Summary
גלריה מלאבלה הוקמה לאחרונה כמודל מבחינה מוסרית, זולה, ומקובלת מבחינה אתית עבור קומפלקס השחפת של החיידק . כאן אנו מתארים ולהדגים את הצעדים שננקטו כדי ליצור זיהום מוצלח של G. מלובלה עם biלומילאוקטריה בואוויס bcg lux.
Abstract
שחפת היא הגורם הגלובלי המוביל של תמותת מחלות זיהומיות ובערך רבע מאוכלוסיית העולם הוא האמין להידבק בשחפת של פטרת. למרות שנים רבות של מחקר, רבים מן המנגנונים שמאחורי ההצלחה של שחפת משנת השחפת כאורגניזם פתוגניים להישאר נחקר, ופיתוח בטוח יותר, תרופות antimycobacterial יעיל יותר יש צורך דחוף להתמודד עם עלייה ו התפשטות של שחפת עמיד בפני סמים. עם זאת, ההתקדמות של מחקר שחפת היא בקבוק בצווארי מודלים מסורתיים של זיהום היונקים היקרים, זמן רב, ומאתגרת מבחינה אתית. בעבר הקמנו את הזחלים של גלריה החרק מובלה (עש שעווה גדול יותר) כרומן, הדבקה, עלות נמוכה, תפוקה גבוהה, מודל זיהום מקובל מבחינה אתית עבור חברי מתחם שחפת M . כאן אנו מתארים את התחזוקה, ההכנה, והזיהום של G. מלבלה עם biלובאוקטריה בואוויס bcg lux. באמצעות מודל זה זיהום, מינון פטרת תלוי התקפה אלימה ניתן לצפות, ואת הבדיקה המהירה של נטל vivo פטרת באמצעות מדידות biלומינסנציה הוא בקלות השגה הניתן לקריאה. למרות שההגבלות קיימות, כגון חוסר הגנום המלא לניתוח הטרנססקריפט, ניתוח אונטולוגי נגד חרקים דומים מבחינה גנטית ניתן לבצע. כעלות נמוכה, מהירה, ומקובל המודל המקובל עבור שחפת, G. מלאבלה ניתן להשתמש בתור המסך מראש כדי לקבוע את יעילות הסמים ואת הרעילות, וכדי לקבוע את התקפה השוואתית מפטרת לפני השימוש של יונקים קונבנציונליים ודלים. השימוש G.מלאבלה-מודל החיידק יוביל לירידה במספר משמעותי של בעלי חיים המשמשים כיום במחקר שחפת.
Introduction
שחפת (TB) הוא איום גדול על בריאות הציבור העולמי עם 9,000,000 מקרים חדשים בשנה ו 1,500,000 מקרי מוות1. בנוסף, מעריכים כי רבעון אחד של אוכלוסיית העולם נגוע בסוכן סיבתי של המחלה, שחפת של פטרת (Mtb). בין האוכלוסייה הנגועה, 5-10% יפתחו מחלת שחפת פעילה במהלך חייהם. יתר על כן, הופעתה והתפשטות של עמיד בפני סמים עמידים (MDR) ובאופן מקיף-סמים (XDR) עמידים Mtb מהווה איום רציני לבקרת מחלות, עם 123 מדינות לדווח לפחות אחד xdr מקרה1. הטיפול בשחפת דורש קוקטייל של לפחות ארבעה תרופות נגד פטרת, אשר isoniazid ו גריסופלובין מרשם עבור משך המינימום של שישה חודשים; טיפול משויך לעיתים קרובות עם תופעות לוואי מורכבות ורעלים. הגנה מפני החיסון היחיד ברישיון נגד שחפת, משתנה בונגד בוגקטריה באקלוס-Guérin(bcg). הבנה לא מלאה של הפתוגנזה של TB הסלים באופן משמעותי את התפתחותם של אסטרטגיות טיפוליות חדשות וחיסונים.
