Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

Summary

Denne protokollen beskriver generering av pasient-avledet spheroids, og nedstrøms analyse inkludert kvantifisering av spredning, cytotoksisitet testing, flyt flowcytometri, immunofluorescence farging og konfokalmikroskopi bildebehandling, for å vurdere narkotika potensielle neoplastic legemidler. Denne protokollen støtter presisjons medisin med identifisering av spesifikke medikamenter for hver pasient og stadium av sykdom.

Abstract

I denne protokollen, vi skissere fremgangsmåten for generering av tumor spheroids innen 384-vel hengende dråper for å muliggjøre høy gjennomstrømming screening av anti-kreft legemiddel selskap i en fysiologisk representant mikromiljøet. Vi skisserer dannelsen av pasienten avledet kreft stilk cellen spheroids, samt manipulering av disse spheroids for grundige analyser etter behandling. Nærmere bestemt beskriver vi innsamling av spheroid morfologi, spredning, levedyktighet, legemiddel toksisitet, celle fenotype og celle lokaliseringsdata. Denne protokollen fokuserer tungt på analyse teknikker som er lett implementeres ved hjelp av 384-godt hengende slipp plattform, noe som gjør den ideell for høy gjennomstrømming narkotika screening. Mens vi understreke viktigheten av denne modellen i eggstokkene kreft studier og kreft stilk cellen forskning, er 384-brønn plattform mottagelig for forskning av andre krefttyper og sykdom modeller, utvide nytten av plattformen til mange felt. Ved å forbedre hastigheten på personlig narkotika screening og kvaliteten på screening resultater gjennom enkelt implementert fysiologisk representative 3D-kulturer, er denne plattformen spådd til hjelp i utviklingen av nye legemiddel-og pasientspesifikke behandlings strategier, og dermed ha vidtrekkende klinisk effekt.

Introduction

Verdensomspennende kreft-relatert dødelighet nådde en toll på 9 800 000 dødsfall i 2018¹, fremhever behovet for utvikling av forbedrede legemiddel selskap. Dessverre, er kostnaden for å utvikle kreft narkotika økende, med utviklingen av et enkelt stoff koster ca 650 000 000 USD² indikerer behovet for forbedrede strategier for å utvikle nye anti-kreft narkotika. Kreft stamceller (CSCs), som er preget av økt chemoresistance³, evne til å fornye seg selv, og evnen til å frø nye svulster⁴ antas å være ansvarlig for tumor gjentakelse⁴, metastasering⁵, og chemoresistance^4,6, som alle bidrar til ondartet kapasitet av svulsten og dermed høye dødstallene. I kreft i eggstokkene finnes disse cellene beriket i den ondartede ascites væsken i bukhulen, en tilstand knyttet til dårlige kliniske utfall¹. Som et resultat av den ondartede evnene til CSCs, har det vært et push å utvikle nye CSC målretting narkotika å bruke i forbindelse med tradisjonelle chemotherapies. Det er flere utfordringer som følger utviklingen av CSC målretting narkotika inkludert: 1) vanskeligheter med å utvide og vedlikeholde CSCs in vitro; 2) knapphet på pasientprøver; 3) fysiologisk relevans av kulturen plattformen; og 4) heterogenitet i legemiddel følsom het mellom pasientene. Denne protokollen skisserer implementeringen av en 3D kultur plattform med høy gjennomstrømming som kan overvinne hver av disse utfordringene. Spesielt gir dette systemet for rask narkotika screening ved hjelp av et lite antall pasient-avledet eggstokkene CSCs, og er svært mottagelig for nedstrøms analyse teknikker. Selv om det er ideelt for å studere kreft i eggstokkene og CSCs, er plattformen også verdifull når det gjelder å studere andre typer kreft og forskjellige celler i komplekse 3D-miljøer.

Komplekse 3-dimensjonale (3D) modeller er avgjørende i å studere tumor mikromiljøet (TME), som er en 3D nisje bestående av kreftceller, ikke-kreft støtte celler, og ekstracellulære matrise (ECM) proteiner⁴. Denne 3D-miljø resulterer i unike celle morfologi, celle-celle og celle-matrise interaksjoner, celle differensiering, celle migrasjon, celle tetthet, og diffusjon graderinger sammenlignet med tradisjonelle 2D cellekultur in vitro⁴. Alle disse faktorene kulminere i differensial narkotika respons i 3D-kulturer, viser økt resistens og fysiologiske relevans^7,8. På grunn av rollen til 3D TME i CSC differensiering og chemoresistance, er det viktig å skjermen for CSC målretting narkotika i fysiologiske microenvironments. Forbedre fysiologiske relevansen av CSC narkotika screening plattformer har potensial til å forbedre pasientens spesifikke narkotika screening, narkotika utvikling, formulering av behandlings strategier, og til slutt kliniske utfall. Det er like viktig at plattformen som brukes for narkotika screening være høy gjennomstrømming og kompatibel med nedstrøms analysemetoder for å minimere kostnader, tid og klinisk oversettelse tid lovende narkotika⁹.

Foreløpig er det komplekse TME best vedlikeholdt for narkotika screening applikasjoner gjennom in vivo modeller som murine syngeneic tumor modeller, cellelinje-avledet xenotransplantater, og pasient-avledet xenograft (PDX) modeller¹², som de gir fysiologiske Forhold. Men den lave gjennomstrømningen natur disse modellene, samt, kostnaden, tid og tekniske ferdigheter som de krever begrenser deres nytte i rask, høy gjennomstrømming narkotika screening programmer¹³. Som alternativ til disse in vivo-modellene har mange in vitro 3D-modeller som bruker hydrogeler⁸, kultur innen mikrovæskebasert enheter eller ' organ-on-a-chip '-enheter^10,14, og ikke-tilhenger kulturer^3,8 har også blitt utviklet, på grunn av deres lave barriere til oppføring i form av kostnader, tid og nødvendige skillset.

