Fysiologisk patient afledte 3D Sfæroider til anti-neoplastisk Drug screening for at målrette kræft stamceller

Summary

Denne protokol beskriver generering af patient afledte sfæroider og downstream-analyse, herunder kvantificering af proliferation, cytotoksicitets test, flow cytometri, immunofluorescens farvning og konfokale billeder, med henblik på at vurdere Kandidaternes potentiale som anti-neoplastisk terapi. Denne protokol understøtter præcisionsmedicin med identifikation af specifikke lægemidler for hver patient og sygdomsstadie.

Abstract

I denne protokol skitserer vi proceduren for generering af tumor sfæroider inden for 384-godt hængende dråber for at give mulighed for høj gennemløb screening af anti-cancer Therapeutics i en fysiologisk repræsentative mikromiljø. Vi skitserer dannelsen af patient afledte kræft stamceller sfæroider, samt, manipulation af disse sfæroider til grundig analyse efter narkotikabehandling. Specifikt, vi beskriver indsamling af sfæide morfologi, proliferation, levedygtighed, lægemiddeltoksicitet, celle fænotype og celle lokaliseringsdata. Denne protokol fokuserer stærkt på analyseteknikker, der let implementeres ved hjælp af 384-godt hængende drop platform, hvilket gør den ideel til høj gennemstrømning Drug screening. Mens vi understrege betydningen af denne model i ovariecancer undersøgelser og kræft stamcelleforskning, den 384-Well platform er modtagelig for forskning af andre kræfttyper og sygdomsmodeller, udvide nytten af platformen til mange områder. Ved at forbedre hastigheden af personlig Drug screening og kvaliteten af screening resultater gennem let implementeret fysiologisk repræsentative 3D-kulturer, denne platform er forudsagt til at støtte i udviklingen af nye lægemidler og patient-specifikke behandlingsstrategier og har dermed vidtrækkende klinisk virkning.

Introduction

Verdensomspændende kræft relateret dødelighed nåede en vejafgift på 9.800.000 dødsfald i 2018¹, hvilket understreger behovet for udvikling af forbedrede terapeutiske. Desværre, omkostningerne ved at udvikle kræftmedicin er stigende, med udviklingen af et enkelt stof koster ca 650.000.000 USD² angiver behovet for forbedrede strategier til at udvikle nye anti-cancer narkotika. Kræft stamceller (CSCs), som er karakteriseret ved øget chemoresistance³, evnen til at selv forny, og evnen til at frø nye tumorer⁴ menes at være ansvarlig for tumor recidiv⁴, metastase⁵, og chemoresistance^4,6, som alle bidrager til den maligne kapacitet af tumoren og dermed den høje dødstal. I kræft i æggestokkene, disse celler er fundet beriget i den maligne ascites væske i bughulen, en tilstand forbundet med dårlige kliniske resultater¹. Som et resultat af de ondartede kapaciteter af CSCs, har der været et skub til at udvikle nye CSC målretning narkotika til brug i forbindelse med traditionelle kemoterapeutika. Der er flere udfordringer, der ledsager udviklingen af CSC målretning narkotika herunder: 1) vanskeligheder med at udvide og vedligeholde CSCs in vitro; 2) mangel på patientprøver; 3) den fysiologiske relevans af kultur platformen; og 4) heterogenitet i lægemiddel følsomhed mellem patienter. Denne protokol skitserer gennemførelsen af en høj gennemløb 3D kultur platform, der kan overvinde hver af disse udfordringer. Dette system giver især mulighed for hurtig lægemiddel screening ved hjælp af et lille antal patient afledte ovarie-CSCs og er meget modtagelig for downstream-analyseteknikker. Mens ideel til at studere kræft i æggestokkene og CSCs, vores platform er også værdifuldt i at studere andre kræftformer og differentierede celletyper i komplekse 3D-miljøer.

Komplekse 3-dimensionelle (3D) modeller er afgørende for at studere tumor mikromiljø (TME), som er en 3D niche består af kræftceller, ikke-kræft støtte celler, og ekstracellulære matrix (ECM) proteiner⁴. Dette 3D-miljø resulterer i unikke celle morfologi, celle celle-og cellematrix interaktioner, Celledifferentiering, celle migration, celletæthed og diffusions gradienter sammenlignet med traditionel 2D-cellekultur in vitro⁴. Alle disse faktorer kulminerede i differentiallægemiddel respons inden for 3D-kulturer, udviser øget resistens over for lægemidler og fysiologisk relevans^7,8. På grund af den rolle 3D TME i CSC differentiering og chemoresistance, er det vigtigt at screene for CSC målretning narkotika i fysiologisk mikromiljøer. Forbedring af den fysiologiske relevans af CSC Drug screening platforme har potentiale til at forbedre patientspecifikke Drug screening, narkotika udvikling, formulering af behandlingsstrategier, og i sidste ende kliniske resultater. Det er lige så vigtigt, at platformen anvendes til Drug screening være høj gennemløb og kompatibel med downstream analysemetoder til at minimere omkostninger, tid og klinisk oversættelse tid af lovende narkotika⁹.

I øjeblikket, den komplekse TME er bedst vedligeholdt for Drug screening applikationer gennem in vivo modeller såsom murine og tumormodeller, celle line-afledte xenografts, og patient-afledte xenograft (PDX) modeller¹², da de giver fysiologisk Betingelser. Men den lave-gennemløb karakter af disse modeller, samt, de omkostninger, tid, og tekniske færdigheder, som de kræver begrænser deres nytte i hurtige, høj gennemløb Drug screening applikationer¹³. Som alternativer til disse in vivo modeller, mange in vitro 3D-modeller udnytter silicagelrogeler⁸, kultur inden for mikrofluidisk enheder eller ' orgel-on-a-chip ' enheder^10,14, og ikke-tilhængere kulturer^3,8 er også blevet udviklet på grund af deres lave adgangsbarriere i form af omkostninger, tid og krævede skillset.

