다; 및 'Q4'는 CD133- 및 ALDH-세포를 나타낸다. - 사분면 게이트를 'DEAB' 파일 아래에 중첩된 라이브 셀 인구에 붙여넣습니다. 셀 집단의 약 0.15%가 수평선을 이동하지 않도록 주의를 기울이는 'ALDH+' 사분면 내에 놓이도록 수직선을 조정한다.
참고: 이 0.15%는 비특이적 ALDH 신호를 나타낸다.- 수평선이 위치를 변경하지 않도록 하려면 DEAB 파일 아래에 중첩된 새 사분면 게이트를 복사하여 APC ISO 파일 아래의 라이브 셀에 붙여넣습니다. 기존 사분면 게이트를 교체하라는 메시지가 표시됩니다.
- 작업 영역에서 'CD133+' 퍼센트가 여전히 'APC-ISO' 파일 에서 약 0.5인지 확인합니다.
- 사분면 게이트를 복사하여 'ALDH/CD133' 파일의 '라이브 셀' 모집단에 붙여넣습니다.
참고: 오른쪽 상단 사분면에 존재하는 생존 세포 집단의 백분율은 샘플 내에서 ALDH+ 및 CD133+ 이중 양성 CSC의 백분율이 될 것입니다.
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Representative Results
세포주 또는 환자 유래 CSC로 형성된 스페로이드는 매달려 있는 액적 내에서 다양한작은 세포 수로 형성될 수 있다(도 2A). 스페로이드는 우물 당 10 개의 세포로 안정적으로 형성되어 희귀 한 환자 샘플을 보존 할 수 있습니다. 이 스페로이드 내의 세포는 생리적인 세포 세포 접촉 및 확산 비율을 허용하는 생체 내에 있을 것과 같이 3 차원에서 그밖 세포에 의해 포위됩니다. 스페로이드 내의 종양 세포는 시간이 지남에 따라 크기가 확장되는 스페로이드를 일으키는 원인이 되는 증식합니다 (그림2B). 더 공격적인 환자 세포 또는 세포주가 그들의 대응보다 빨리 증가함에 따라, 각 견본의 증식 능력을 정량화하고 약물 처리가 각 견본의 증식에 어떻게 영향을 미치는지 검토하는 것이 중요합니다. 이를 위해, resazurin 계 형광 분석과 같은 대사 활성 분석술은, 384 웰 생리학적 플랫폼으로 쉽게 수행될 수 있으며, 그 결과는 도 2C에서볼 수 있다. 여러 스페로이드는 또한 헤마톡실린 및 에오신 또는 면역 형광 항체로 수확, 고정, 단면화 및 염색될 수 있으며, 동시에 스페로이드 내의 세포 형태및 조직뿐만 아니라 세포 유형 및 ECM의 분포를 식별할 수 있습니다. 단백질 (그림2D,E).
스페로이드 형태에 대한 약물 치료의 효과를 조사하기 위해, 스페로이드는 상 대비 이미징에의해 쉽게 시각화 될 수있다 (그림 3A). 보다 정량적으로, 종양 세포 또는 CSC 증식에 대한 약물 치료의 효과는 또한 치료되지 않은 스페로이드를 치료된 약물 치료스페로이드에 비해 대조군에서 resazurin 염료 형광 측정값에 의해 측정될 수 있다(도3B). 약물 치료 후 세포 사멸의 유효성검사로서, 각 조건에 대한 다중 스페로이드에 칼세인-AM 및 에티듐 호모디머-1을 첨가하여 제어 및약물 치료 스페로이드 내 생존가능성을 쉽게 결정할 수 있다(도 3C). 배양 시간 이후에, 스테인드 스페로이드는 피펫으로 수확하고 공초점 현미경에 심상할 수 있습니다.
마지막으로, 스페로이드를 수확하고 이를 단일 세포 현탁액으로 분산시킴으로써, CSC 및 기타 세포 표현형 마커의 존재를 유세포 분석으로분석할 수 있다(그림 4). 동일한 환자 내에서 상이한 약물 치료 사이의 실행 가능한 CSC의 비교뿐만 아니라, 환자 들 사이에서 환자 특정 방식으로 다양한 CSC 표적화 약물의 효과를 분별하는 데 도움이 될 수 있다.