במשך עשרות שנים מודלים לזיהום בעלי חיים היו חיוניים עבור מחקר TB להבין את בסיסי התגובה ואת תגובת מארח לזיהום, וכלה להעריך הרומן אנטי פטרת סוכנים, אימונוtherapeutics ומועמדים חדשים חיסון3, 4. עם זאת, מחקר באמצעות מודלים לזיהום בעלי חיים של tb הוא קשה לשמצה כמו פתוגנזה והתקדמות של הידבקות בשחפת הם מורכבים, ואין מודל בעלי חיים יחיד מחקה את הספקטרום המלא ותכונות חשובות של המחלה5 ,6. יתרה מזאת, ניסויים בבעלי חיים הם יקרים, זמן רב להתחייב ודורשים צידוק מוסרי מלא. אף על פי כן, מודלים לזיהום בעלי חיים של TB תוארו בפרימטים שאינם אנושיים (למשל, קופי מאני), שרקנים, ארנבים, בקר, חזירים, עכברים ודגי זברדג, עם כל אחד שיש להם את המגבלות שלהם3,4. מודל murine הוא המודל הנפוץ ביותר בשל עלות, זמינות של קווים מסוג, שימוש בזיהום ושפע של ריאגנטים אימונולוגיים. עם זאת, הם לא בדרך כלל טופס גרשמות הקשורים באזורים של היפוקסיה האופייניים לזיהום שחפת סמויה (LTBI)6. שרקנים הם רגישים מאוד לזיהום Mtb , עם היווצרות גרגירומה מוקדם דומה לאלה בבני אדם, והם בשימוש נרחב בבדיקות החיסון; ובכל זאת, העדר ריאגנטים אימונולוגיים מסלים את השימוש בהם כמודל זיהום7. Zebrafish מתאימים ההקרנה בקנה מידה גדול בשלב מוקדם מחקרים טרום קליניים בשל גודלם הקטן, הרבייה מהירה וכלים גנטיים מתקדמים, אבל הם מבחינה אנטומית ושונה פיזיולוגית לבני אדם והם רגישים רק ל הזיהום של פטרת מרינום3. מודלים של בעלי חיים הדומים ביותר לזיהום האנושי Mtb הם בני אדם שאינם יונקים אנושיים (למשל, מקוק), אבל הם יקרים ויש להם שיקולים אתיים ומעשיים משמעותיים אשר מגביל במידה ניכרת את השימוש8.
זחל חרק של עש שעווה גדול או החלת דבש, גלריה מלאבלה, הפכו פופולרי יותר ויותר כמודל זיהום עבור מגוון של פתוגנים חיידקים ופטריות9, וכמסך עבור מועמדים הרומן מיקרוביאלית סמים 10. G. מלונולה היא מודל חסרי חוליות מוצלח בשל המערכת החיסונית מתוחכמת שלה (מורכב הגנות הסלולר וההומוראלית) החולקת רמה גבוהה של דמיון מבניים ופונקציונלי זה של בעלי חוליות11 . זה כולל מנגנונים החיסונית כגון phagocyציטוזה של פתוגנים על ידי הומוציטים (פונקציונלית דומה למקרופאג ונויטרופילים)12,13, הייצור והסירקולציה של אנטי חיידקים פפטידים (אמפר) ו משלים כמו חלבונים בתוך המוליקמ (מקבילה לדם של יונקים) של G. מלבלה11. יתרונות אחרים9,14,15 של G. מלונולה הזחלים כמודל כוללים 1) גודל גדול שלהם (20-30 מ"מ) אשר מאפשר מניפולציה קלה וזיהום, כמו גם אוסף של רקמה המוליקמ לניתוח, 2) תחזוקה קלה ב 37 ° c, תואם לחקר פתוגנים אנושיים, 3) זיהום מדויק על ידי הזרקה ללא צורך הרדמה, 4) היעילות של סוכנים מיקרוביאלית ניתן להעריך ניצול פחות סמים עבור הערכה, 5) חוסר אילוצים מוסריים בהשוואה לשימוש ביונקים, 6) גדלים של קבוצות גדולות ניתן להשתמש בהשוואה למודלים של בעלי חיים המאפשרים שימוש ביותר, ו -7) פעמים קצרות יותר עבור ניסויים בזיהום נדרשים.