Hydrogel kultur platforme er fordelagtige i den fine kontrol, der ydes over matrix sammensætning, mekaniske egenskaber, og matrixstruktur¹⁵; Men, de kan hæmme høj densitet cellekultur¹⁴. Desuden, høst celler fra silicagelrogeler kan komplicere downstream analyse, på grund af potentielt skadelige virkninger af høstmetoder¹⁵. Microfluidic-enheder er på den anden side mikroskala anordninger, der giver mulighed for output detektering inden for samme enhed og for cellekultur på fysiologisk relevante skalaer med minimal indtagelse af reagenser, nedsat reaktionstid, minimeret spild og hurtig diffusion¹⁴. Disse egenskaber gør dem lovende platforme for at undersøge lægemiddeltoksicitet, virkning og farmakokinetik. Men udfordringerne ved effektiv, kvantificerbar, reproducerbare og brugervenlig 3D-cellekultur samt, voluminøse og dyre pumpesystemer har begrænsede mikrofluidiske applikationer i forskning med høj gennemløb¹⁰. Effektive detekterings opsætninger og potentielt vanskelige gennemførelse på tværs af felter har også forhindret udbredt anvendelse af mikrofluidisk-systemer¹⁰.

I modsat, sfæroider genereret i ikke-vedhængende forhold i roterende blandere (nutatorer), ultra-lav vedhæftnings plader og hængende dråber omfatter ikke brugerdefinerede matrixkomponenter. Disse metoder er især relevante for studiet af kræft i æggestokkene, da de ikke-overliggende betingelser er repræsentative for de tilstande, hvor sfæroider vokser inden for bughulen⁵. Inden for disse ikke-vedhængende dyrkningsmetoder har nutator og hængende dråbe sfæroider vist sig at udvise højere komprimering, remodeling og chemoresistance sammenlignet med sfæroider genereret i ultra-lave fastgørelses plader, hvilket tyder på øget fysiologisk relevans^16,17,18,19. På grund af øget kapacitet til høj gennemløbs screening fra mindre brønd størrelser og minimale påkrævede cellenumre er sfæroide-generering i hængende dråbe plader en ideel platform til lægemiddel screening. Her præsenterer vi en tunable 3D fysiologisk platform i 384-godt hængende dråbe plader, der er let at implementere og meget modtagelig for downstream analyse, hvilket gør det ideelt til høj gennemløb Drug screening af kræft i æggestokkene og æggestokkene CSCs.

Vores 3D fysiologisk platform giver alle fordelene ved 3D-kultur, herunder fysiologiske celle celle kontakter, diffusions gradienter, celle tætheder og naturligt producerede ECM-proteiner, som kan bidrage til realistiske lægemiddel responser^{16, 17,18,19}. Desuden, ved at generere disse sfæroider med patient-afledte CSCs, vi er i stand til at bestemme patientens specifikke respons på narkotika¹ med mange tekniske replikater samtidig, at overvinde heterogenitet, der kan findes inden patient tumor prøver²⁰. Desuden, 3D kultur har vist sig at øge vedligeholdelsen af CSC populationer^3,16 og dermed er repræsentativ for beriget CSC populationer i ascites⁷. Dette kombineret med let downstream analyse, herunder flow flowcytometri analyse af levedygtighed og CSC proportioner giver mulighed for optimal evaluering af CSC målretning Drug effekt. Endelig er denne fysiologiske platform kompatibel med billeddannelse på flere tidspunkter under eksperimentet, evaluering af celledød og-spredning, celle organisering og morfologi med immun histokemi, opløselig signalering med ELISA på konditioneret mellem, celle fænotyper med flow cytometri og genekspression efter PCR.

Protocol

Alle patientprøver indsamles i henhold til en godkendt IRB-protokol fra samtykkende patienter, hvis prøver afidentificeres efter tumor tumor reduktions og ascites-samlingen.