Hydrogel kultur plattformer er fordelaktig i fin kontroll by over matrisen sammensetning, mekaniske egenskaper, og matrise struktur¹⁵; men de kan hemme høy tetthet cellekultur¹⁴. I tillegg kan høsting celler fra hydrogeler komplisere nedstrøms analyse, på grunn av potensielt skadelige effekter av høsting metoder¹⁵. Mikrovæskebasert enheter, derimot, er Mikroskala enheter som tillater for utdata deteksjon innenfor samme enhet og for cellekultur på fysiologisk relevante skalaer med minimalt forbruk av reagenser, redusert reaksjonstid, minimert avfall, og rask diffusjon¹⁴. Disse egenskapene gjør dem lovende plattformer for å undersøke medikament toksisitet, effekt og farmakokinetikken. Utfordringene med effektiv, målbar, reproduserbar og brukervennlig 3D cellekultur, samt, store og kostbare pumpesystemer har begrenset mikrovæskebasert applikasjoner i høy gjennomstrømming forskning¹⁰. Effektiv deteksjon oppsett og potensielt vanskelig implementering på tvers av felt har også hindret utbredt adopsjon av mikrovæskebasert systemer¹⁰.

Contrarily, spheroids generert i ikke-tilhenger forhold i roterende miksere (nutators), ultra-lav festeplater, og hengende dråper inkluderer ikke brukerdefinerte matrise-komponenter. Disse metodene er spesielt relevant for å studere eggstokkene kreft som ikke-tilhenger forholdene er representative for forholdene der spheroids vokser i bukhulen⁵. Innenfor disse ikke-tilhenger kultur metoder, nutator og hengende drop spheroids har vist å vise høyere komprimering, remodeling, og chemoresistance sammenlignet med spheroids generert i Ultra-Low vedlegg plater, noe som tyder på økt fysiologiske relevans^16,17,18,19. På grunn av økt kapasitet for screening med høy gjennomstrømming fra mindre brønn størrelser og minimalt nødvendige celle tall, er spheroid generasjon i hengende dråpe plater en ideell plattform for narkotika screening. Her presenterer vi en tunable 3D fysiologiske plattform i 384-vel hengende drop plater, som er lett å implementere og svært mottagelig for nedstrøms analyse, noe som gjør den ideell for høy gjennomstrømning narkotika screening av eggstokkene kreft og eggstokkene CSCs.

Vår 3D fysiologiske-plattform gir alle fordelene med 3D-kultur, inkludert fysiologiske celle kontakter, diffusjon graderinger, celle tetthet og naturlig produserte ECM-proteiner, som kan bidra til realistiske narkotika responser^{16, 17,18,19}. I tillegg, ved å generere disse spheroids med pasient-avledet CSCs, er vi i stand til å bestemme pasientens konkrete tiltak mot narkotika¹ med mange tekniske replikerer samtidig, for å overvinne heterogenitet som kan finnes i pasientens svulst prøvene²⁰. Videre har 3D-kultur vist å øke vedlikeholdet av CSC populasjoner^3,16 og dermed er representativt for beriket CSC populasjoner i ascites⁷. Dette kombinert med enkel nedstrøms analyse, inkludert flyt flowcytometri analyse av levedyktighet og CSC proporsjoner gir optimal evaluering av CSC målretting narkotika effekt. Til slutt, denne fysiologiske plattform er forenlig med tenkelig for mangfoldig tid meningene under eksperiment, bedømmelse av cellen død og spredning, cellen organisasjon og morfologi med immunhistokjemi, løselig signal med ELISA opp på betinget medium, celle fenotyper med Flow flowcytometri, og genuttrykk etter PCR.

Protocol

Alle pasientprøver er samlet under en godkjent IRB protokoll fra samtykkende pasienter, hvis prøvene er de-identifisert etter tumor "debulking" og ascites samling.