במחקר שנערך לאחרונה, הדגמנו כי G. מלונו יכול לשמש כמודל זיהום הרומן לחקר הפתוגנזה של זיהום על ידי biלומינטאז M. סטרפטקוקוס bcg lux, גרסה ששונתה גנטית של זן החיסון וחבר של קומפלקס Mtb (mtbc)16. בעוד G. מלונולה כבר שימש בעבר כמודל זיהום עבור חיידקים שאינם בעלי בקטריות (ntm), בעיקר M. מרנום ו- פטרת abscessus17,18, מחקרים באמצעות mtbc מוגבלים ל זה של לי ואח '16. ביולומילטיות ללא פתוגניים זנים מפטרת, אשר ניתן להשתמש ברמת הבלימה (CL) 2 כפונדקאית עבור Mtb, להציע את היתרונות של בטיחות ומעשיות על פני החיידקים פתוגניים. לאחר הזיהום עם BCG lux, הזחלים מתחילים לפתח מבנים כמו גרגירומה מוקדם, אשר יכול לספק תובנה יקר לתפקיד של חסינות מולדת בהקמת שחפת זיהום16. בנוסף, זה מודל זיהום פשוט חסרי חוליות יש את הפוטנציאל לספק מהירה, בעלות נמוכה, הערכה אמינה של שחפת הפתוגנזה המשלבת אתגר מבוקר ומשכפל מרובים עבור התוכסות. יתר על כן, המודל יש את הפוטנציאל לשמש למסך הרומן anti-TB מועמדים החיסון בפיתוח מוקדם, הפחתת מספר כולל של בעלי חיים בניסויים. היכולת למדוד שינויים במבנה הפונדקאי והפתוגן, הטרנס והפרוטפה כדי לקבוע יעדי סמים ולהעריך מנגנוני פעולה של תרופות מעשיות וחיסונים טיפוליים, גם הם יתרון.
כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים הניסיוניים להכנת ביולומינסיום . סטרפטקוקוס bcg lux לוקס ו -g. מרכך זחלים עבור זיהום פטרת, כמו גם את הנחישות של הזחל וגם מפטרת הישרדות בתגובה לזיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל העבודות המתוארות להלן מתבצעות במעבדת CL2 בתוך ארון בטיחות מיקרוביולוגי מסוג 2 (MSC) בעקבות הנחיות בריאות ובטיחות מקומיות.
1. הכנת M. סטרפטקוקוס bcg לוקס לזיהום
- הפשרה קפוא 1.2 mL גליצרול (15%) מלאי של M. סטרפטקוקוס bcg lux, זן החיסון מונטריאול השתנה עם המעבורת פלpSMT1 באמצע לשאת את הגנים הluxab מ vibrio harveyi קידוד האנזים לוציפראז19.
- איחסן 15 מ ל של מרק ידלברוק 7h9 המכיל 0.2% גליצרול, 10% אלבומין, דקסטרוז, קטלאז (ADC) העשרה ו 50 μg/mL hygromycin עם מופשר 1.2 ml סדרת מחלקים של bcg lux, ב שמסומנת מ250 תויג מבחנה erlenmeyer אייר.
- מניחים את הבקבוקון במיכל ביובטיט אטום, ומודעות ב-37 ° c בחממה מסלולית ב-220 סל"ד עבור 72 h (או עד שהתרבות מגיעה לשלב באמצע הצמיחה).
- בדוק את הצמיחה של bcg לוקס התרבות על ידי הכנת 1:10 לדלל את התרבות בצינורות לומילומטר באמצעות מלוחים באגירה פוספט (PBS, pH 7.4, 0.01 m מאגר פוספט, 0.0027 m אשלגן כלוריד ו-0.137 m נתרן כלוריד) בשכפול. מערבולת, ולטעון את הצינורות לומילומטר לתוך האור ולמדוד את biלומינסנציה (יחידת אור יחסית [RLU]/mL) באמצעות n-decyl אלדהיד כמו המצע (1% v/v באתנול מוחלט)20.
הערה: היחס של RLU/המושבה להרכיב יחידות (CFU) נקבע בעבר להיות 3:1 כאשר BCG lux גדל בתוך מבחנה ב ידלברוק 7H9 ציר20. - צנטריפוגה את התרבות ב 2,175 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקשור את התאים ולהשליך את supernatant לתוך חיטוי מתאים עם פעילות בקטקטרידקים ידוע. היפטר מכל פסולת התרבות בעזרת חומרי חיטוי המתאימים לחיידקים בעקבות ההנחיות המקומיות.
- לשטוף את הגלולה הסלולרית פעמיים ב-PBS המכיל 0.05% polysorbate 80 (PBS-T) כדי למנוע הקלצות חיידקי.