1. generering af Sfæroider fra små Cellenumre i 384-godt hængende dråbe plader

1. Placer den hængende dråbe plade i en sonicator fyldt med steril deioniseret (DI) vand og sonikere i 20 minutter.
2. Med en dykket hånd fjernes pladen fra sonicatoren og vaskes med rindende DI-vand.
3. Lad pladen sidde i et bad med 0,1% pluralistisk syre i 24 timer for at forhindre protein adsorptions og sfæroide-tilslutning til brøndene.
4. Fjern pladerne med en dykket hånd og skyl begge sider af pladen med rindende DI vand grundigt.
5. Tryk kraftigt på eller Ryst pladen inde i et biosikkerheds kabinet for at fjerne vand fra brøndene i et sterilt miljø.
6. Anbring pladen under UV-lys i 30 – 60 minutter på hver side for at sterilisere pladerne og minimere kontaminering.
   Bemærk: Pladen kan også udsættes for ethylenoxid i et kammer til sterilisering.
7. Fyld hver brønd af en 6-brønd plade med 4 – 5 ml steril autoklaveres di vand og sandwich den hængende dråbe plade mellem låget og bunden af 6-brønd pladen. Tilsæt 800 – 1000 μL steril DI vand omkring kanten af den hængende dråbe plade for at give et fugtigt, stabilt og sterilt miljø for at minimere mængden tabt til fordampning (figur 1 a-C).
8. For 2D-dyrkede celler, aspirere medium dækker celler i deres log fase af vækst og vask med 1x fosfat bufferet saltvand (PBS) for at fjerne spor af føtal kvægserum (FBS) i vækstmediet, da det hæmmer virkningen af trypsin.
9. PBS og tilsæt 1,5-2 mL 0,25% trypsin-EDTA til 100 mm vævskultur skålen. Inkubér cellerne i 5 minutter i en inkubator, der er indstillet til 37 °C.
   Bemærk: Cellerne kan løsne sig ved forskellige satser, så pladerne skal kontrolleres på et stationære Light-mikroskop for at sikre, at cellen løsnes efter 5 min. Juster løsrivelse protokol pr. leverandør vejledning, når du bruger en cellelinje.
10. Der tilsættes 6 – 8 mL cellulært medium indeholdende FBS eller ethvert serum til skålen for at neutralisere trypsin, indsamle celler med et 10 mL serologisk pipet og deponere dem i et 15 mL konisk rør.
11. Tæl celler ved at indlæse 10 μL af cellesuspensionen på hver side af et hemocytometer og følg den tilhørende optællings protokol.
12. For patient-afledte celler indsamlet fra primære eller metastatiske massive tumorer eller fra ascites, der ikke har været 2D kulturperler, forberede enkelt celle suspensioner i serum frie medium (SFM) beskrevet tidligere³.
13. Proces tumor væv som tidligere beskrevet og gemme enkelt celle suspensioner til senere brug i passende frysning medium^21,22.
    1. For solidt tumor væv, hakkekød mekanisk med en barberkniv og filter resulterende løsning gennem et 40 μm filter før isolering ønskede celler fra en tæthed gradient^21,22.
    2. For ascites prøver, koncentrere cellerne ved centrifugering, lyserøde blodlegemer i ammonium-chlorid-kalium (ACK) buffer, vask i 1x PBS, og derefter passere gennem et 40 μm filter og en 28 G nål 4 gange²².
14. For isolering af æggestokkene CSCs, sortere celler med flow cytometri som beskrevet nedenfor i detaljer.
15. Frisk isolerede enkeltceller er frosset til opbevaring og optøet, når det er nødvendigt for eksperimenter.
16. For at forberede cellesuspensionen til plating, Beregn det ønskede volumen af celle opløsningen kræves til plating: 20 μL pr. dråbe X samlet antal dråber = samlet volumen af opløsningen nødvendig.
17. Fortyndet celle koncentration til den ønskede celle koncentration pr. 20 μL (dvs. 100 celler i et fald på 20 μL).
18. Bland cellesuspensionen forsigtigt ved hjælp af et pipet før forklædningen for at sikre homogen fordeling af celler og forbedre ensartetheden mellem dråberne.
    Bemærk: Over blanding af cellesuspensionen kan føre til celledød og snavs i de hængende dråbe sfæroider.
19. Spidsen af pipetten placeres i brønden i en vinkel på ca. 45 ° og pipet 20 μL af celle opløsningen i hver hængende dråbe brønd.
    Bemærk: Plating mønstre kan justeres afhængigt af antallet af sfæroider behov. Plating sfæroider i alle andre godt er sikrere, når store mængder af sfæroider ikke er nødvendige i et eksperiment, fordi det forhindrer utilsigtet sammenlægning af dråber (figur 1D, E). Hvis der er brug for store mængder sfæroider til et eksperiment, skal hver brønd efterlades med en række kant brønde på alle sider (figur 1f).
20. Placer låget på 6-brønd pladen tilbage på toppen af den hængende dråbe plade og brug en elastisk termoplastisk strimmel, der er ufølsom over for fugt tabet, for at forsegle kanterne og forhindre yderligere fordampning af dråber. Inkubér i en standard CO₂ -befuret rugemaskine (5% Co₂, 37 °c).
21. Foder hængende dråber en gang hver 2 – 3 dage til at genopbygge cellekulturmedium for nødvendige næringsstoffer ved at tilføje 2 – 3 μL til hver sfæoide indeholder godt.
    Bemærk: Efter billeddannelse anbefales det altid at fodre de hængende dråber, da luft eksponering under billeddannelse fører til fordampning.

2. tilføjelse cellekultur medium til hængende drop Spheroid plader

1. Fjern termoplastisk strimmel og låg i et biosikkerheds kabinet og tilsæt 2 – 3 μL af det relevante dyrkningsmedium til hver brønd, der indeholder en hængende dråbe.
   Bemærk: Den tilføjede mængde vil afhænge af Dråbestørrelse og mængden af tid mellem feedings.
2. Efter fodring, dække pladen med det øverste låg og anvende frisk termoplastisk strimmel til de udvendige kanter, før du sætter pladen tilbage i inkubator.

3. fasekontrast billeddannelse af Spheroid morfologi

1. Fjern den termoplastiske strimmel rundt om pladens kanter i et biosikkerheds kabinet.
2. Fjern forsigtigt 384-godt hængende drop sfæroider-pladen fra biosikkerhed-kabinettet, mens låget stadig er på plads, og Placer det i mikroskop bakken ved et epifluorescerende mikroskop.
3. Brug Live imaging option i Imaging software på 4X, 10x eller 20x til at observere de hængende dråbe sfæroider og tage ønskede billeder.
4. Når du har gemt billederne, skal du tage pladen tilbage til biosikkerheds kabinettet og foder cellerne som beskrevet ovenfor.
5. Forsegl pladen med en ny termoplastisk strimmel, og anbring den lukkede plade tilbage i inkubatoren.

4. kvantificering af spredning og levedygtighed inden for Sfæroider

1. Plade sfæroider i et tilstrækkeligt antal brønde for at opnå > 10 tekniske replikater for hvert tidspunkt (dvs. dag 1 og dag 7), der skal undersøges.
   Bemærk: Brønde, der anvendes til denne analyse er generelt ikke anvendes igen på grund af potentielle forurenende stoffer fra resazurin farvestof.
2. Der tilsættes 2 μL filtreret resazurin-baseret opløsning til brøndene, der er udpeget til sprednings analyse, som om fodring af disse brønde og inkubation i en forudbestemt inkubatperiode.
   Bemærk: Denne inkubationstid kan variere baseret på celletype og antallet af celler i spheroid. Det tilrådes at bestemme den nødvendige inkubations tid, der er nødvendig før påbegyndelse af sprednings eksperimenter ved at begynde målingerne efter 1 times inkubation og derefter re-måle hver 30 min. indtil signalet udlæsninger i kontrol brønde plateau. Analyse aflæsninger kan tages så mange gange som ønsket. Inkubation er typisk 4 timer for sfæroider initieret med 100 cancerceller.
3. Tænd mikropladens læser først efterfulgt af den tilhørende plade læser software mindst 15 min før første behandling for at give maskinen mulighed for at varme op og sikre den indvendige temperatur ved 22 °C, da temperaturen kan påvirke målingerne.
4. Åbn en 384-brønd plade protokol sæt med 530/25 Nm excitation og 590/35 nm emission bølgelængder med optik sat til bunden, Gain sat til 35, læsehastighed indstillet til normal, og læse type indstillet til fluorescens .
5. Efter inkubationstiden skal du åbne den hængende dråbe sandwich i et biosikkerheds kabinet og bringe 384-brønd pladen med låget stadig på plads til plade læseren.
6. Placer 384-brønd pladen med låget stadig på plads i plade læser bakken, som vil blive forlænget, når maskinen er varmet op, og klik på OK for at læse pladen.
7. Returner brønd pladen til 6-brønden og Placer den i inkubator. Hvis alle tidspunkter er blevet læst for dagen, Forsegl pladen igen, før den placeres tilbage i inkubator.
8. Gem eksperimentet i pop op-vinduet, og klik derefter på Ja , når du bliver spurgt vil du udføre powereksport til plade 1 for at udlæse data fra plade læseren software til et regneark for organisation.
9. Gennemsnitlige fluorescens værdier for hver betingelse og normalisere med gennemsnittet af kontrol betingelsen til at rapportere fold ændring i spredning i forskellige eksperimentelle betingelser.
10. Ved sammenligning af dag 1 til dag 7, normalisere ved at dividere med dag 1 gennemsnitlig fluorescens for at opnå fold ændring i spredning over tid.
11. Beregn fejllinjer ved hjælp af standardfejl af middelværdien og bestem Statistisk signifikans mellem eksperimentelle grupper med en passende statistisk test, som elevens tosidede T-test.