1. generering av Spheroids fra små celle tall i 384-brønn hengende drop plater

1. Plasser den hengende dråpe platen i en sonicator fylt med sterilt deionisert (DI) vann og sonikere i 20 min.
2. Med en hansker hånd fjerner du platen fra sonicator og vasker den med rennende DI vann.
3. La platen til å sitte i et bad med 0,1% Pluronic syre for 24 h for å forebygge protein absorpsjon og spheroid tilslutning til brønnene.
4. Fjern platene med en hansker hånd og skyll begge sider av platen med rennende DI vann grundig.
5. Trykk eller rist platen kraftig i et biosafety kabinett for å fjerne vann fra brønnene i et sterilt miljø.
6. Plasser platen under UV-lys i 30 – 60 min på hver side for å sterilisere platene og minimere forurensning.
   Merk: Platen kan også utsettes for etylen oksid gass i et kammer for sterilisering.
7. Fyll hver brønn av en 6-brønn plate med 4-5 mL sterilt autoklaveres DI vann og sandwich den hengende dråpe platen mellom lokket og bunnen av 6-brønn plate. Tilsett 800 – 1000 μL av sterilt DI vann rundt kanten av den hengende dråpe platen for å gi et fuktig, stabilt og sterilt miljø for å redusere volumet som går tapt til fordampning (figur 1 a-C).
8. For 2D vokst celler, aspirer medium dekker celler i sin Logg fase av vekst og vask med 1x fosfat bufret saltvann (PBS) for å fjerne spor av fosterets storfe serum (FBS) i vekstmedium, som det hemmer virkningen av Trypsin.
9. Aspirer PBS og tilsett 1,5-2 mL 0,25% Trypsin-EDTA til 100 mm vev kultur parabolen. Ruge celler i 5 minutter i en inkubator satt til 37 ° c.
   Merk: Celler kan løsne ved forskjellige satser, så platene bør sjekkes på en stasjonære lys mikroskop for å sikre celle avløsning etter 5 min. Juster løsgjøring protokoll per leverandør instruksjoner når du bruker en cellelinje.
10. Tilsett 6 – 8 mL av cellulær medium som inneholder FBS eller serum til fatet for å nøytralisere Trypsin, samle celler med en 10 mL serologisk Pipet, og sett dem inn i et 15 mL konisk rør.
11. Telle celler ved å laste 10 μL av celle suspensjonen på hver side av en hemocytometer og følg den tilhørende telle protokollen.
12. For pasient-avledede celler innhentet fra primære eller metastatisk solide svulster eller fra ascites som ikke har vært 2D kultivert, forberede enkelt celle suspensjoner i serum fritt medium (SFM) beskrevet tidligere³.
13. Prosess tumor vev som tidligere beskrevet og lagre enkelt celle suspensjoner for senere bruk i passende frysing medium^21,22.
    1. For solid tumor vev, hakke mekanisk med et barberblad og filter resulterende løsning gjennom et 40 μm filter før isolere ønskede celler fra en tetthet gradient^21,22.
    2. For ascites prøver kan du konsentrere celler ved å sentrifugering, lyse røde blodlegemer i buffer med ammonium kalium (ACK), vaske i 1x PBS, og deretter gå gjennom et 40 μm filter og en 28 G nål 4 ganger²².
14. For isolering av eggstokkene CSCs, sortere celler med Flow flowcytometri som beskrevet nedenfor i detalj.
15. Nylig isolerte enkeltceller er frosset for lagring og tint når det trengs for eksperimentering.
16. For å forberede celle oppheng for plating, beregne ønsket volum av celle løsning som kreves for plating: 20 μL per dråpe X totalt antall dråper = totalt løsnings volum nødvendig.
17. Fortynne celle konsentrasjonen til ønsket celle konsentrasjon per 20 μL (dvs. 100 celler i en 20 μL dråpe).
18. Bland celle suspensjonen forsiktig ved hjelp av en Pipet før før plating å sikre homogen fordeling av celler og forbedre ensartethet mellom dråper.
    Merk: Overmixing av celle suspensjonen kan føre til celle død og rusk i hengende fall spheroids.
19. Plasser tuppen av pipette i brønnen i en vinkel på ca 45 ° og Pipet 20 μL av celle oppløsningen i hvert hengende fall godt.
    Merk: Plating mønstre kan justeres avhengig av antall spheroids nødvendig. Plating spheroids i alle andre brønnen er tryggere når store mengder spheroids er ikke nødvendig i et eksperiment, fordi det hindrer utilsiktet sammenslåing av dråpene (figur 1D, E). Hvis store mengder spheroids er nødvendig for et eksperiment, plate hver brønn forlate en rad av grensen brønner på alle sider (figur 1F).
20. Plasser lokket på 6-brønn plate tilbake på toppen av hengende dråpe platen og bruke en elastisk termoplastisk stripe som er ufølsom for tap av fuktighet, for å forsegle kantene og hindre ytterligere fordampning av dråper. Ruge i en standard CO₂ fuktet inkubator (5% co₂, 37 ° c).
21. Fôr hengende dråper en gang hver 2 – 3 dager for å etterfylle cellekultur medium for nødvendige næringsstoffer ved å tilsette 2 – 3 μL til hver spheroid som inneholder brønn.
    Merk: Etter bildebehandling, er det alltid anbefalt å mate hengende dråper, som luft eksponering under Imaging fører til fordampning.

2. legge Cell kultur medium til hengende drop spheroid plater

1. Fjern den termoplastisk stripen og lokket i et biosafety kabinett og tilsett 2 – 3 μL av riktig kultur medium til hver brønn som inneholder et hengende fall.
   Merk: Det kvantum addert ville avhenger av miste størrelse og beløpet av tid imellom feedings.
2. Etter fôring, dekkplaten med topplokket og påfør frisk termoplastisk stripe til ytterkantene før du setter platen tilbake i inkubator.

3. fase kontrast bilde av spheroid morfologi

1. Fjern termoplastisk strimmelen fra rundt kantene av platen i et biosafety skap.
2. Fjern forsiktig 384-brønnen hengende dråpe spheroids plate fra biosafety skapet med lokket fortsatt på plass og legg det i mikroskop skuffen ved et epifluorescent mikroskop.
3. Bruk Live Imaging alternativet i tenkelig programvare på 4X, 10x eller 20x å observere hengende drop spheroids og ta ønskede bilder.
4. Etter å ha lagret bildene, ta platen tilbake til biosafety kabinett og fôr celler som beskrevet ovenfor.
5. Forsegle plate med en frisk termoplastisk stripe og plassere den forseglede platen tilbake i inkubator.

4. kvantifisering av spredning og levedyktighet innen Spheroids

1. Plate spheroids i et tilstrekkelig antall brønner for å få > 10 tekniske replikerer for hver gang punkt (dvs. dag 1 og dag 7) som skal undersøkes.
   Merk: Brønner som brukes for denne analysen er vanligvis ikke brukes igjen på grunn av potensielle forurensninger fra resazurin fargestoff.
2. Tilsett 2 μL av filtrert resazurin løsning på brønnene som er utpekt for sprednings analyse, som om fôring av disse brønnene og ruge for en forhåndsbestemt inkubasjonsperiode.
   Merk: Denne inkubasjonstiden kan variere basert på celle type og antall celler i spheroid. Det anbefales å bestemme den nødvendige inkubasjonstiden som trengs før begynnelsen spredning eksperimenter ved begynnelsen målinger etter 1 time inkubasjons og deretter re-måling hver 30 min til signalet readouts i kontroll brønner platå. Analysen målinger kan tas så mange ganger som ønsket. Inkubasjons er vanligvis 4 h for spheroids initiert med 100 kreftceller.
3. Slå på mikroplate leseren først etterfulgt av tilhørende plate leserprogramvare minst 15 min før første lesning for å tillate maskinen å varme opp og sikre den interne temperaturen ved 22 ° c som temperatur kan påvirke målingene.
4. Åpne en 384-brønn plate protokoll satt med 530/25 NM eksitasjon og 590/35 NM utslipp bølgelengder med optikk satt til bunnen, få satt til 35, lese hastighet satt til Normal, og lese type satt til fluorescens .
5. Etter inkubasjonsperioden, åpne hengende drop sandwich i en biosafety kabinett og bringe 384-brønn plate med lokket fortsatt på plass til plate leseren.
6. Plasser 384-brønn platen med lokket på plass i plate leser skuffen, som vil bli forlenget når maskinen varmes opp og klikk OK for å lese platen.
7. Returner brønnen plate til 6-brønn base og plassere den i inkubator. Hvis alle tids punkter har blitt lest for dagen, forsegle platen før du plasserer den tilbake i inkubator.
8. Lagre eksperimentet i popup-vinduet, og klikk deretter Ja når du blir bedt om vil du utføre PowerExports for plate 1 til utdata fra plate leseren programvare i et regneark for organisering.
9. Gjennomsnittlig fluorescens verdier for hver betingelse og normalisere av gjennomsnittet av kontrollen betingelse for å rapportere fold endring i spredning i ulike eksperimentelle forhold.
10. Ved sammenligning dag 1 til dag 7, normalisere ved å dele etter dag 1 gjennomsnittlig fluorescens å få fold endring i spredning over tid.
11. Beregn feilfelt ved hjelp av standard feil av gjennomsnittet, og Bestem statistisk betydning mellom eksperimentelle grupper med en passende statistisk test, som studentens tosidige T-test.