그림 1: 3D 높은 처리량 384 매달려 드롭 스페로이드 플레이트 저장 및 도금 레이아웃. (A) 매달려 있는 드롭 플레이트는 부분적으로 물로 채워진 6 개의 우물 판의 바닥에 놓습니다. (B) 6 웰 플레이트의 뚜껑은 멸균 수화 챔버를 만들기 위해 매달려 드롭 플레이트 의 상단에 배치됩니다. (C) 6 웰 플레이트 스택은 수분 손실 및 오염 물질로부터 보호하기 위해 열가소성 스트립으로 밀봉됩니다. (D) 도금 패턴을 번갈아 걸이 드롭 플레이트. 분홍색 사각형은 세포와 중간 혼합물로 채워진 우물을 나타냅니다. 파란색 영역은 수화를 위한 물 챔버를 나타냅니다. 회색 상자는 수화 챔버와 스페로이드 방울 사이의 경계 역할을 하는 빈 우물을 나타냅니다. (E) 잘 번갈아 도금 된 드롭 플레이트의 라이브 이미지. (F) 모든 잘 도금 패턴 레이아웃 높은 처리량 매달려 드롭 전형화 실험에 활용. 분홍색 사각형은 셀 도금 웰을 나타내고 파란색 영역은 수분 공급을 위해 물이 채워진 챔버를 나타냅니다. 회색 사각형은 수화 섹션과 세포 배양 영역 사이의 경계 역할을 하는 테두리 웰을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 환자 유래 CSC 스페로이드 형태및 3D 매달려 방울 내의 증식. (A) 바닥에서 본 384 개의 드롭 스페로이드 플레이트의 라이브 이미지. (B) 환자 유래 CSC 스페로이드 성장후 2, 3, 및 5일 후의 진행성 광 현미경 이미지가 매달려 있는 드롭. 스케일 바 = 100μm. (C) Resazurin 형광 강도는 매달려 드롭 배양 후 7 일 후 상당한 증가를 나타내며, 매달려 있는 드롭 환자 유래 CSC 스페로이드의 증식 및 성장과 상관 관계가 있다(미짝 두 개의 꼬리 t-검정, p< 0.0001, n >10). (D) 구형 배열 금형의 사진은 구성 단편을위한 스페로이드의 컬렉션에 대한 캐스트를 만드는 데 사용. (E) H&E 이미지는 1차 난소암 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 내피세포 및 공여자 말초 단핵세포를 스페로이드 어레이에서 채취한 포어로 배양한 스페로이드의 이미지이다. 공포 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 환자 유래 CSC 스페로이드 의 약물 치료 분석 (a) 환자 유래 CSC 스페로이드를 50세포에서 시드/드롭하여 5일 후 파클리탁셀농도가 증가하여 처리하였다. 대표적인 이미지는 약물 치료 후 48 시간 촬영. (B) 파클리탁셀 처리의 농도가 증가함에 따라 레자주린 형광을 통한 세포 생존율의 정량화. 모든 샘플은 제어에 비해 생존능력이 현저합니다. (단방향 ANOVA, p&0.0001, n> 8). (C) 살아있는 (칼세인-AM) 및 죽은 (에티듐 homodimer-1) 세포의 공초점 화상 진찰은 매달려 있는 드롭 스페로이드 내의. 녹색은 라이브 셀을 나타내고 빨간색은 죽은 셀 집단을 나타냅니다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 384-교수형 낙하 플랫폼에서 생성되고 유지되는 환자 유래 CSC 스페로이드에서CSC의 정량화. (A) 유세포분석 데이터를 분석할 때, 세포 모집단은 먼저 다각형 게이트를 사용하여 이물질로 인한 모든 이벤트를 제거하기 위해 선택된다. (B) 단일 셀은 결과를 모호하게 할 수있는 잠재적 인 doublet 신호를 제거하기 위해 선택됩니다. (C) 모든 단일 라이브 셀은 DAPI 제외에 따라 선택됩니다. (D) 사분면 게이트의 수직 축은 DEAB 제어에서 조정되어 약 0.15% 비특이적 ALDH 염색을 허용합니다. (e) 사분면 게이트의 수평 축은 APC ISO 제어에서 조정되어 약 0.5% 비특이적 APC 염색을 허용합니다. (F) 사분면 게이트는 CD133+, ALDH+, 및 CD133+/ALDH+ 세포의 백분율을 결정하기 위해 사용되며, 실험적인 CD133 플러스 ALDH 조건에서 살아있는 세포 집단에 존재한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
3D 스페로이드 형성을 위한 384웰 매달려 있는 드롭 플레이트 플랫폼은 모든 세포 생물학 또는 암 생물학 실험실을 위한 쉽게 구현되는 도구입니다. 이 생리학적 플랫폼은 높은 처리량 약물 스크리닝을 허용하면서 생리학적으로 관련된 3D 배양 내에서 세포주뿐만 아니라 1차 환자 샘플을 연구할 수 있게 합니다. 또한 이 플랫폼은 배양 조건이 고도로 조정가능하도록 하여 도금 밀도, 세포 공동 배양 비율, 세포 외 성분 및 배지 조성을 엄격하게 제어할 수 있도록 합니다. 더욱이, 이 생리적인 플랫폼은 qRT-PCR, FACS 및 각종 화상 진찰 방법과 같은 크고 작은 세포 수를 요구하는 다운스트림 분석 기술에 실험이 높게 순종할 수 있게 합니다. 활용의 용이성은 경험과 함께 제공되지만, 새로운 연수생은 빠르게 성공하게되고, 일단 파이펫팅의 속도와 용이성을 마스터합니다. 따라서, 이러한 생리학적 플랫폼은 개인화된 3D 약물 스크리닝, CSC 생물학 및 화학저항성 조사에 매우 적용가능하다.