5. vurdering af lægemiddeltoksicitet i Sfæroider

1. Drug Administration
   1. På ethvert tidspunkt efter sfæide dannelse, levere lægemiddel fortyndet til den ønskede koncentration, således at en 2 μL dosis indeholder 10x den ønskede endelige lægemiddelkoncentration.
      Bemærk: Dette er under forudsætning af en fordampning af 2 μL fra dråbe, således at den sidste volumen post Drug behandling er 20 μL. For eksempel vil en 50 μM dosis Cisplatin have en klar opløsning på 500 μM. Hvis dråberne indeholder mere end 20 μL, skal koncentrationen af lægemidlet og/eller den tilføjede mængde justeres i overensstemmelse hermed.
   2. Behandl kontrolprøver med 2 μL cellekulturmedium.
      Bemærk: Cisplatin er solubilized i vand. Derfor er kontrollerne 2 μL cellekulturmedium; men hvis lægemiddel køretøjet er et andet opløsningsmiddel (f. eks. DMSO), skal kontrollerne være cellekulturmedium med en lige koncentration af DMSO som anvendt i lægemiddelbehandlingen.
   3. Fortsæt med at overvåge lægemidlet behandlet og kontrol sfæroider i hele narkotika inkubationsperioden med fase mikroskopi at have en visuel registrering af effekten af narkotika toksicitet samt med resazurin farvestof som beskrevet ovenfor til at overvåge cellulære levedygtighed.
      Bemærk: Typisk, stofferne tilsættes efter 5 – 7 dage i hængende dråber og toksicitet målt efter 48 –-72 HS men dette kan varieres afhængigt af eksperimentet. Lægemidler kan tilsættes, så snart stabile sfæroider har dannet, normalt mellem 1 – 4 dage.
2. Kvantificering af lægemiddeltoksicitet ved celletælling
   1. Ved sluttidspunktet for narkotikabehandling, indsamle 10 sfæroider hver fra kontrol og Drug behandlede brønde ved hjælp af en 1.000 μL pipet og deponere hvert sæt af sfæroider i sin egen mikrocentrifuge tube.
   2. Nedbryde sfæroider i enkeltceller ved gentagen pipettering.
      Bemærk: For at reducere potentiel celle skade på grund af gentagen pipettering kan enzymatisk fordøjelse med et enzym som trypsin udføres for at lette generering af enkelt celle opløsninger før pipettering²³. Minimering af celledød på grund af pipettering vil afhænge af celle typen og bør optimeres i overensstemmelse hermed. Hvis bekymret for død på grund af Disaggregering, henvises til analyse med resazurin farvestof og cytotoksicitet assay for alternative metoder, der ikke kræver sfæroide disaggregation.
   3. Rørene centrifugeres i 5 min ved 400 x g for at indsamle celler i bunden af mikrocentrifuge rørene og aspirere supernatanten.
   4. Tilsæt 20 μL friske medier eller 1x PBS til hvert rør og bland godt.
   5. Tilsæt Trypan Blue i forholdet 2 μL Trypan blå plet til 20 μL cellesuspension.
   6. Indlæs 10 μL celler og Trypan blå suspension i hvert kammer i hemocytometer og Tæl celler under et let mikroskop, med blå farvede celler, der repræsenterer døde celler og ufarvede celler, der repræsenterer levende celler.
      1. Den levende celle% = (antallet af levende celler ÷ det samlede antal celler) x 100.

6. spheroid karakterisering med histologiske teknikker

Bemærk: Der er to skimmel muligheder 3D trykt i en biokompatibel polymer til at replikere sfæroide array forme lavet af Ivanov et al.²⁴: 1) 20 brønd skimmel, der kan holde 28 μl per brønd og 2) 63 brønd skimmel, der kan holde 9 μl per brønd (figur 2D).

1. Steriliser histologi skimmel og dens grænse ved at tørre dem ned med 70% ethanol og fastgør kanten fast omkring formen og læg formen opretstående. Begge forme passer til ca. 3 ml væske (3,203 ml til 20 sfæroide array og 3,196 ml til 63 sfæroide array).
2. Let coat sfæroide array med 10.000 CST si olie ved hjælp af en spids vatpind for at lette fjernelse af prøven behandling gel støbt i efterfølgende trin.
3. Varm op præparat behandling gel indtil flydende via mikrobølge til 10 – 20 s med hætten løsnet.
4. Tilsæt mellem 2,6 og 2,8 mL smeltet behandling gel i formen indtil omtrent niveau med toppen af grænsen.
5. I et par minutter, en gang solidified, fjerne behandling gel støbt ved at adskille grænsen fra formen og derefter invertere array skimmelsvamp.
6. Indsæt pincet spidsen mellem mug og kanten for at adskille dem omhyggeligt og derefter bruge en celle skraber til at fjerne støbt fra formen, hvis den ikke løsnes med det samme.
7. Høst sfæroider fra den hængende dråbe plade ved at pipettere indholdet af en enkelt brønd på en 100 eller 150 mm celle petriskål med en 1.000 μl pipet, og Isoler sfæroide visuelt.
8. Pipet 5 μl af brønd indholdet, herunder den identificerede sfæroide i en af array brøndene, indtil arrayet er fyldt.
9. Vent 3 min for at sikre sfæroider har afgjort til bunden af arrayet, før forsigtigt pipettering smeltet behandling gel i hver af brøndene er omhyggelig med ikke at forstyrre sfæroider.
10. Tilføj yderligere behandling gel til niveau fra toppen af arrayet og når afkølet, Placer det solidificerede sfæooide array i en mærket kassette til forarbejdning.
11. Nedsænk mærket kassette i 4% formalin natten over for at reparere sfæroider ved 4 °C, og opbevar derefter i 70% ethanol ved 4 °C, indtil den er klar til behandling.
12. Proces med standard 1 h paraffin program og derefter indlejre sfæroide arrays sådan, at de behandlede arrays står oprejst med bunden af brøndene tættest på blokken ansigt.
13. Sørg for, at matricer er indlejret så fladt som muligt, med den nederste flade flush med bunden af blokken og placere blokke på isen.
14. Læg blokken på mikrotomen, og Juster blokken således, at klingen er parallel med den belastede blok ansigt.
15. Cut array (prøve dybde = 15 μm) indtil bunden af array brønde er nået at sikre, at de cirkulære brønde er synlige på cut prøver.
16. Skift til en 5 μm prøve dybde, og Fortsæt med at skære og samlebånd. Kontroller under mikroskopet hvert par skiver for at afgøre, om sfæroide dybde er nået. Når sfæroider er nået indsamle hver efterfølgende dias, indtil sfæroider ikke længere er synlige.
17. Plette hver slide med standard H & E protokol.