5. evaluering av legemiddel toksisitet i Spheroids

1. Drug administrasjon
   1. Når som helst etter spheroid formasjon, levere stoffet fortynnet til ønsket konsentrasjon slik at en 2 μL dose inneholder 10x ønsket endelig medikament konsentrasjon.
      Merk: Dette forutsetter en fordamping på 2 μL fra dråpe dråpen, slik at sluttvolumet etter behandling er 20 μL. For eksempel vil en dose på 50 μM av Cisplatin ha en forberedt løsning på 500 μM. Hvis dråper inneholder mer enn 20 μL, konsentrasjonen av stoffet og/eller volumet tilsettes bør justeres tilsvarende.
   2. Behandle kontroll prøver med 2 μL av cellekultur medium.
      Merk: Cisplatin er solubilized i vann. Kontroller er derfor 2 μL av cellekultur medium; men hvis stoffet kjøretøyet er et annet løsemiddel (f. eks DMSO), deretter Kontroller bør cellekultur medium med lik konsentrasjon av DMSO som brukes i narkotikabehandling.
   3. Fortsett å overvåke stoffet behandlet og kontroll spheroids gjennom hele stoffet inkubasjonsperiode med fase mikroskopi å ha en visuell registrering av effekten av legemiddel toksisitet, samt med resazurin fargestoff som beskrevet ovenfor for å overvåke mobilnettet levedyktighet.
      Merk: Vanligvis er stoffene tilsettes etter 5-7 dager i hengende dråper og toksisitet målt etter 48--72 HS men dette kan varieres avhengig av eksperimentet. Narkotika kan legges så snart stabile spheroids har dannet, vanligvis mellom 1-4 dager.
2. Legemiddel toksisitet kvantifisering ved celle telling
   1. På sluttidspunktet for behandling av narkotika, samle 10 spheroids hver fra kontroll og medikament behandlede brønner ved hjelp av en 1 000 μL Pipet og depositum hvert sett av spheroids i sin egen mikrosentrifugen tube.
   2. Bryt ned spheroids i enkeltceller ved gjentatt pipettering.
      Merk: For å redusere potensielle celle skade på grunn av gjentatte pipettering, enzymatisk fordøyelse med et enzym som Trypsin kan utføres for å lette generasjonen av enkelt celle løsninger før pipettering²³. Minimering av celle død på grunn av pipettering vil avhenge av celle type og bør optimaliseres tilsvarende. Hvis bekymret for døden på grunn av Disaggregation, se analyse med resazurin fargestoff og cytotoksisitet analysen for alternative metoder som ikke krever spheroid Disaggregation.
   3. Sentrifuger rørene i 5 min ved 400 x g for å samle celler i bunnen av mikrosentrifugen rør og aspirer supernatanten.
   4. Tilsett 20 μL av ferske medier eller 1x PBS til hvert rør og bland godt.
   5. Tilsett Trypan blå i forholdet 2 μL av Trypan blå flekk til 20 μL av celle fjæring.
   6. Legg 10 μL av celler og Trypan blå fjæring inn i hvert kammer av hemocytometer og telle celler under et lett mikroskop, med blå fargede celler som representerer døde celler og unstained celler som representerer levende celler.
      1. Den aktive cellen% = (antall aktive celler ÷ totalt antall celler) x 100.

6. spheroid karakterisering med histologiske teknikker

Merk: Det er to mold alternativer 3D trykt i en biokompatible polymer for å gjenskape spheroid array muggsopp laget av Ivanov et al.²⁴: 1) 20 brønn mold som kan holde 28 μL per brønn og 2) 63 brønn mold som kan holde 9 μL per brønn (figur 2D).

1. Sterilisere histologi mold og dens grense ved å tørke dem ned med 70% etanol og feste grensen fast rundt mold og legge mold oppreist. Begge formene passer omtrent 3 mL væske (3,203 mL for 20 spheroid array og 3,196 mL for 63 spheroid array).
2. Lett pels spheroid array med 10 000 cSt si olje ved hjelp av en spiss bomullspinne for å lette fjerning av prøven behandling gel støpt i påfølgende trinn.
3. Varm opp prøven behandling gel til flytende via mikrobølgeovn for 10-20 s med hetten løsnet.
4. Tilsett mellom 2,6 og 2,8 mL av smeltet prosessor gel i mold til ca nivå med toppen av grensen.
5. I et par minutter, en gang befestet, fjerne behandlingen gel støpt ved å skille grensen fra mold og deretter invertere matrisen mold.
6. Sett inn TWEEZER spissen mellom mold og grensen for å nøye skille dem og deretter bruke en celle skraper for å hjelpe løsne støpt fra mold hvis den ikke løsner med en gang.
7. Høste spheroids fra hengende dråpe plate ved pipettering innholdet i en enkelt brønn på en 100 eller 150 mm celle Petri parabol med en 1 000 μL Pipet, og isolere spheroid visuelt.
8. Pipet 5 μL av brønn innholdet, inkludert de identifiserte spheroid i en av array brønnene, til matrisen er fylt.
9. Vent 3 min for å sikre spheroids har avgjort til bunnen av matrisen før forsiktig pipettering smeltet behandling gel i hver av brønnene er forsiktig med å forstyrre spheroids.
10. Legg til ekstra behandling gel til nivå av toppen av matrisen og en gang avkjølt, plasserer befestet spheroid array i en merket kassett for behandling.
11. Senk merket kassett i 4% formalin over natten for å feste spheroids ved 4 ° c og deretter lagre i 70% etanol ved 4 ° c til klar for behandling.
12. Prosess med standard 1 h parafin program og deretter legge inn spheroid arrays slik at de behandlede arrays står vendt oppreist med bunnen av brønnene nærmest blokken ansiktet.
13. Sørg for at arrays er innebygd så flatt som mulig, med bunnen ansiktet flush med bunnen av blokken og plassere blokker på isen.
14. Legg blokken på mikrotomen og Juster blokken slik at bladet er parallelt med det lastede blokk ansiktet.
15. Skjær matrise (Sample dybde = 15 μm) til bunnen av matrisen brønnene er nådd sørge for at de sirkulære brønnene er synlige på kutt prøver.
16. Bytt til en 5 μm prøve dybde og fortsette å skjære og samlebånd. Sjekk under mikroskopet hvert få skiver for å avgjøre om spheroid dybden er nådd. Når spheroids er nådd, samler du inn hvert etterfølgende lysbilde til spheroids ikke lenger er synlige.
17. Stain hvert lysbilde med standard H & E-protokollen.