- בעקבות השטיפה הסופית, decant פסולת supernatant, להשהות מחדש את הגלולה מפטרת התאים ב-PBS-T ולדלל את ההשעיה מפטרת את צפיפות התא הרצוי באמצעות מדידות RLU.
- הכינו לוחיות רישוי טוריות בנות 10 מנות של האיקציות בלוחות של 24 שעות באמצעות PBS-T. צלחת החוצה 10 μL אל ידלברוק 7H11 אגר צלחות (0.5% גליצרול, 50 μg/mL hygromycin, 10% חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז, קטלאז [OADC]) בשכפול כדי לספור מונה CFU ספירות.
2. הכנת הזחלים של G. מלונולה
- רכשו את הזחלים האחרונים ממקורות מתאימים ושמרו על הזחלים בחשכה ב-18 ° צ' עם הגעתם ושימוש בתוך 1 שבוע של רכישה. לחילופין, הזחלים יכולים להיות מרוכזים בעצמם בעקבות הפרוטוקול של Jojo ואח '21. עבור הזחלים שנרכשו, למחוק הזחלים מתים, דהוי או pupating לפני אחסון.
הערה: הזחלים מורפולוגית להבדיל. בין הזחלים האחרונים - לזהות ולבחור זחלים בריאים לניסויים, מבוסס על צבע קרם אחיד עם מעט ללא שינוי צבע (melanization), גודל (2-3 ס מ אורך), משקל (כ 250 מ ג), הצגת רמה גבוהה של תנועתיות, ואת היכולת לזכות את עצמם כשהם מתהפך.
- בזהירות לספור את הזחלים בריאים (מינימום של 20 ל 30 לכל קבוצה) לתוך צלחת פטרי (94/15 מ"מ) מרופדת עם שכבה של נייר סינון (94/15 מ"מ) באמצעות פינצטה בקצה קהה כדי למזער את הזיהום ולאחסן בטמפרטורת החדר בחושך עד השימוש.
3. הדבקה של G. מרכך עם bcg lux
- מזער את העומס בתוך MSC כדי להפחית את הסיכון של זיהום ופציעה מקל מחט.
- הכן את פלטפורמת ההזרקה על ידי הקלטה של נייר סינון מעגלי (94 מ"מ) למשטח שטוח ומוגבה. משטחים רכים או קשים ניתן להשתמש והוא תלוי לחלוטין בהעדפות המשתמש, לדוגמה, מכסים של תיבת פיפטה או ספוג מסורק ניילון.
- לחטא מיקרומזרק 25 μL (25 גרם) על-ידי מנושפי 3 כרכים של 70% אתנול ועוד לשטוף עם 3 כרכים של ה-PBS-T סטרילי.
- מריקות 10 μL של BCG lux לוקס (מוכן בסעיף 1) או PBS-T לתוך מיקרומזרק מעוקר 25 μl. השתמש במזרק נפרד עבור שליטה שלילית של PBS-T.
הערה: השהה מחדש את ה-BCG lux inoculum עקבות 10 זריקות כדי להבטיח השעיית תאים אחידים. - השתמש מלקחיים להרים זחל אחד ומקום על פלטפורמת ההזרקה.
- על הרציף, הפוך את הזחל על גבו ושתק על ידי אבטחת הראש והזנב עם הפינצטה. לאתר את הרגל השמאלית האחרונה ספירה למטה מהראש של הזחל ולהכניס בזהירות את קצה המחט (5-6 מ"מ) בזווית 10-20 ° למישור האופקי.
הערה: מלקחיים קצרים וצרים מאפשרים. שמירה קלה עם מתח זחל מינימלי שים לב לא מעל לחדור אשר עלול לנקב את הבטן ולגרום שאינם BCG לוקס ספציפי מלניזציה או מוות. - לספור את הזחלים הנגועים לתוך צלחת פטרי מרופדת עם שכבה של נייר סינון, אחת 90 mm צלחת פטרי יכול להכיל עד 30 הזחלים.
- אחסן את הצלחת פטרי המכילה את הזחלים בקופסה שחורה שפרקו או שאינה אטומה בתוך חממה ב-37 ° c עם 5% CO2.