7. analyse af levende døde cytotoksicitet

1. Til hver hængende dråbe, tilsæt levende cellefarve stof, calcein-AM til den endelige koncentration af 2 μM, og den døde cellefarve stof, ethidium homodimer-1 til den endelige koncentration af 4 μM, holde for øje, at dråbe volumen er 20 μL.
   Bemærk: Prøv at holde volumener føjet til et minimum, og tilsæt typisk 2 μL af farvestofferne tilsammen.
2. Placer pladerne tilbage i inkubator klemt i en 6-brønd plade med låg og Inkuber sfæroider i 45 min ved 37 °c.
   Bemærk: Afhængigt af størrelsen af sfæroider varierer denne inkubationstid markant. For eksempel kræver sfæroider under 400 μm typisk kun 30 – 45 min inkubationstid, hvorimod større sfæroider tættere på 800 μm har krævet op til 90 min inkubationstid. Inkubationstiderne skal optimeres for en persons eksperiment.
3. Til efterfølgende billeddannelse høstes sfæroider med et 1.000 μL pipet i et biosikkerheds kabinet og deponerer hver sfædior på forrengjorte glasmikroskop slides.
4. Billed sfæroider gennem glasset, på et inverteret Konfokal mikroskop.
   Bemærk: Afhængigt af nærheden af det konfokale mikroskop til laboratoriet, hvor sfæroider høstes, kan sfæroider enten være indhyllet i den oprindelige dråbe af medium placeret på diaset eller indkapslet i 2% agopstået, hvis mere stabilitet er nødvendig for sfæide transport.
5. Ved hjælp af den flerdimensionelle anskaffelses tilstand i mikroskop softwaren skal du finde sfæroide ved hjælp af DIC-belysning ved 10x forstørrelse og derefter scanne z-planet for at identificere højder, som omfatter sfæroide.
6. Klik på z-serien og Indstil den øvre og nedre grænse for z-scanningen lidt højere end toppen af sfæroide og lidt lavere end bunden af sfæroide.
7. Begejstre sfæroider ved 488 nm for calcein-AM (levende celler; grøn) og 561 nm for ethidium homodimer-1 (døde celler; rød) med den trin størrelse, som anbefales af softwaren, maksimal gevinst og minimal eksponering for hver farve.
8. Klik på Hent for at få et sammensat z-stack-billede af levende og døde celler i spheroid.
9. Kvantificere levende/døde proportioner ved hjælp af billedbehandling software til at kvantificere en procentdel af pixel intensitet fra kanalen svarer til levende celler versus procentdelen af pixel intensitet fra kanalen svarende til døde celler fra komposit z-projektion billeder.
   Bemærk: På grund af begrænsningerne i kvantificering af en 3D struktur med en 2D projektion, en alternativ metode til at kvantificere levende versus døde fluorescens, inden for de hængende dråbe plader er at bruge en plade læser efter den protokol, der følger med calcein-AM og ethidium homodimer-1 sæt.

8. immunofluorescens

1. Opvarm en lav smeltning 2% agopstået opløsning, så opløsningen er viskøs og lige over smeltepunkt og sted på et mikroskop slide for at skabe en blød seng af agopstået
2. Høst sfæroider ved at skubbe 20 μL PBS gennem faldet på den bløde seng på 2% agopstået.
   Bemærk: Dette bør ske hurtigt, så agopstået ikke størkner, før sfæroider er indlejret.
3. Når agopstod køler og geler med høstet sfæoid fanget inden for (under 5 min), tilsættes 4% neutral Buffered formalin at fastsætte sfæroerne. Alternativt tilsættes iskold methanol, og fastgør de agopstået-indlejrede sfæroider ved-20 °C i 30 min.
4. Vask 3x for 5 min hver med 1x PBS, kassere PBS efter hver vask.
5. Blok til 1 time ved RT med 10% serum (dvs. heste serum) og 0,15% sæbeopløsning (Triton X-100) i 1x PBS.
6. Vask 3x for 5 min hver med 1x PBS, kassere PBS efter hver vask.
7. Plette sfæroider med ønsket fluorescerende antistof ved anbefalet eller på forhånd fastlagt antistof fortynding (dvs. fluecentlig mærket phalloidin ved en 1:100 fortynding), inkuberet i mindst 90 min ved stuetemperatur, dækket af lys.
   Bemærk: Protokoller vil variere afhængigt af antistof og mål og antistof fortynding kan være nødvendigt at optimeres afhængigt af eksperimentet.
8. Visualisere fluorescently farvede sfæroider med inverteret confokal mikroskop ved hjælp af metoder, som er skitseret i det foregående afsnit for billedbehandlings sfæroider.
9. Komposit z-stack billeder vil demonstrere 3D morfologi i sfæroider.