7. live Dead cytotoksisitet-analysen

1. Til hver hengende dråpe, tilsett levende cellefarge stoff, calcein-AM til den endelige konsentrasjonen av 2 μM, og den døde cellefarge stoff, etidiumbromid homodimer-1 til den endelige konsentrasjonen av 4 μM, husk at dråpe volumet er 20 μL.
   Merk: Prøv å holde volumer lagt til et minimum, og vanligvis legge til 2 μL av fargestoffer kombinert.
2. Plasser platene tilbake i inkubator klemt i en 6-brønn plate med lokk og ruge spheroids i 45 min ved 37 ° c.
   Merk: Avhengig av størrelsen på spheroids, varierer denne inkubasjonstiden betydelig. For eksempel, spheroids under 400 μm typisk bare krever 30 – 45 min av inkubasjonstid, mens større spheroids nærmere 800 μm har krevd opp til 90 min av inkubasjonstid. Inkubasjons tider må optimaliseres for et individs eksperiment.
3. For senere bildebehandling, høste spheroids med en 1 000 μL Pipet i et biosafety kabinett og depositum hver spheroid på pre-renset glass mikroskop lysbilder.
4. Bildet spheroids gjennom glasset, på en invertert konfokalmikroskopi mikroskop.
   Merk: Avhengig av nærheten av konfokalmikroskopi mikroskop til laboratoriet der spheroids høstes, kan spheroids enten bli avbildet i den opprinnelige dråpe av medium plassert på lysbildet eller innkapslet i 2% agarose hvis mer stabilitet er nødvendig for spheroid transport.
5. Bruke flerdimensjonale oppkjøpet modus i mikroskop programvaren, Finn spheroid ved hjelp av dic belysning ved 10x forstørrelse og deretter skanne z-flyet for å identifisere høyder som omfatter spheroid.
6. Klikk på z-serien og sett øvre og nedre grense for z-Skann litt høyere enn toppen av spheroid og litt lavere enn bunnen av spheroid.
7. Opphisse spheroids på 488 NM for calcein-AM (Live celler, grønn) og 561 NM for etidiumbromid homodimer-1 (døde celler, rød) med trinn størrelse anbefalt av programvaren, maksimal gevinst og minimal eksponering for hver farge.
8. Klikk Hent for å få et sammensatt z-stack-bilde av levende og døde celler i spheroid.
9. Kvantifisere levende/døde proporsjoner ved hjelp av bildebehandling programvare for å kvantifisere en prosentandel av pixel intensitet fra kanalen som tilsvarer levende celler versus prosentandelen av pixel intensitet fra kanalen som tilsvarer døde celler fra kompositt z-projeksjons bilder.
   Merk: På grunn av begrensningene i kvantifisere en 3D-struktur med 2D-projeksjon, er en alternativ metode for å kvantifisere Live versus Dead fluorescens, innenfor de hengende dråpe platene, å bruke en plate leser etter protokollen som følger med calcein-AM og etidiumbromid homodimer-1-settet.

Åttende Immunofluorescence

1. Varm en lav smelter 2% agarose løsning, slik at løsningen er tyktflytende og like over Smeltepunkt og sted på et mikroskop lysbilde for å lage en myk seng av agarose
2. Harvest spheroids ved å skyve 20 μL av PBS gjennom drop på myke seng på 2% agarose.
   Merk: Dette bør gjøres raskt slik at agarose ikke stivne før spheroids er innebygd.
3. Når agarose kjøler og gels med høstet spheroid fanget innenfor (under 5 min), tilsett 4% nøytral bufret formalin å fikse spheroids. Alternativt, Legg iskald metanol, og fikse agarose-embedded spheroids ved-20 ° c i 30 min.
4. Vask 3x i 5 minutter hver med 1x PBS, og forkaster PBS etter hver vask.
5. Blokk for 1 time ved RT med 10% serum (dvs. hest serum) og 0,15% såpeoppløsning (Triton X-100) i 1x PBS.
6. Vask 3x i 5 minutter hver med 1x PBS, og forkaster PBS etter hver vask.
7. Stain spheroids med ønsket fluorescerende antistoff ved anbefalt eller pre-bestemmes antistoff fortynning (dvs. fluorescensmerkete merket phalloidin ved en 1:100 fortynning), incubating i minst 90 min ved romtemperatur, dekket av lys.
   Merk: Protokollene vil variere avhengig av antistoff og mål, og antistoff fortynning må kanskje optimaliseres avhengig av eksperimentet.
8. Visualiser fluorescensmerkete beiset spheroids med invertert konfokalmikroskopi mikroskop ved hjelp av metoder skissert i forrige avsnitt for Imaging spheroids.
9. Sammensatte z-stack-bilder vil vise 3D-morfologi i spheroids.

