Summary
Galleria mellonella ble nylig etablert som en reproduserbar, billig og etisk akseptabel infeksjon modell for Mycobacterium tuberkulose kompleks. Her beskriver vi og demonstrerer trinnene tatt for å etablere en vellykket infeksjon av G. mellonella med Puerto Mosquito Mycobacterium bovis BCG Lux.
Abstract
Tuberkulose er den ledende globale årsaken til smittsomme sykdommer dødelighet og omtrent en fjerdedel av verdens befolkning antas å være smittet med Mycobacterium tuberkulose. Til tross for ti år med forskning, mange av mekanismene bak suksessen til M. tuberkulose som en patogene organisme gjenstår å bli undersøkt, og utvikling av sikrere, mer effektive antimykobakteriell narkotika er presserende behov for å takle økningen og spredning av legemiddelresistent tuberkulose. Imidlertid er progresjon av tuberkulose forskning flaskehalser av tradisjonelle pattedyr infeksjon modeller som er dyre, tidkrevende, og etisk utfordrende. Tidligere har vi etablert larver av insekt Galleria mellonella (større voks møll) som en roman, reproduserbar, lav pris, høy gjennomstrømming og etisk akseptabel infeksjon modell for medlemmer av M. tuberkulose kompleks. Her beskriver vi vedlikehold, forberedelser og smitte av G. mellonella med Puerto Mosquito Mycobacterium bovis BCG Lux. Ved hjelp av denne infeksjonen modellen, mykobakterieinfeksjoner dose avhengige virulens kan observeres, og en rask avlesning av in vivo mykobakterieinfeksjoner byrde ved hjelp av bioluminesens målinger er lett oppnåelig og reproduserbar. Selv om det finnes begrensninger, slik som mangelen på en fullt kommentert Genova for transcriptomic analyse, kan ontologiske analyse mot genetisk lignende insekter utføres. Som en lav kostnad, rask og etisk akseptabel modell for tuberkulose, kan G. mellonella brukes som en pre-Screen for å bestemme legemiddel effekt og toksisitet, og for å bestemme sammenlignende mykobakterieinfeksjoner virulens før bruk av konvensjonell pattedyr Modeller. Bruken av G. mellonella-mykobakterier modellen vil føre til en reduksjon i betydelig antall dyr som i dag brukes i tuberkulose forskning.
Introduction
Tuberkulose (TB) er en stor trussel mot global folkehelse med 9 000 000 nye tilfeller per år og 1 500 000 dødsfall1. I tillegg er det anslått at en fjerdedel av verdens befolkning er smittet med utløsende Agent for sykdommen, Mycobacterium tuberkulose (MTB). Blant den infiserte populasjonen vil 5 − 10% utvikle aktiv TB sykdom over levetiden. Videre, fremveksten og spredningen av multi-Drug resistente (MDR) og omfattende-narkotika (XDR) motstandsdyktig MTB utgjør en alvorlig trussel mot sykdom kontroll, med 123 land rapporterer minst ett XDR tilfelle1. Behandling av TB krever en cocktail av minst fire anti-mykobakterieinfeksjoner narkotika, hvorav isoniazid og Rifampicin er foreskrevet for en minimumsvarighet på seks måneder; behandling er ofte forbundet med komplekse bivirkninger og toksisitet. Beskyttelse fra den eneste lisensierte vaksinen mot TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-GUÉRIN (BCG), er variabel2. En ufullstendig forståelse av patogenesen av TUBERKULOSE signifikant hemmer utviklingen av nye terapeutiske og vaksinasjon strategier.