9. indsamling og analyse af Cancer stamcellepopulationer med flow cytometri

1. Klargøring af sfæroider til analyse af strømnings cytometri
   1. Saml sfæroider fra hver brønd i de hængende drop plader ved hjælp af et 1.000 μl pipet og deponere dem i et 15 ml centrifugeglas til opdeling med gentagen pipettering.
   2. Tæl levedygtige celler på en hemocytometer ved hjælp af Trypan blå at bestemme celle nummer og koncentration som skitseret ovenfor.
   3. En aliquot cellesuspension i fem mikrocentrifuge glas, således at hver indeholder mindst 50.000 celler.
   4. Alle rør centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter i en mikrocentrifuge.
   5. Aspirér supernatanten fra hvert rør og resuspender pellets i 100 μL buffer.
   6. Etiket rørene "Unstained", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB" og "ALDH/CD133" hhv.
   7. Tilsæt 0,5 μL APC-isotype-antistof til APC-ISO-røret og 1 μL CD133 antistof til ALDH/CD133 tube som bestemt af seriel fortynding og fabrikantens anbefaling.
   8. Tilsæt 5 μL DEAB-reagens og 0,5 μL ALDH til DEAB-røret og 1 μL ALDH til ALDH/CD133-røret.
   9. Vortex alle rør i ca. 2 s og inkuberes ved 37 °C i 45 min.
   10. Vortex alle rør igen og centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter i en mikrocentrifuge.
   11. Label FACS rør "uplettet", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB", og "ALDH/CD133" og fylde en isoleret skum beholder til at afsætte.
   12. Aspirér supernatanten og resuspender den "ufarvede" kontrol i 400 μL FACS buffer (1x PBS med 2% FBS) og alle andre rør i 400 μL FACS DAPI buffer (FACS buffer med 300 μM 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol).
   13. Placer rørene i beholderen med is, indtil de analyseres på et flow cytometer.
       Bemærk: At sortere for kræft i æggestokkene, indsamle alle celler, at flowcytometer foranstaltninger til at være ALDH + og CD133 + med Gates indstillet til at omfatte 0,5% ikke-specifikke APC signal og 0,15% ikke-specifikke ALDH + signal. Mindst 10.000 celler skal analyseres for pålidelige resultater. Yderligere oplysninger findes i de seneste publikationer^3,17.
2. Analyse af ALDH +/CD133 + populationer i FlowJo
   1. Dobbeltklik på flowjo ikonet for at åbne programmet og trække. FCS filer hentet fra flow flowcytometri software ind i arbejdsområdet.
   2. Dobbeltklik på den ufarvede fil og Indstil y-aksen til side scatter højde (SSC-h) og x-aksen til at fremrykke scatter højde (FSC-h).
   3. Klik på knappen T ved siden af hver akse for at justere skalaen og transformationen for at maksimere adskillelsen mellem forskellige cellepopulationer.
   4. Klik på polygon -gating-knappen og tegn en polygon port omkring celle populationen og mærk befolkningens ' celler '.
   5. Dobbeltklik på celle populationen i arbejdsområdet for kun at få vist cellerne i "cellernes" population, og klik derefter på FSC-aksen for at ændre akse kanalen til FSC-bredde og derefter klikke på den SSC akse og ændre akse kanalen til FSC-H.
   6. Vælg rektangel Gate værktøj og tegne et rektangel omkring venstre-mest tætte population af celler, der spænder over hele y-aksen for at udelukke potentielle form mod højre for vinduet og mærke denne port ' enkeltceller '.
   7. Højreklik og kopier cellerne og de indlejrede enkeltceller Gate og Indsæt dem under hver prøve i arbejdsområdet.
   8. Dobbeltklik på den enkelt celle port, der er indlejret under DAPI-eksemplet i arbejdsområdet for at få vist populationen af enkelt celler fra det pågældende prøverør, og klik på FSC-aksen, og Skift akse kanalen til dapi-område kanalen.
   9. Klik på SSC-aksen, og Skift akse kanalen til histogram.
      Bemærk: de levende celler vil være mod venstre, da de udelukker DAPI, mens døde celler vil tage i DAPI og vises mod højre for grafen.
   10. Klik på T -knappen ved siden af dapi -aksen, og klik på Tilpas akse for at justere skalaen for at maksimere adskillelsen mellem dapi positive og dapi negative toppe.
       Bemærk: Et vindue vil dukke op med skaleringsindstillinger. Ofte gange, at sætte skalaen felt til biex og justere de ekstra negative årtier og bredde grundlag vil give den største adskillelse.
   11. Klik på Anvend i pop op-vinduet for at anvende skaleringsændringer, Vælg Range Gate-knappen, og Spred den over dapi-negative peak, svarende til den levende cellepopulation.
   12. Label denne port ' Live cells ' og højreklik for at kopiere ' Live cells ' porten for at indsætte den under ' single cells ' porten under ' APC-ISO, ' DEAB ' og ' ALDH/CD133 ' rør for at vælge den samme del af levende celler i hver prøve tube.
   13. Dobbeltklik derefter på den levende celle population, som er INDLEJRET under APC-ISO-eksempelfilen, og Skift x-AKSEN til Aldh – område kanalen og y-AKSEN til APC – område kanalen.
   14. Du kan også justere akseskalaen ved at klikke på knappen T og tilpasse aksen for hver akse, så hændelserne er lokaliseret i det nederste venstre område af plottet, og vælge indstillingen quad Gate og klikke på plot vinduet for at oprette en kvadrant port .
   15. Juster skæringspunktet for gaten således, at ca. 0,5% af befolkningen ligger i øverste venstre del af plot vinduet eller ' APC positive ' kvadrant.
       Bemærk: Denne 0,5% repræsenterer den ikke-specifikke farvning af APC isotype.
   16. Højreklik på hver kvadrant etiket enkeltvis i arbejdsområdet og omdøbe dem korrekt. Kontrol eller Kommando klik på hver kvadrant Gate label i arbejdsområdet og kopiere dem.
       Bemærk: ' Q1 ' repræsenterer CD133 + celler. ' Q2 ' repræsenterer CD133 + og ALDH + '-celler. » Q3 «repræsenterer ALDH +-celler. og ' Q4 ' repræsenterer CD133-og ALDH-celler.
   17. Indsæt kvadrant portene på levende celler befolkning indlejret under ' deab ' fil. Juster den lodrette linje således, at ca. 0,15% af celle populationen ligger inden for» ALDH + «-kvadranten, idet man skal passe på ikke at flytte den vandrette linje.
       Bemærk: Denne 0,15% repræsenterer et ikke-specifikt ALDH-signal.
       1. For at sikre, at den vandrette linje ikke ændrer position, skal du kopiere de nye kvadrant Gates indlejret under Deab -filen og indsætte dem på Live-cellerne under APC ISO-filen. Vælg Ja , når du bliver bedt om at udskifte den eksisterende kvadrant port.
       2. Bekræft i arbejdsområdet, at ' CD133 + '-procenten stadig er ca. 0,5 under ' APC-ISO '-filen.
   18. Kopier og Indsæt kvadrant portene til ' ALDH/CD133 ' filens ' levende celler ' befolkning.
       Bemærk: Procentdelen af den levedygtige cellepopulation i øverste højre kvadrant vil være procentdelen af ALDH + og CD133 + dobbelte positive CSCs i prøven.