9. innsamling og analyse av kreft Stamcelle populasjoner med Flow flowcytometri

1. Klargjøre spheroids for flyt flowcytometri analyse
   1. Samle spheroids fra hver brønn i de hengende dråpe platene ved hjelp av en 1 000 μL Pipet og sett dem inn i et 15 mL sentrifugerør for Disaggregation med gjentatte pipettering.
   2. Count levedyktige celler på en hemocytometer bruker Trypan Blue å bestemme celle nummer og konsentrasjon som beskrevet ovenfor.
   3. Alikvot celle fjæring i fem mikrosentrifugen rør slik at hver inneholder et minimum av 50 000 celler.
   4. Sentrifuger alle rør på 400 x g i 5 minutter i en mikrosentrifugen.
   5. Aspirer supernatanten fra hvert rør og resuspend pellets i 100 til μL av buffer.
   6. Label-rør "unstained", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB" og "ALDH/CD133", henholdsvis.
   7. Tilsett 0,5 μL av APC-isotype antistoff til APC-ISO-slangen og 1 μL av CD133-antistoffer mot ALDH/CD133-slangen som bestemt av serie fortynning og produsenter anbefaling.
   8. Tilsett 5 μL av DEAB reagens og 0,5 μL av ALDH til DEAB-slangen, og 1 μL av ALDH til ALDH/CD133-slangen.
   9. Vortex alle rør for ca 2 s og ruge ved 37 ° c for 45 min.
   10. Vortex alle rørene igjen og sentrifuger på 400 x g i 5 min i en mikrosentrifugen.
   11. Label FACS rør "unstained", "DAPI", "APC-ISO", "DEAB", og "ALDH/CD133" og fylle en isolert skum container å sette til side.
   12. Aspirer supernatanten og resuspend "unstained"-kontrollen i 400 μL FACS buffer (1x PBS med 2% FBS) og alle andre rør i 400 μL av FACS DAPI buffer (FACS buffer med 300 μM 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole).
   13. Plasser rør i container med is til analysert på en strømnings flowcytometer.
       Merk: For å sortere for eggstokkene kreft stamceller, samle alle celler som flowcytometer tiltak for å være ALDH + og CD133 + med portene satt til å omfatte 0,5% ikke-spesifikke APC signal og 0,15% ikke-spesifikke ALDH + signal. Minst 10 000 celler må analyseres for pålitelige resultater. Du finner mer informasjon i de siste publikasjonene^3,17.
2. Analyse av ALDH +/CD133 + populasjoner i FlowJo
   1. Dobbeltklikk på FlowJo ikonet for å åpne programmet og dra. FCS filer Hentet fra Flow flowcytometri programvare i arbeidsområdet.
   2. Dobbeltklikk på unstained -filen og sett y-aksen til side scatter høyde (SSC-h) og x-aksen for å videresende scatter høyde (FSC-h).
   3. Klikk T -knappen ved siden av hver akse for å justere skalaen og transformasjonen for å maksimere avstanden mellom forskjellige celle populasjoner.
   4. Klikk på polygon gating-knappen og tegn en polygon port rundt cellen befolkningen og merke befolkningen ' cells '.
   5. Dobbeltklikk celler befolkningen i arbeidsområdet for å vise bare cellene i ' cells ' befolkning og klikk deretter på FSC-aksen for å endre aksen kanal til FSC-bredde og klikk på SSC aksen og endre aksen kanalen til FSC-H.
   6. Velg rektangel gate verktøyet og tegne et rektangel rundt den venstre-mest tett befolkning av celler som dekker helheten av y-aksen for å utelukke potensielle doublets mot høyre i vinduet og etiketten denne porten "single Cells".
   7. Høyreklikk og kopier cellene og den nestede enkeltceller gate og lim dem inn under hvert eksemplar i arbeidsområdet.
   8. Dobbeltklikk på enkeltceller gate NESTET under DAPI prøven i arbeidsområdet for å vise enkelt celle populasjonen fra det prøve røret og klikk på FSC-aksen og endre aksen kanalen til DAPI-området kanal.
   9. Klikk på SSC aksen og endre aksen kanalen til histogram.
      Merk: de levende cellene vil være mot venstre som de utelukker DAPI, mens døde celler vil ta i DAPI og vises mot høyre i grafen.
   10. Klikk på T -knappen ved siden av DAPI -aksen og klikk på Tilpass akse for å justere SKALAEN for å MAKSIMERE avstanden mellom DAPI positive og DAPI negative topper.
       Merk: Et vindu vil dukke opp med skaleringsalternativer. Ofte ganger setter skala Field å Biex og justere ekstra negative ti år og bredde basis vil gi størst separasjon.
   11. Klikk Bruk i popup-vinduet for å bruke skaleringsendringer, velg Range gate-knappen, og spre den over DAPI negative topp, som tilsvarer den aktive celle populasjonen.
   12. Label denne porten "Live Cells" og høyreklikk for å kopiere "Live Cells" gate å lime det under "single Cells" gate under ' APC-ISO, ' DEAB ', og ' ALDH/CD133 ' rør for å velge den samme delen av levende celler i hver prøve tube.
   13. Så dobbel falle i staver det bo celler befolkning nestet under det APC-ISO eksemplar arkiv og skru av det x-akse å det ALDH € område kanalen og det y-akse å det APC — område kanalen.
   14. Igjen, justere aksen skala ved å klikke på T -knappen og tilpasse aksen for hver akse slik at hendelsene er lokalisert i nedre venstre regionen av plottet og velg Quad gate alternativet og klikk plottet vinduet for å etablere en kvadrant gate .
   15. Juster skjæringspunktet for porten slik at ca 0,5% av befolkningen ligger i øvre venstre i plottet vinduet eller "APC positive" kvadrant.
       Merk: Dette 0,5% representerer den ikke-spesifikke farging av APC-isotype.
   16. Høyreklikk hver kvadrant-etikett enkeltvis i arbeidsområdet, og endre navn på dem på riktig måte. Kontroll eller Kommando klikker hver kvadrant gate etikett i arbeidsområdet og kopiere dem.
       Merk: ' Q1 ' representerer CD133 + celler; ' Q2 ' representerer CD133 + og ALDH + ' celler; ' Q3 ' representerer ALDH +-celler; og "Q4" representerer CD133-og ALDH-celler.
   17. Lim inn kvadrant-portene på den aktive cellen befolkning nestet under ' DEAB ' fil. Juster den vertikale linjen slik at ca 0,15% av cellen befolkningen ligger innenfor ' ALDH + ' kvadrant tar seg ikke å flytte den horisontale linjen.
       Merk: Dette 0,15% representerer ikke-spesifikt ALDH-signal.
       1. Å sikre det det horisontal line bydde ikke endre holdning, avskrift det ny kvadrant portene nestet under det DEAB arkiv og pasta seg onto det bo celler under det APC ISO arkiv. Velg Ja når du blir bedt om å erstatte eksisterende port for kvadrant.
       2. Kontroller i arbeidsområdet at ' CD133 + ' prosent er fortsatt ca 0,5 under ' APC-ISO ' fil.
   18. Kopier og lim inn kvadrant portene til ' ALDH/CD133 ' filen ' live cells ' befolkning.
       Merk: Prosentandelen av levedyktige celle befolkningen til stede i øvre høyre kvadrant vil være prosentandelen av ALDH + og CD133 + doble positive CSCs innenfor prøven.