이 플랫폼을 새로 구현할 때 우려의 몇 가지 포인트는 플레이트 전송 및 약물 치료를 포함한다. 일상적인 수유, 이미징 및 분석에 필요한 대로 플레이트를 한 위치에서 다른 위치로 옮길 때는 불필요한 조림을 피하기 위해 신중한 예방 조치를 취해야 합니다. 플레이트를 바깥쪽 가장자리에서 그립하여 가능한 한 평평하게 유지하고 플레이트를 내려 놓을 때 비틀거리는 움직임을 피하십시오. 이것은 물방울 손실 또는 이웃 방울의 병합을 방지하는 데 도움이됩니다. 마찬가지로, 어떤 한 매달려 드롭 스페로이드의 잘못 된 투약을 피하기 위해 매달려 드롭 스페로이드를 치료 하는 약물 치료에 주의 주어져야 한다. 다른 기술과 마찬가지로 이러한 작업에 대한 자신감과 정확성은 연습으로 도착합니다.
이 3D 생리학적 플랫폼에는 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 액적 불안정성은 올바른 총 액적 부피를 유지하기 위해 주의를 취하지 않으면 장기간 배양 시점에서 문제가 될 수 있다. 또한 위에서 언급 한 바와 같이 판의 운반 및 보관은 물방울의 손실이나 병합을 피하기 위해 신중하게 수행해야합니다. 또한, 이 3D 환경에 대한 크기는 20 μL의 선천적 안정적 액적 크기에 의해 결정되지만 많은 복제본이 향상된 세포 수를 위해 생성될 수 있습니다.
이 3D 생리학적 플랫폼에 대한 수정은 처리량을 증가시키고 생리학적 특성을 변경하는 데 활용될 수 있다. 예를 들어, 384 웰 플레이트 내의 모든 웰을 포함하도록 액적 레이아웃을 변경하여 처리량을 늘릴 수 있습니다. 또한, 3D 매달려 드롭 플랫폼은 각 우물에 여러 세포 유형을 간단하게 포함시킴으로써 공동 배양 조사에 매우 도움이 됩니다. 스페로이드를 성공적으로 생성하고 유지하기 위해 세포 배양 배지 및 초기 세포 파종 밀도를 쉽게 조절하여 스페로이드 크기를 엄격하게 조절할 수 있습니다. 이러한 고도의 조정 가능한 변수를 사용하면 3D 생리학적 환자 유래 스페로이드 의 영역 내에서 수많은 조사가 가능합니다.
기술된 대부분의 분석 방법은 과학적 연구에서 널리 사용되지만, 이러한 방법 중 일부를 사용하여 매달린 드롭 생성 스페로이드를 분석하는 데 는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 예를 들어, 스페로이드가 매달린 드롭 플레이트에서 장시간 배양될 때, 액적 크기는 위상 대비 이미징 중에 물방울이 크게 흔들리게 하여 이미지 품질을 손상시킬 수 있습니다. 이것은 신선한 매체를 추가하기 전에 각 우물에서 적당한 양의 매체를 취하여 개량될 수 있습니다. 추가적으로, 유세포 분석과 개별 적인 실행 가능한 세포를 계수하는 것과 같은 기술은 세포에 유해할 지도 모르다 spheroids를 분해하기 위하여 이용된 기술에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 각 실험실은 세포에 기반한 스페로이드 분리 기술을 최적화하고 단일 세포 밀도를 최대화하면서 세포 손상을 최소화하기 위해 실험하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 스페로이드의 조직학적 분석은 작은 크기로 복잡해질 수 있으며 성공적인 단면을 얻기 위해서는 연습이 필요합니다.
전반적으로, 3D 매달려 있는 드롭 스페로이드 플랫폼은 암 및 비암 연구 내에서 널리 적응할 수 있습니다. 이 시스템은 배우기 쉽고 높은 처리량 형식으로 세포 배양을위한 3D 생리학적으로 관련된 환경을 제공합니다. 이 3D 생리적 플랫폼의 개시 시간은 최소한의, 몇 가지와, 있는 경우, 극복 하는 기술 분석 장애물. 이 시스템의 다양성은 그 어느 때보다 더 생리적 환경에서 정밀 의학을위한 효과적인 화학 요법의 환자 특정 스크리닝을위한 수단을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 주로 DOD OCRP 초기 경력 조사자 상 W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD 파일럿 상 W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD 조사자 시작 상 W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), 난소 암및 미시간 난소 암에 대한 리브킨 센터에 의해 지원됩니다 얼라이언스. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 P30CA046592의 밑에 건강의 국가 학회의 국립 암 학회에 의해 지원되었습니다. CMN은 그랜트 번호 1256260에서 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십에 의해 지원됩니다. MEB는 국가 필요 지역 (GAANN) 펠로우십에서 교육부 대학원 지원에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 mL conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1x DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1x F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | - | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum - premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | - | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | - | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | - | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | - | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | - |
References
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