I flere ti år har dyr infeksjon modeller vært avgjørende for TB forskning for å forstå de grunnleggende patogenesen og vert respons på infeksjon, og å evaluere romanen anti-mykobakterieinfeksjoner agenter, Immuno-legemiddel og nye vaksine kandidater3, 4. imidlertid, forskning benytter dyr infeksjon modeller av TB er bekjent vanskelig idet patogenesen og progresjon av TB infeksjon er innviklet, og det er nei enkelt dyr modell det etterligner det i sin helhet gjenferd og betydelig vise egenskaper av sykdommen5 ,6. Videre dyr eksperimenter er dyrt, tidkrevende å gjennomføre og krever full etisk begrunnelse. Likevel, dyr infeksjon modeller av TB har blitt beskrevet i ikke-menneskelige primater (f. eks, aper), marsvin, kaniner, storfe, griser, mus og sebrafisk, med hver har sine begrensninger3,4. Den murine modellen er den mest brukte modellen på grunn av kostnader, tilgjengelighet av innavlet linjer, reproduserbarhet av infeksjon og overflod av immunologiske reagenser. Men de vanligvis ikke danner granulomer knyttet til områder av hypoksi som er karakteristisk for latent tuberkulose infeksjon (LTBI)6. Guinea Pigs er høylig mottagelig å MTB infeksjon, med patologi og tidlig granulom formasjon analog med dem inne human, og er vidt anvendt inne vaccine tester; men mangelen på immunologiske reagenser hemmer deres bruk som en infeksjon modell7. Sebrafisk er egnet for storstilt screening i tidlig stadium prekliniske studier på grunn av sin lille størrelse, rask reproduksjon og avanserte genetiske verktøy, men er anatomisk og fysiologisk annerledes enn mennesker og er bare utsatt for Mycobacterium marinum infeksjon3. Dyret modeller mest ligner menneskelig MTB infeksjon er ikke-menneskelige primater (f. eks, macaque), men de er dyre og har betydelige etiske og praktiske hensyn som betydelig begrenser deres bruk8.
Insekt Larven av større voks møll eller honeycomb møll, Galleria mellonella, har blitt stadig mer populært som en infeksjon modell for en rekke bakterielle og fungal patogener9, og som en skjerm for romanen antimikrobielle narkotika kandidater 10. G. mellonella er en vellykket virvelløse modell på grunn av sin sofistikerte medfødte immunsystem (bestående av mobilnettet og humoral forsvar) som deler en høy grad av strukturelle og funksjonelle likhet med virveldyr11 . Dette inkluderer immun mekanismer som fagocytose av patogener ved hemocytes (funksjonelt ligner på pattedyr macrophage og nøytrofile)12,13, produksjon og sirkulasjon av anti-mikrobielle peptider (forsterkere) og komplement-lignende proteiner i hemolymph (analogt til pattedyr blod) av G. mellonella11. Andre fordeler9,14,15 av G. mellonella larver som modell inkluderer 1) deres store størrelse (20 − 30 mm) som gjør det mulig for enkel manipulasjon og infeksjon, samt innsamling av vev og hemolymph for analyser, 2) enkelt vedlikehold ved 37 ° c, kompatibel for å studere menneskelige patogener, 3) presis infeksjon ved injeksjon uten behov for anestesi, 4) effekt av antimikrobielle midler kan vurderes ved hjelp av mindre legemiddel for evaluering, 5) mangel på etiske begrensninger i forhold til bruk av pattedyr, 6) store gruppe størrelser kan brukes i forhold til dyremodeller som gir større reproduserbarhet, og 7) kortere tid for infeksjon eksperimenter er nødvendig.