4. ניטור ההישרדות של G. מלונולה בעקבות זיהום
- במהלך הזמן, לעקוב אחר ההישרדות של הזחלים כל 24 שעות. הזחלים נחשבים מתים כאשר הם אינם מצליחים לנוע בתגובה למגע.
5. מדידת הנטל בVivo של BCG lux בתוך G. מלונולה
- בכל פעם, באופן אקראי לבחור חמישה הזחלים נגועים בעבר הוכנו בסעיף 3 ולעקר בעדינות את משטחי הזחל באמצעות כותנה ניצן משטחים ספוגה 70% אתנול.
הערה: שלב זה חשוב כאשר ציפוי זחל הומוגון לספירת CFU מפטרת כמו הזחלים לא מעוקר יכול להוביל לזיהום. - מניחים את הזחלים בנפרד לתוך 2 מטריצה ליסינג מטריקס המכיל 800 μL של ה-PBS סטרילי.
- הומוגון הזחלים באמצעות הומוגניצר עבור 60 s ב 6.0 m.
- צנטריפוגה את הצינורות lysing ב 3,500 x g עבור 5 s כדי להסיר את המגון מעפעפיו, ובזהירות decant את הומובין לתוך צינורות לומילומטר סטרילי בנפרד.
הערה: עבור ספירת CFU (שלב 5.7), להבטיח לשריין 100 μL של הומוהגון בצינור התגובה של ה1.5 mL סטרילי. - לשחזר את כל המאכלת הנותרים על ידי שטיפת צינורות ליסינג מטריקס עם 1 מ ל של PBS-T ו פיפטה לתוך הצינורות לומימטר המקביל.
- מערבולת את צינורות הלומטר ולמדוד את הביולומינציה של הומוטים שתוארו בעבר בשלב 1.4.
- הכינו מדלל סדרתי באורך 10 מנות של הומוגון בלוחות מתרבות 24 שעות באמצעות PBS-T. צלחת החוצה 10 μL של דילול אל ידלברוק 7H11 אגר צלחות המכילות 0.5% גליצרול, 50 μg/mL hygromycin, 10% OADC ו 20 μg/mL piperacעבלין, כדי לקבוע את היחס RLU/CFU של BCG lux לאחר זיהום vivo.
הערה: Piperacעבלין מבטלת הילידים G. מיקרוביולה microbiota עם עיכוב גדילה מינימלי של bcg lux16.
6. אנליזה סטטיסטית
- מגרש את עקומת קפלן מאייר הישרדות באמצעות נתונים שנאספו ולבצע את האח-קוקס (Log-בדרגה) מבחן כדי לקבוע את משמעות התוצאה, איפה * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, ו * * * * p < 0.0001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מציגים את הנתונים הנציגים שניתן להשיג באמצעות G. מלאבלה — bcg לוקס מודל הזיהום ולהדגיש את היתרונות של G. מלונולה כמודל זיהום עבור חברי הmtbc (איור 1). הליכים ניסיוניים עם נקודות מפתח טכניות מתוארים באיור 2.
איור 1: היתרונות של G. מלונולה כמודל לזיהום. הדמות הזאת הותאמה מקאבונה ושיאן22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: המתאר של הליכים ניסיוניים. (א) תחזוקה והכנה של G. מלבלה עבור זיהום עם M. סטרפטקוקוס bcg lux. (ב) הכנת התרבות bcg לוקס לצורך זיהום. (ג) זיהום של G. מלבלה עם bcg lux. (ד) מדידה של התקפה אלימה ונטל VIVO של bcg Lux ב -G. הזחלים של מלונולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
BCG לוקס תלוי במינון התקפה אלימה נצפתה ב -G. מלונאלה הזחלים מעל 96 h הדגירה תקופת (איור 3), ואת המינון הקטלני הנדרש עבור 50% הזחל התמותה (LD50) נקבע להיות 1 x 107 cfu. התפלגות ההישרדות המשקפת את התקפה אלימה של מנות bcg לוקס נבדק היה שונה באופן משמעותי (p < 0.0001). קבוצות שליטה מוזרק עם מינון 10 μL של PBS-T או אלה פשוט נדקר פציעות מחט, לא להשפיע על בריאות הזחל או להוביל לעלייה בתמותה כפי שנקבע על ידי תצפיות בדיקות על תנועתיות ומלניזציה בנקודות זמן שונות.