Representative Results

Spheroids dannet med cellelinjer eller pasient-avledet CSCs kan dannes med en rekke små celle tall innenfor hengende dråper (figur 2a). Spheroids skjema pålitelig med så få som 10 celler per brønn, noe som gir mulighet for bevaring av sjeldne pasientprøver. Celler innenfor disse spheroids er omgitt av andre celler i 3 dimensjoner som de ville være i Vivo, slik at for fysiologiske celle-celle-kontakter og diffusjon priser. Tumor celler i spheroids sprer seg forårsaker at spheroids utvides i størrelse over tid (fig. 2b). Ettersom mer aggressive pasient celler eller cellelinjer vokser raskere enn sine kolleger, er det viktig å kvantifisere sprednings kapasiteten til hver prøve og undersøke hvordan legemiddelbehandling påvirker spredningen av hver prøve. For å gjøre dette, en metabolsk aktivitet analysen, for eksempel en resazurin basert fluorescens analysen, kan enkelt utføres med 384-brønn fysiologiske plattform, uten noen krav for høsting spheroids, resultatene av disse kan sees i figur 2C. Flere spheroids kan også høstes, fast, delt, og farget med hematoksylin og eosin eller immunofluorescent antistoffer på samme tid for å identifisere celle morfologier og organisasjon innen spheroids, samt distribusjon av celletyper og ECM proteiner (figur 2D, E).

For å undersøke effekten av behandling på spheroid morfologi, kan spheroids lett visualisere ved fase kontrast avbildning (figur 3a). Mer kvantitativt, effekten av behandling på tumor celle eller CSC spredning kan også måles ved resazurin fargestoff fluorescens målinger i kontroll ubehandlet spheroids sammenlignet med i stoffet behandlet spheroids (figur 3b). Som en validering av celle død etter behandling, kan levedyktigheten innen kontroll og medikament behandlet spheroids lett fastslås via tilsetning av calcein-AM og etidiumbromid homodimer-1 til flere spheroids for hver tilstand (figur 3c). Etter inkubasjonstid kan farget spheroids høstes med en pipette og avbildet på et konfokalmikroskopi mikroskop.

Til slutt, ved høsting spheroids og Dispergering dem i enkelt celle suspensjoner, kan tilstedeværelsen av CSCs og andre celle fenotype markører analyseres med Flow flowcytometri (Figur 4). Sammenligning av levedyktige CSCs mellom ulike rusmiddel behandlinger innenfor samme pasient, så vel som mellom pasienter kan bidra til å skjelne effektiviteten av ulike CSC målretting narkotika i en pasient bestemt måte.

Figur 1:3D høy gjennomstrømming 384 hengende slipp spheroid plate lagring og plating oppsett. (A) hengende dråpe plate er plassert på bunnen av en 6 brønn plate delvis fylt med vann. (B) lokk på 6 brønn plate er plassert oppå hengende dråpe plate for å skape sterilt hydrering kammer. (C) 6-brønn platestabel å bli beseglet med en termoplastisk stripe for beskyttelse mot tap av fuktighet og forurensninger. (D) vekslende plating mønster for hengende dråpe plate. Rosa firkanter indikerer brønner fylt med celler og middels blanding. Blå områder indikerer vann kamre for hydrering. Grå bokser indikerer blanke brønner som fungerer som en grense mellom hydration kamre og spheroid dråper. (E) live bilde av hengende dråpe plate belagt med vekslende brønn mønster. (F) alle godt plating mønster layout benyttet for høy gjennomstrømning hengende fall spheroids eksperimenter. Rosa firkanter indikerer celle belagte brønner og blå områder indikerer vann fylte kamre for økt hydrering. Grå firkanter indikerer grense brønner som fungerer som grense mellom hydration seksjoner og cellekultur områder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: pasient AVLEDET CSC spheroids morfologi og spredning innen 3D hengende dråper. (A) live bilde av forberedt 384-hengende drop spheroid plate som sett fra bunnen. (B) progressive lys mikroskop bilder av pasienten avledet CSC spheroid vekst etter 2, 3 og 5 dager i en hengende dråpe. Skala bars = 100 μm. (C) Resazurin fluorescens intensitet viser signifikant økning etter 7 dager hengende fall kultur, samkjøre til spredning og vekst av hengende slipp pasienten avledet CSC spheroids (par to hale t-test, p < 0,0001, n > 10). (D) bilde av spheroid array mold brukes til å lage en støpt for innsamling av spheroids for histologi snitting. (E) H & E bilde av en spheroid kultivert med primære eggstokkene kreft stamceller, Mesenchymal stamceller, endothelial celler, og donor perifere blod mononukleære celler samlet i spheroid array. Skremme bar = 100 μm. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: behandling analyse av pasienter AVLEDET CSC spheroids hengende dråper. (A) pasient avledet CSC spheroids seeded på 50 celler/drop behandlet med økende konsentrasjoner av paklitaksel etter 5 dager med vekst. Representative bilder tatt 48 h etter behandling. (B) kvantifisering av cellulær levedyktighet via resazurin fluorescens ved økende konsentrasjoner av paklitaksel behandling. Alle prøvene har en betydelig redusert levedyktighet sammenlignet med kontroll. (Enveis ANOVA, p < 0.0001, n > 8). (C) konfokalmikroskopi bilde av Live (CALCEIN-am) og døde (etidiumbromid homodimer-1) celler innenfor hengende drop spheroid. Grønn farge indikerer levende celler og rød farge indikerer død celle befolkning. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: kvantifisering av CSCs i pasient AVLEDET CSC spheroids generert og vedlikeholdt på 384-hengende drop-plattformen. (A) ved analysering av flyt flowcytometri data blir celle populasjonen først valgt ved hjelp av en polygon port for å eliminere hendelser som kan tilskrives rusk. (B) enkeltceller blir deretter valgt for å eliminere potensielle doublet signaler som kan skjule resultater. (C) alle single Live celler blir deretter valgt basert på DAPI eksklusjon. (D) den vertikale aksen av en kvadrant gate er JUSTERT i DEAB-kontrollen for å muliggjøre ca 0,15% ikke-spesifikk ALDH farging. (E) den horisontale aksen til kvadrant-porten er JUSTERT i APC ISO-kontrollen for å muliggjøre ca 0,5% ikke-spesifikke APC farging. (F) kvadrant gate er så pleide avgjøre PROSENTEN av CD133 +, ALDH +, og CD133 +/ALDH + celler er gave inne det bo cellen befolkning inne det eksperimentelle CD133 addisjonstegn ALDH forfatning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den 384-godt hengende drop plate plattform for 3D spheroid formasjon er en lett implementert verktøy for enhver cellebiologi eller kreft biologi laboratorier. Denne fysiologiske plattformen gjør det mulig å studere cellelinjer, i tillegg til primær pasientprøver innen fysiologisk relevante 3D-kulturer, samtidig som det gir høy gjennomstrømming for narkotika screening. Plattformen sikrer også at kultur forholdene er svært tunable, noe som gir tett kontroll over plating tetthet, celle co-kultur prosenter, ekstracellulære komponenter, og medium sammensetning. Videre gjør denne fysiologiske plattformen eksperimenter for å være svært mottagelig for nedstrøms analyse teknikker som krever store eller små celle tellinger som qRT-PCR, FACS, og ulike Imaging metoder. Selv om brukervennligheten kommer med erfaring, blir nye lærlinger vellykkede raskt, så snart fart og enkel pipettering mestrer. Således, denne fysiologiske plattform er høylig anvendelig for personifisert 3D bedøve skjermen, CSC Biology og chemoresistance undersøkelser.