I en fersk studie viste vi at G. mellonella kan brukes som en roman infeksjon modell for å studere patogenesen av smitte ved Puerto Mosquito M. bovis BCG Lux, en genmodifisert versjon av vaksinen stamme og medlem av MTB -komplekset (MTBC)16. Mens G. mellonella tidligere har blitt brukt som en infeksjon modell for ikke-tuberkuløs mykobakterier (NTM), hovedsakelig M. marinum og Mycobacterium abscessus17,18, studier med MTBC er begrenset til av Li et al.16. Puerto Mosquito ikke-patogene mykobakterieinfeksjoner stammer, som kan brukes på forvaring nivå (CL) 2 som et surrogat for MTB, tilbyr fordelene av sikkerhet og praktisk over patogene mykobakterier. Etter infeksjon med BCG Lux, larver begynner å utvikle tidlige granulom strukturer, som kan gi verdifull innsikt i rollen som medfødt immunitet i ETABLERINGEN av TB infeksjon16. I tillegg har denne enkle virvelløse infeksjon modellen potensial til å gi en rask, rimelig og pålitelig evaluering av TB patogenesen innlemme kontrollert utfordring og flere replikerer for reproduserbarhet. Videre har modellen potensial til å bli brukt til skjermen romanen anti-TB narkotika og vaksine kandidater i tidlig utvikling, redusere det totale antall dyr i eksperimentering. Muligheten til å måle endringer i verts-og patogen struktur, transcriptome og proteom å bestemme narkotika mål og vurdere virkningsmekanismer av romanen narkotika og terapeutiske vaksiner, er også en fordel.
Her beskriver vi de eksperimentelle protokollene for utarbeidelse av en Puerto Mosquito M. bovis BCG Lux inokulum og G. mellonella larver for mykobakterieinfeksjoner infeksjon, samt fastsettelse av både larvestadiet og mykobakterieinfeksjoner overlevelse som reaksjon på infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: alt arbeid som er beskrevet nedenfor skal utføres i et CL2-laboratorium i et klasse 2 mikrobiologisk sikkerhetskabinett (MSC) etter lokale retningslinjer for helse og sikkerhet.
1. utarbeidelse av M. bovis BCG Lux for infeksjon
- Tine en frossen 1,2 mL glyserol (15%) lager av M. bovis BCG Lux, Montreal vaksine stamme forvandlet med shuttle plasmider pSMT1 bærer luxAB gener fra Vibrio harveyi koding av luciferase enzymet19.
- Vaksinere 15 mL Middlebrook 7H 9 buljong inneholdende 0,2% glyserol, 10% albumin, druesukker, catalase (ADC) berikelse og 50 μg/mL hygromycin med en tint 1,2 mL alikvot av BCG Lux, i en merket 250 ml Erlenmeyer kolbe.
- Plasser flasken i en forseglet biosafety beholder og ruge ved 37 ° c i en orbital shaker inkubator ved 220 RPM for 72 h (eller til kulturen når midten av loggen fase av vekst).
- Sjekk veksten av BCG Lux kultur ved å forberede 1:10 fortynninger av kulturen i luminometeret rør ved hjelp av fosfat bufret saltvann (PBS, pH 7,4, 0,01 M fosfat buffer, 0,0027 M kalium klorid og 0,137 m natriumklorid) i duplikat. Vortex, og Legg de luminometeret rørene inn i luminometeret og måle bioluminesens (relativ lys enhet [RLU]/mL) ved hjelp av n-Decyl aldehyd som underlaget (1% v/v i absolutt etanol)20.
Merk: Forholdet mellom RLU/Colony forming enheter (CFU) var tidligere bestemt på å være 3:1 når BCG Lux ble dyrket in vitro i Middlebrook 7h 9 buljong20. - Sentrifuger kulturen på 2 175 x g i 10 min ved romtemperatur til pellet cellene og kast supernatanten i et passende desinfeksjonsmiddel med kjent mycobactericidal aktivitet. Kast alt kultur avfall med desinfeksjonsmidler som er egnet for mykobakterier etter lokale retningslinjer.
- Vask cellen pellet to ganger i PBS inneholder 0,05% polysorbat 80 (PBS-T) for å hindre bakteriell klumper.
- Etter siste vask, Dekanter avfalls supernatanten, resuspend mykobakterieinfeksjoner celle pellet i PBS-T og fortynne mykobakterieinfeksjoner suspensjon til ønsket celle tetthet ved hjelp av RLU målinger.