איור 3: קפלן-מאיר עקומת ההישרדות של G. מלאבלה בתגובה שונות של האנאוותה של M. סטרפטקוקוס bcg lux. הזחלים בריאים (n ≥ 10 לכל קבוצה), נדבקו במינונים שונים של BCG lux. הזחלים היו מודבטים ב 37 ° c ומנוטרים על ההישרדות כל 24 h עד 96 h. הקבוצה נגוע הוזרק עם PBS, ו קבוצה נדקר (החדרת מחט בלבד) הפגינו את ההשפעה של פגיעת מחט על בריאות הזחל. האמצעים של שני ניסויים עצמאיים מוצגים, עם 95% מרווח ביטחון, מיוצגים כקווים מנוקדים בצבע המקביל על האינוונים. דמות זו הותאמה מ Li ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כל הזחלים נגועים BCG lux הציג שינויים פיסיולוגיים לאורך זמן, עבור הזחלים נגועים עם 2 x 107 cfu מינון של bcg lux, melanization של קו הזחל היה נצפתה מ 48 h לאחר זיהום (pi), ו שיטתי melanization נצפתה מ 96 h pi (איור 4). יתר על כן, תנועתיות הזחלים הופחת עם חומרת המלניזציה ואת היכולת של הזחלים כדי וקעים אבדו על זיהום בהשוואה לפקדים נגוע.
איור 4: מלניזציה של G. melanization בתגובה לזיהום עם M. סטרפטקוקוס bcg lux. הזחלים בריאים ב 0 h נדבקו עם 2 x 107 cfu מינון של bcg lux. ב 48 h ו 96 h pi, מלניזציה לאורך קו הזחל ומלניזציה שיטתית, בהתאמה, נצפתה.
הישרדות של BCG lux בתוך G. מלאבלה הזחלים נקבע מעל 2 שבועות באמצעות מדידת ביולומינסנציה של זחל הומוגון. זיהום עם 1 x 107 cfu מינון של bcg lux הביא בירידה הראשונית של bcg lux ביולומינציה מ-0 עד 72 h pi. עם זאת, מ-72 עד 144 שעות, הביולומינציה של BCG lux plateaued, המציין את הקמת זיהום מתמשך (איור 5).
איור 5: בנטל vivo של M. סטרפטקוקוס bcg lux ב G. מלונולה ככמת באמצעות biלומינסנציה (יחידת אור יחסית, rlu/mL) במשך שבועיים כמובן הזמן. הזחלים בריאים (n = 30) נדבקו 1 x 107 cfu מינון של bcg lux. בנטל הvivo הייתה הומוגניזציה של חמישה זחלים בכל פעם (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h), ומדידת הביולומינציה של ההגון. האמצעים לשלושה ניסויים עצמאיים מוצגים, וקווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע. איור זה הודפס מתוך לי ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כמו כימות מהירה והזדהות של צמיחה vivo פטרת במחקרים אלה נקבע על ידי המדידה של biלומינסנציה, היחס של RLU ו CFU צריך גם להיקבע בvivo. במערכת הזיהום הספציפית שלנו, את היחס vivo של RLU ו CFU נע מ 2:1-5:1, עם ממוצע של 4:1 על פני 168-h קורס הזמן (איור 6).
איור 6: קביעת היחס vivo rlu/cfu של M. סטרפטקוקוס bcg lux ב G. מלונולה . הזחלים בריאים (n = 30) נדבקו 1 x 107 cfu מינון של bcg lux. בכל פעם (0, 24, 96 ו 168 h), ארבעה נגועים/שליטה (PBS-T) הזחלים היו הומוגניים, ואת המהווטים נמדדו עבור biלומינסנציה מצופה על 7H11 אגר כדי לספור ספירות CFU. האמצעים לשני ניסויים עצמאיים מוצגים וקווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש ב -G. מלאבלה כמודל זיהום הוקם עבור מספר פתוגנים חיידקיים ופטרייתיים לחקר התקפה אלימה, הפתוגן הפונדקאי אינטראקציה, וכמסך עבור הרומן therapeutics10,22. הדיון הבא מבוסס על הליך ניסיוני לשימוש G. מלאבלה כמודל זיהום עבור mtbc.