Representative Results

Sfæroider dannet med cellelinjer eller patient afledte CSCs kan dannes med en række små cellenumre inden for hængende dråber (figur 2a). Sfæroider dannes pålideligt med så få som 10 celler pr. brønd, hvilket gør det muligt at bevare sjældne patientprøver. Celler inden for disse sfæroider er omgivet af andre celler i 3 dimensioner, som de ville være in vivo, giver mulighed for fysiologisk celle celle kontakter og diffusion satser. Tumor celler i sfæroider prolifererer forårsager sfæroider at ekspandere i størrelse over tid (figur 2b). Da mere aggressive patient celler eller cellelinjer vokser hurtigere end deres modparter, er det vigtigt at kvantificere sprednings kapaciteten for hver prøve og undersøge, hvordan lægemiddelbehandlingen påvirker spredningen af hver prøve. For at gøre dette, en metabolisk aktivitet analyse, såsom en resazurin baseret fluorescens analyse, kan let udføres med 384-Well fysiologisk platform, uden nogen krav til høst sfæroider, hvis resultater kan ses i figur 2c. Flere sfæroider kan også høstes, fast, sektioneret, og farves med hematoxylinlegemer og eosin eller immunfluorescent antistoffer på samme tid til at identificere celle morfologier og organisation inden for sfæroider, samt, fordelingen af celletyper og ECM proteiner (figur 2D, E).

For at undersøge virkningen af stofbehandling på sfæroide morfologi, kan sfæroider let visualiseres ved fasekontrast Imaging (figur 3a). Mere kvantitativt kan virkningen af lægemiddelbehandling på tumor celle-eller CSC-proliferation også måles ved resazurin Dye fluorescens aflæsninger i kontrol ubehandlet sfæroider sammenlignet med de lægemiddel behandlede sfæroider (figur 3b). Som en validering af celledød efter narkotikabehandling, kan levedygtighed inden for kontrol og narkotika behandlede sfæroider let bestemmes via tilsætning af calcein-AM og ethidium homodimer-1 til flere sfæroider for hver betingelse (figur 3c). Efter inkubationstiden kan farves sfæroider høstes med en pipette og afbildet på et Konfokal mikroskop.

Endelig, ved høst sfæroider og sprede dem i enkelt celle suspensioner, kan tilstedeværelsen af CSCS og andre celler fænotype markører analyseres med flow flowcytometri (figur 4). Sammenligning af levedygtige CSCs mellem forskellige lægemidler behandlinger inden for samme patient, samt, mellem patienter kan bidrage til at skelne effektiviteten af forskellige CSC målretning narkotika på en patientspecifik måde.

Figur 1:3D høj gennemløb 384 hængende drop sfæroide plade opbevaring og plating layouts. (A) hængende dråbe plade er placeret på bunden af en 6 brønd plade delvist fyldt med vand. (B) låg på 6 brønd plade er placeret på toppen af hængende dråbe pladen for at skabe sterile hydrerings kammer. (C) 6-brønd plade stak, der skal forsegles med en termoplastisk strimmel for beskyttelse mod fugt tab og forurenende stoffer. D) skiftende belægnings mønster til ophængning af dråbe pladen. Pink firkanter indikerer brønde fyldt med celler og medium blanding. Blå områder indikerer vand kamre til hydrering. Grå bokse indikerer blanke brønde, der fungerer som en grænse mellem hydrerings kamre og sfæoiddråber. (E) levende billede af hængende dråbe plade belagt med alternerende brønd mønster. (F) alle godt plating mønster layout udnyttes til høj gennemløb hængende dråbe sfæroider eksperimenter. Pink firkanter indikerer celle belagte brønde og blå områder indikerer vandfyldte kamre for øget hydrering. Grå firkanter angiver kant brønde, der fungerer som grænse mellem hydrering sektioner og cellekultur områder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: patient afledte CSC sfæroider morfologi og spredning inden for 3D hængende dråber. (A) Live billede af forberedt 384-hængende dråbe sfæide plade som set fra bunden. (B) progressivt lys mikroskop billeder af patient afledt CSC sfæroide-vækst efter 2, 3 og 5 dage i en hængende dråbe. Skala stænger = 100 μm.C) reazurin fluorescens intensitet viser signifikant stigning efter 7 dages hængende drop kultur, korrelation til proliferation og vækst af de hængende drop patient afledte CSC sfæroider (ikke-parret to tailed t-test, p < 0,0001, n > 10). (D) billede af sfæroide array skimmel, der anvendes til at oprette en støbt til samling af sfæroider til histologi skæring. E) H & E billede af en sfæriske kultiveret med primære kræftceller i æggestokkene, mesenchymale stamceller, endotelceller og mononukleære celler fra donor blodet indsamlet i det sfæriske array. Skræmme bar = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: lægemiddelbehandling analyse af patient afledte CSC sfæroider hængende dråber. A) patient afledte CSC-sfæroider seedet ved 50 celler/fald behandlet med stigende koncentrationer af paclitaxel efter 5 dages vækst. Repræsentative billeder taget 48 h efter stofbehandling. B) kvantificering af cellulær levedygtighed via resazurin-fluorescens ved stigende koncentrationer af paclitaxel-behandling. Alle prøver har en signifikant reduktion i levedygtighed i forhold til kontrol. (One-Way ANOVA, p < 0.0001, n > 8). (C) Konfokal billeddannelse af levende (calcein-am) og døde (ethidium homodimer-1) celler inden for hængende drop spheroid. Grøn farve indikerer levende celler og rød farve indikerer døde cellepopulation. Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: kvantificering af CSCs i patient afledte CSC-sfæroider genereret og vedligeholdt på den 384-hængende dråbe platform. (A) ved analyse af strømnings cytometri-data vælges celle populationen først ved hjælp af en polygon port for at eliminere eventuelle hændelser, der kan henføres til snavs. (B) de enkelte celler udvælges derefter for at eliminere potentielle tvivletsignaler, som kan sløre resultaterne. (C) alle de enkelte levende celler vælges derefter baseret på dapi-udelukkelse. D) den lodrette akse i en kvadrant port justeres i deab-kontrollen for at give mulighed for ca. 0,15% ikke-specifik aldh-farvning. (E) den horisontale akse i kvadrant porten justeres i APC ISO-kontrol for at give mulighed for ca. 0,5% ikke-specifik APC-farvning. (F) kvadrant porten bruges derefter til at bestemme procentdelen af CD133 +, aldh +, og CD133 +/aldh + celler er til stede i levende celle populationen i den eksperimentelle CD133 plus aldh tilstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