- Forbered ti-fold seriell fortynninger av inokulum i 24-brønn plater med PBS-T. Plate ut 10 μL på Middlebrook 7H11 agar plater (0,5% glyserol, 50 μg/mL hygromycin, 10% oljesyre syre, albumin, druesukker, catalase [OADC]) i duplikat for å nummerere inokulum CFU teller.
2. utarbeidelse av G. mellonella larver
- Kjøp siste stadium larver fra egnede kilder og opprettholde Larvene i mørket ved 18 ° c ved ankomst og bruk innen 1 uke etter kjøpet. Alternativt kan larver bli selv-oppdratt etter protokollen av Jojāo et al.21. For innkjøpte larver, kast eventuelle døde, misfarget eller pupating larver før lagring.
Merk: Pupating larver er morfologisk skilles til de siste skikkelsen larver. - Identifiser og velg friske larver for eksperimentering, basert på uniform krem farge med liten eller ingen misfarging (melanization), størrelse (2 − 3 cm i lengde), vekt (ca 250 mg), viser et høyt nivå av motilitet, og inneha evnen til høyre seg selv når den snus over.
- Nøye telle friske larver (minimum 20 − 30 per gruppe) i en Petri parabol (94/15 mm) foret med et lag av filter papir (94/15 mm) ved hjelp av Butt-end pinsett for å minimere forurensning og lagre ved romtemperatur i mørket til bruk.
3. infiserer G. mellonella med BCG Lux
- Minimer rotet i MSC for å redusere risikoen for forurensning og nål Stick skade.
- Klargjør injeksjons plattformen ved å tape et sirkulært filter papir (94 mm) på en flat, hevet overflate. Myke eller harde overflater kan brukes og er helt avhengig av brukerens preferanse, f. eks, pipette boks lokk eller en nylon skure svamp.
- Sterilisere 25 μL microsyringe (25 G) ved aspirating 3 volumer på 70% etanol og ytterligere skylling med 3 mengder sterilt PBS-T.
- Aspirer 10 μL av BCG Lux inokulum (fremstilt i avsnitt 1) eller PBS-T i de sterilisert 25 μL-microsyringe. Bruk en separat sprøyte for PBS-T negativ kontroll.
Merk: Resuspend BCG Lux inokulum etter 10 injeksjoner for å sikre jevn celle fjæring. - Bruk pinsett til å plukke opp en Larven og plasser den på injeksjons plattformen.
- På plattformen, Vend Larven på ryggen og nakkens ved å feste hodet og halen med pinsett. Finn den siste venstre proleg som teller ned fra hodet på Larven og sett tuppen av nålen forsiktig (5 − 6 mm) i en vinkel på 10 − 20 ° til det horisontale planet.
Merk: Kort og smal pinsett gir enkel immobilisering med minimum larvestadiet stress. Vær oppmerksom på ikke å over trenge som kan punktering tarmen og forårsake ikke-BCG Lux spesifikke melanization eller død. - Telle smittet larver i en Petri parabol foret med et lag med filter papir, en enkelt 90 mm Petri parabolen kan romme opptil 30 larver.
- Oppbevar Petri parabolen inneholder Larvene i en ventilert eller ikke-forseglet mørk boks inne i en inkubator på 37 ° c med 5% CO2.
4. overvåking av overlevelse av G. mellonella etter smitte
- Over tid kurset, overvåke overlevelsen av Larvene hver 24 h. larver betraktes som døde når de ikke klarer å bevege seg som følge av berøring.
5. måling av in vivo byrden av BCG Lux i G. mellonella
- På hvert tidspunkt, tilfeldig velge fem infiserte larver tidligere utarbeidet i § 3 og forsiktig sterilisere larvestadiet overflater ved hjelp av Cotton knopp servietter dynket i 70% etanol.
Merk: Dette trinnet er viktig når plating larvestadiet homogenate for mykobakterieinfeksjoner CFU opplisting som ikke-sterilisert larver kan føre til forurensning. - Plasser Larvene enkeltvis i 2 mL lysering matrise rør som inneholder 800 μL av steril PBS.