בריאותם של הזחלים התמימים לפני הניסויים יכולה להשפיע משמעותית על תוצאות הניסוי. לכן, הדבר חיוני כי כל הזחלים הדהויים ו/או פצועים יוסרו עם הגעתם ואינם משמשים לניסויים כלשהם. אם מספר גדול של זחלים נמצאים מת בתוך אותו מיכל עם הגעתו, מומלץ להשליך את האצווה כמו זיהומים מראש קיים עשוי להיות סיבת המוות. כאשר ניתן לבצע ניסויים באמצעות הזחלים קרוב ליום הרכישה/ההגעה. לפני השימוש להבטיח לאחסן את הזחלים ב 18 ° צ' כדי למנוע התגלמות וכלה למקסם את מספר הזחלים הזמינים לניסויים. הזחלים בריאים יכולים לשמש עד 7 ימים לאחר משלוח/רכישה. בעקבות זיהום, להבטיח להסיר את כל הזחלים מתוך צלחת פטרי כמו, מסיבות עדיין לא ידוע, נוכחות של הזחלים מתים נראה להגדיל את שיעור התמותה באוכלוסיה לדוגמה. עבור משתמשים של הזחלים הגדל עצמית, חשוב להיות מודעים לשינויים ביולוגיים בהשוואה לזחלים שנרכשו, כמו שונות בתנאי תזונה וצמיחה יכולה להשפיע על החסינות זחל21,23. משתנים בין-ניסיוניים יכולים להיות מוגבלים על ידי שמירה על המקור, אם רכשת, או את תנאי ההזנה והגדילה של הזחלים הצומחים העקביים בין הניסויים. בכל הניסיונות, הכללת הפקדים השליליים ' ריקים ' ו'נדקר ' חיוניים; הפקד הריק הוא מחוון של זיהום או רעילות של מטריצה ההשעיה (PBS-T או ציר המדיה), ואת השליטה נדקר מחקה את ההשפעה של פגיעת מחט על בריאות הזחל. יתר על כן, אלה שולטת לנרמל כל וריאציה ביולוגית בין אצוות של זחלים, להבטיח הקפדה ודיוק בין ניסויים.
להזרקה של הזחלים של g. מלאבלה, השימוש במחט של 25 גרם מומלץ כמו מחטים למדוד גדול יותר יכול לגרום לדימום מופרז חדה יותר מחטים מד יכול בקלות לנקב את המעיים של הזחלים, המוביל לתמותת הזחל וחיובי שווא תוצאות. שיטות קונבנציונליות של הזרקת מחט בדרך כלל שתק את הזחלים ביד, אשר מגביר את הסיכון של פציעה במחט. על ידי שימוש בפינצטה כדי לשתק את הזחלים, הסיכון של פציעה מקל מחט מופחת באופן משמעותי כמו היד אינה בקרבת המחט בכל נקודה במהלך הזיהום. לחילופין, הזחלים יכולים להיות מקיבוע על ידי קירור. עם זאת, הלם קר ב 12 ° צ' עבור 15 דקות לפני הזיהום תועד כדי לשפר את התגובה החיסונית מולדים לזיהום. לכן, ניתוח התוצאות שהושגו דרך הקירור צריך לשקול בזהירות את השפעתו24. באמצעות הטכניקה שלנו, תפוקה בינונית של הזרקה (2-3 הזחלים לדקה) ניתן להשיג עם תרגול המשתמש; זה דומה למהירות ההזרקה המקובלת מניסיוננו (3-4 זחלים לדקה). יתרה מזאת, ניתן להתאים את השיטה שלנו להזרקת תפוקה גבוהה יותר על-ידי ניצול פלטפורמת הזרקת דוושה המופעלת באמצעות משאבת אינפוזיה עם מזרק חד פעמי המחובר ל-25 גר' פרפר.