384-godt hængende drop Plate platform til 3D sfæroide formation er et let implementeret værktøj til enhver cellebiologi eller cancerbiologi Labs. Denne fysiologiske platform muliggør studiet af cellelinjer, samt, primære patientprøver inden for fysiologisk relevante 3D-kulturer samtidig giver mulighed for høj gennemstrømning Drug screening. Platformen sikrer også, at kultur forholdene er meget tunbare, hvilket muliggør stram kontrol over plating tætheder, celle Co-kultur nøgletal, ekstracellulære komponenter og medium sammensætning. Desuden gør denne fysiologisk platform det muligt for eksperimenter at være meget modtagelig for downstream analyseteknikker, der kræver store eller små celletal såsom qRT-PCR, FACS, og forskellige billeddannelses metoder. Mens brugervenligheden kommer med erfaring, bliver nye praktikanter succesfulde hurtigt, når hastigheden og nem pipettering styres. Således er denne fysiologisk platform meget anvendelig til personlig 3D Drug screening, CSC biologi og chemoresistance undersøgelser.

Nogle punkter af bekymring, når den nye gennemførelse af denne platform omfatter plade overførsel og narkotikabehandling. Ved overførsel af plader fra et sted til et andet som krævet til rutinemæssig fodring, billeddannelse og analyse skal der træffes omhyggelige forholdsregler for at undgå unødvendig jostling. Tag fat i pladerne fra de yderste kanter og hold dem så højt som muligt, og pas på, at du undgår at skalle bevægelser, når du placerer pladen. Dette hjælper med at undgå dråbe tab eller sammenlægning af tilstødende dråber. På samme måde bør man være opmærksom på opgaven med at behandle hængende dråbe sfæroider for at undgå ukorrekt dosering af en hængende dråbe sfæide. Som med enhver teknik, tillid og nøjagtighed med disse opgaver ankommer med praksis.

Et par begrænsninger er medfødte til denne 3D fysiologisk platform. For det første kan dråbe ustabilitet være af problem på lang sigt kultur tidspunkter, hvis der ikke er taget pleje for at opretholde korrekte samlede dråbe volumen. Desuden skal transport og oplagring af plader, som nævnt ovenfor, gøres omhyggeligt for at undgå tab eller sammenlægning af dråber. Desuden er størrelsen for dette 3D-miljø dikteret af medfødte stabile Dråbestørrelse på 20 μL, selvom mange replikater kan produceres for forbedrede celletal.

Ændringer til denne 3D fysiologisk platform kan udnyttes til at øge gennemløb og ændre fysiologiske egenskaber. For eksempel kan dråbe layout ændres til at omfatte alle godt inden for 384 brønd pladen for at øge gennemløb. Derudover 3D hængende drop platform er meget befordrende for Co-kultur undersøgelser ved simpel inddragelse af flere celletyper i hver brønd. At generere og vedligeholde sfæroider med succes, cellekulturmedium og indledende celle såning tæthed kan let moduleret, til stramt regulere sfæroide størrelse. Med disse meget tunable variabler utallige undersøgelser er mulige inden for realm af 3D fysiologiske patient afledte sfæroider.

Mens de fleste analysemetoder beskrevet er meget udbredt i videnskabelig forskning, der er et par begrænsninger specifikke for at analysere hængende drop genereret sfæroider med nogle af disse metoder. For eksempel, når sfæroider dyrkes i lange perioder i hængende dråbe plader, kan Dråbestørrelse øge betydeligt forårsager dråber at ryste under fasekontrast Imaging, potentielt kompromitterende billedkvalitet. Dette kan forbedre sig ved at tage en tilsvarende mængde medium ud af hver brønd, før du tilføjer frisk medium. Desuden kan teknikker som strømnings cytometri og optælling af individuelle levedygtige celler påvirkes af den teknik, der anvendes til at opdele sfæroider, som kan være skadelige for cellerne. Som sådan, det er vigtigt for hvert laboratorium til at optimere sfæide opdeling teknikker baseret på deres celler og eksperimentere for at minimere celleskader samtidig maksimere enkelt celletæthed. Endelig kan histologisk analyse af sfæroider kompliceres af deres lille størrelse og kræver praksis for at opnå vellykkede sektioner.

Samlet, 3D hængende drop sfæroide platform er bredt tilpasningsdygtige inden for kræft og ikke-kræftforskning. Systemet er let at lære og giver et 3D fysiologisk relevant miljø for cellekultur i et højt gennemløb format. Initierings tiden for denne 3D fysiologiske platform er minimal, med få, hvis nogen, teknisk analyse forhindringer at overvinde. Alsidigheden af dette system giver et middel til patientspecifik screening af effektive kemoterapeutika til præcisionsmedicin, i et mere fysiologisk miljø end nogensinde før.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 mL conical tube	Celltreat	FL4021
1x DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1x F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1x phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-