- Homogenisere Larvene ved hjelp av en homogenisator for 60 s ved 6,0 m/s.
- Sentrifuger lysering rørene på 3 500 x g for 5 s for å fjerne homogenate fra lokkene, og forsiktig Dekanter homogenate i sterile luminometeret rør individuelt.
Merk: For CFU-nummerering (trinn 5,7) må du sørge for å reservere 100 μL av homogenate i et sterilt 1,5 mL reaksjons rør. - Gjenopprette eventuelle gjenværende homogenate ved å vaske lysering matrise rør med 1 mL PBS-T og pipette i tilsvarende luminometeret rør.
- Vortex de luminometeret rørene og måle bioluminesens av homogenater tidligere beskrevet i trinn 1,4.
- Forbered ti-fold seriell fortynninger av homogenate i 24-brønn kultur plater med PBS-T. Tallerken 10 μL av fortynning på Middlebrook 7H11 agar plater inneholdende 0,5% glyserol, 50 μg/mL hygromycin, 10% OADC og 20 μg/mL piperacillin, for å bestemme RLU/CFU-forholdet mellom BCG Lux etter in vivo-infeksjon.
Merk: Piperacillin eliminerer native G. mellonella bakterieflora med minimal veksthemming av BCG Lux16.
6. statistisk analyse
- Plot den Kaplan-Meier overlevelse kurve ved hjelp av innsamlede data og gjennomføre mantel-Cox (log-Rank) test for å fastslå betydningen av resultatet, der * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001, og * * * * p < 0,0001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenterer vi representative data som kan fås ved hjelp av g. mellonella -BCG Lux infeksjon modell og fremheve fordelene ved g. mellonella som en infeksjon modell for medlemmer av MTBC (figur 1). Eksperimentelle prosedyrer med viktige tekniske punkter er skissert i figur 2.
Figur 1: fordelene med G. mellonella som en infeksjons modell. Dette tallet er tilpasset fra Kavanagh og Sheehan22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: omriss av eksperimentelle prosedyrer. (A) vedlikehold og tilberedning av G. mellonella for infeksjon med M. bovis BCG Lux. (B) UTARBEIDELSE av BCG Lux kultur og inokulum for smitte. (C) infeksjon av G. mellonella med BCG Lux. (D) måling av virulens og in vivo BYRDE av BCG Lux i G. mellonella larver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
BCG Lux dose avhengig virulens ble observert i G. mellonella larver over en 96 h inkubasjonsperiode (Figur 3), og den dødelige dosen som kreves for 50% larvestadiet dødelighet (ld50) var fast bestemt på å være 1 x 107 CFU. Overlevelses fordelingen som reflekterer virulens til BCG Lux -dosene som ble testet var signifikant forskjellig (p < 0,0001). Kontroll grupper injisert med en 10 μL dose PBS-T eller de bare stukket simulere nål skader, ikke påvirke larvestadiet helse eller føre til en økning i jordelivet som bestemmes av observasjons sjekker på motilitet og melanization på ulike tidspunkt poeng.
Figur 3: Kaplan-Meir overlevelse kurve av G. mellonella som svar på varierende Inocula av M. bovis BCG Lux. Friske larver (n ≥ 10 per gruppe), ble smittet med varierende doser av BCG Lux. Larvene var inkubert ved 37 ° c og overvåket for overlevelse hver 24 h for opp til 96 h. Gruppen som ble smittet ble injisert med PBS, og en stukket gruppe (innsetting av nålen bare) viste effekten av nål skade på larvestadiet helse. Det vises to uavhengige eksperimenter med 95% sikkerhetsintervall, representert som prikkede linjer i tilsvarende farge i inokulum. Dette tallet er tilpasset fra Li et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Alle larver smittet med BCG Lux viste fysiologiske endringer over tid, og for larver infisert med en 2 x 107 CFU dose av BCG Lux, melanization av larvestadiet rygg linjen ble observert fra 48 h post infeksjon (pi), og systematisk melanization ble observert fra 96 h PI (Figur 4). Videre, motilitet av Larvene redusert med alvorlighetsgraden av melanization og evne til larver til pupate ble tapt på infeksjon i sammenligning med infisert kontroller.