ההכנה של BCG lux inoculum סיס מבוסס על הערכה מהירה של cfu באמצעות rlu של התרבות הפטרת20. בניסיון שלנו עם תרבות הציר, היחס של RLU ל CFU הוא 3:120, מנוגדים עם bcg lux גדל ב -G. מלונולה שבו rlu יחס cfu הוא 5:120. מצבור תאים של פטרת או "כרופינג" בדרך כלל בתרבויות צפופות יכול להיות השפעה על מדידות RLU, כמו הסתעפות יכול לגרום למדידות ביולומינציה לא אמין. בתור שכזה, לא מומלץ להשתמש בתרבות הפוקטריאלית המודלקת לצורך הכנה. עם זאת, התוספת של polysorbate 80 למדיית הצמיחה ממזער את החיבור התאים מבלי לשנות את הצמיחה של BCG lux. 16 ניתן לפתור כל מימוש מינורי בתאים על-ידי שטיפת התרבות עם PBS-T והיא חיונית להכנת מימוש מדוייק באמצעות rlu כבדיקה. יתר על כן, שטיפת PBS-T הוא חיוני להסרת כל גורם התקפה אלימה המופרש במהלך הצמיחה. מספר המתח והמעבר של פטרת צריך גם להילקח בחשבון, כמו זה יכול להשפיע על חומרת צבירה של מפטרת החיידקים25. בכל המקרים, יש לספור את החיסונים על ידי CFU על 7H11 אגר צלחות כדי להבטיח כי CFU הנכון הוכן על ידי מדידה biלומינסנציה. בנוסף, יש לקבוע את יחס RLU/CFU ב-vivo בכתב או במניות חדשים, מאחר שהיחס צפוי להשתנות.
G. מלונולה מחזיקה במספר יתרונות על פני מודלים קונבנציונליים של הידבקות בשחפת, כולל עלויות רכישה ותחזוקה זולות יותר, קלות של זיהום ותפוקת מחקר, במיוחד בשילוב עם זני ביולומינטיום16. חוסר האילוצים האתיים מאפשר גודל דגימה גדול יותר (מינימום של 20-30 הזחלים לקבוצה) בהשוואה למודלים מהיונקים, מתן ביטחון ואמינות גבוהים יותר בתוצאות המתקבלות26,27. עם זאת, ישנם מספר מגבלות בשימוש ב -G. מלונולה כמודל לזיהום. בתור חסרי חוליות, הם באופן טבעי חוסר חסינות מסתגלת הופך אותם בלתי מתאימים אנטי גנוגניות או מחקרים אימונולוגיים10. הסלולר תגובות החיסון של G. מלונולה מורכבת מספר סוגי המטוציטוט, ו פלמטציטים ו גרנולוציטים דווחו לתפקד באופן דומה phagocytes היונקים (נויטרופילים ו מקרופאגים)12. עם זאת, התפקיד והמנגנונים של סוגי תאים אלה נשארים תחת המאופיינת, ומחקרים השוואתיים ישירה בין מיונקים לבין phagocytes חרקים עדיין להתבצע. יתר על כן, העדר של G. מלונולה הגנום מעכבת את ניתוח התגובה המארחת לזיהום, וזה מבוססת כרגע על ניתוח גנטי של הנגיף נגד ספריות הטרנססקריפט של חסרי חוליות אחרים, כגון דרוזוהילה מלאנוגסטר ו Bombyx מורי28.
כמו מודל לזיהום TB, G. מלאבלה מחזיקה בעתיד מבטיח עם היכולת שלה לפתח מבנים כמו גרגירומה בתגובה ל-bcg לוקס זיהום16, שהם הסימנים החיוניים פתופסלוגיים של הידבקות בשחפת הם מפתח תכונה בפיתוח של LTBI. העבודה העתידית תכוון לאפיין את המודל הזה עם עניין מיוחד בהקמת מבנים כמו גרגירומה, באמצעות התייחסות, קלינית ומוטציה Mtb מבודד תחת תנאי CL3. בנוסף, אנו מצפים כי זה יכול להיות גם שימושי עבור הקרנת סוכן הרומן אנטי-בקטריאלי, כמו G. מרכך דומה מודל שימש ntms18, אבל זה נשאר להיקבע. אימוץ מודל זה יש את היכולת להפחית באופן משמעותי את מספר בעלי החיים המשמשים בתוך קהילת המחקר TB, ובמקביל מאיץ vivo TB מחקר התפוקה תחת תנאים מוסרית יותר מקובל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
פרויקט זה היה נתמך על ידי מענקים של ביוטכנולוגיה ומועצת המחקר הביולוגי מחקר (BBSRC), הוענק PRL ו YL (BB/P001262/1), ואת המרכז הלאומי להחלפת, עידון וצמצום של בעלי חיים במחקר (NC3Rs) הוענק PRL, SMN, BDR, ו YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. , Geneva. (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