Noen punkter av interesse når nylig implementere denne plattformen inkluderer plate overføring og behandling. Ved overføring av plater fra ett sted til et annet som kreves for rutinemessig fôring, bildebehandling og analyse, bør nøye forholdsregler tas for å unngå unødvendige jostling. Grip platene fra ytterkantene holde dem så høyt som mulig og ta vare for å unngå risting bevegelser når du plasserer platen ned. Dette bidrar til å unngå dråpe tap eller sammenslåing av nabo dråper. Tilsvarende, årvåken oppmerksomhet bør gis til oppgaven med narkotikabehandling hengende dråpe spheroids å unngå feil dosering av ett hengende drop spheroid. Som med alle teknikk, tillit og nøyaktighet med disse oppgavene kommer med praksis.

Noen få begrensninger er medfødt til denne 3D fysiologiske plattform. Først dråpe ustabilitet kan være av problemet på lang sikt kultur tid poeng, hvis omsorg ikke er tatt for å opprettholde riktig total dråpe volum. Videre, som nevnt ovenfor, transport og lagring av plater må gjøres nøye for å unngå tap eller sammenslåing av dråper. I tillegg er størrelsen på dette 3D-miljøet diktert av en fast stabil dråpestørrelse på 20 μL, selv om mange replikerer kan produseres for forbedrede celle tellinger.

Modifikasjoner på denne 3D fysiologiske plattformen kan utnyttes for å øke gjennomstrømningen og endre fysiologiske egenskaper. For eksempel kan dråpe oppsettet endres for å inkludere alle brønn innenfor 384 brønn platen for å øke gjennomstrømningen. I tillegg er 3D hengende slipp plattform sterkt bidrar til co-kultur undersøkelser av enkel inkludering av flere celletyper i hver brønn. Å utvikle og vedlikeholde spheroids med hell, cellen kulturen medium og Initial cellen seeding tettheten kan lett modulert, å stramt regulere spheroid størrelse. Med disse svært tunable variablene utallige undersøkelser er mulig innenfor riket av 3D fysiologiske pasient avledet spheroids.

Mens de fleste analysemetoder beskrevet er mye brukt i vitenskapelig forskning, er det noen begrensninger som er spesifikke for å analysere hengende slipp generert spheroids med noen av disse metodene. Når spheroids for eksempel er kultivert i lange perioder i hengende rulle plater, kan dråpestørrelsen øke betraktelig forårsaker at slipp verktøyet blir risting under fase kontrast bildet, noe som potensielt kan redusere bildekvaliteten. Dette kan være ameliorated ved å ta en tilsvarende mengde medium ut av hver brønn før du legger friskt medium. I tillegg kan teknikker som Flow flowcytometri og telling individuelle levedyktige celler påvirkes av teknikken som brukes til å bryte fra hverandre spheroids, som kan være skadelig for cellene. Som sådan, det er en betydelig for hver laboratorium å optimere spheroid Disaggregation teknikker basert på deres celler og eksperiment å minimere cellen skade stund maksimere enkeltcellen tettheten. Endelig kan histologiske analyse av spheroids være komplisert ved sin lille størrelse og krever praksis for å oppnå vellykkede seksjoner.

Samlet sett er 3D hengende drop spheroid plattformen allment tilpasningsdyktig innen kreft og ikke-kreftforskning. Systemet er lett å lære og gir et 3D-fysiologisk relevant miljø for cellekultur i et høyt gjennomstrømmings format. Initiering tid av denne 3D fysiologiske plattform er minimal, med få, om noen, teknisk analyse hindringer å overvinne. Allsidigheten til dette systemet gir et middel for pasient spesifikk screening av effektive chemotherapeutics for presisjons medisin, i et mer fysiologiske miljø enn noen gang før.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 mL conical tube	Celltreat	FL4021
1x DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1x F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1x phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-