Figur 4: Melanization av G. mellonella som reaksjon på infeksjon med M. bovis BCG Lux. Friske larver på 0 h ble smittet med en 2 x 107 CFU dose av BCG Lux. Ved 48 h og 96 h PI ble det observert melanization langs larvestadiet rygg linje og systematisk melanization.
Overlevelse av BCG Lux innenfor G. mellonella larver ble bestemt over 2 uker gjennom bioluminesens måling av larvestadiet homogenater. Infeksjon med en 1 x 107 CFU dose av BCG Lux resulterte i en innledende nedgang på BCG Lux bioluminesens fra 0 − 72 h pi. Men fra 72 − 144 h pi, bioluminesens av BCG Lux plateaued, som indikerer etablering av vedvarende infeksjon (figur 5).
Figur 5: in vivo byrde M. bovis BCG Lux i G. mellonella kvantifisert ved hjelp av BIOLUMINESENS (relativ lys enhet, RLU/ml) over en to ukers tid kurs. Friske larver (n = 30) ble smittet med 1 x 107 CFU dose av BCG Lux. In vivo byrde ble kvantifisert av homogenisere fem larver på hvert tidspunkt (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h), og måle bioluminesens av homogenate. Det vises et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter, og feil stolpene representerer standardavviket for gjennomsnittet. Dette tallet har blitt gjengitt fra Li et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som den raske og reproduserbar kvantifisering av in vivo mykobakterieinfeksjoner vekst i disse studiene ble bestemt av måling av bioluminesens, bør forholdet mellom RLU og CFU også fastsettes in vivo. I vårt spesielle infeksjons system, i in vivo ratio av RLU og CFU varierte fra 2:1-5:1, med et gjennomsnitt på 4:1 over 168-h tid kurs (figur 6).
Figur 6: fastsettelse av in vivo RLU/CFU ratio av M. bovis BCG Lux i G. mellonella. Friske larver (n = 30) ble smittet med 1 x 107 CFU dose av BCG Lux. På hvert tidspunkt (0, 24, 96 og 168 h), fire infiserte/kontroll (PBS-T) larver ble homogenisert, og homogenater ble målt for bioluminesens og belagt ut på 7H11 agar å nummerere CFU teller. Det vises to uavhengige eksperimenter, og feil stolpene representerer standardavviket for gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av G. mellonella som en infeksjon modell har blitt etablert for en rekke bakterielle og fungal patogener for studiet av virulens, Host-patogen samhandling, og som en skjerm for romanen legemiddel selskap10,22. Følgende diskusjon er basert på den eksperimentelle prosedyren for bruk av G. mellonella som en infeksjons modell for MTBC.
Helsen til naive larver før eksperimentering kan ha en betydelig innvirkning på utfallet av eksperimentet. Derfor er det viktig at eventuelle misfarget og/eller skadde larver fjernes ved ankomst og brukes ikke til noen eksperimentering. Hvis et stort antall larver er funnet død i samme container ved ankomst, er det tilrådelig å forkaste batch som eksisterende infeksjoner kan være årsaken til dødsfallet. Når det er mulig utføre eksperimenter ved hjelp av Larvene så nær dagen for kjøp/ankomst. Før bruk, sørg for å lagre Larvene ved 18 ° c for å forhindre forpupping og for å maksimere antall larver som er tilgjengelig for eksperimentering. Friske larver kan brukes i opptil 7 dager etter levering/kjøp. Etter infeksjon, må du sørge for å fjerne eventuelle døde larver fra Petri parabolen som, av grunner ennå ukjent, synes tilstedeværelsen av døde larver å øke frekvensen av dødelighet i utvalget befolkningen. For brukere av selv oppdratt larver, er det viktig å være klar over biologisk variasjon i forhold til innkjøpte larver, som varians i kosthold og vekstforhold kan ha en innvirkning på larvestadiet immunitet21,23. Inter-eksperimentelle variabilitet kan begrenses ved å holde kilden, hvis kjøpt, eller fôr og vekstforhold til de fostret Larvene konsistent mellom eksperimentering. I alle eksperimenter, inkludering av "blank" og "stukket" negative kontroller er avgjørende; den blanke kontrollen er en indikator på forurensning eller toksisitet av suspensjonen matrise (PBS-T eller Media buljong), og stukket kontroll etterligner effekten av nålen skaden på larvestadiet helse. Videre disse kontrollene normalisere noen biologisk variasjon mellom partier av larver, sikre reproduserbarhet og nøyaktighet mellom eksperimenter.
For injeksjon av G. mellonella larver, bruk av en 25 G nål anbefales som større gauge nåler kan forårsake overdreven blødning og skarpere mindre gauge nåler kan lett punktering tarmen av larvene, fører til larvestadiet dødelighet og falske positive Resultater. Konvensjonelle metoder for nål injeksjon vanligvis nakkens Larvene for hånd, noe som øker risikoen for nål skade. Ved å bruke pinsett for å nakkens larvene, er risikoen for nål Stick skade betydelig redusert ettersom hånden ikke er i umiddelbar nærhet til nålen på noe punkt under infeksjon. Alternativt kan larver bli immobilisert ved avkjøling. Men, kaldt sjokk ved 12 ° c i 15 min før infeksjon har blitt dokumentert å forsterke den medfødte immunresponsen til infeksjon. Derfor bør analysen av resultatene oppnås via kjøling nøye vurdere dens innflytelse24. Ved hjelp av vår teknikk, kan middels gjennomstrømming av injeksjon (2 − 3 larver per minutt) oppnås med bruker praksis; Dette kan sammenlignes med hastigheten til konvensjonell injeksjon fra vår erfaring (3 − 4 larver per min). Videre kan vår metode tilpasses for høyere gjennomstrømmings injeksjon ved å benytte en pedal styrt injeksjons plattform bestående av en infusjons pumpe med en engangssprøyte koblet til en 25 G sommerfugl kanyle.
Utarbeidelse av BCG Lux inokulum er basert på rask ESTIMERING av CFU bruke RLU av mykobakterieinfeksjoner kulturen20. I vår erfaring med buljong kultur, forholdet mellom RLU til CFU er 3:120, KONTRASTERENDE med BCG Lux vokser i G. mellonella der RLU til CFU forholdet er 5:120. Mykobakterieinfeksjoner celle aggregering eller ' klumper ' ofte sett i tette kulturer kan ha en innvirkning på RLU målinger, som klumper kan resultere i upålitelige bioluminesens målinger. Som sådan er bruken av klumpet seg mykobakterieinfeksjoner kultur for inokulum forberedelser ikke anbefalt. Men, tillegg av polysorbat 80 til vekst mediene minimerer celle klumper uten å endre veksten av BCG Lux. 16 noen mindre Cell klumper kan løses ved å vaske KULTUREN med PBS-T og er avgjørende for å utarbeide en nøyaktig INOKULUM bruker RLU som avlesning. Videre er PBS-T vask avgjørende for å fjerne eventuelle ekstracellulære virulens faktor utskilles i løpet av vekst. Mykobakterieinfeksjoner belastning og passasje nummer bør også tas i betraktning, da dette kan påvirke alvorlighetsgraden av mykobakterieinfeksjoner aggregering25. I alle tilfeller bør inokulum bli nummerert av CFU på 7H11 agar plater for å sikre at riktig CFU ble utarbeidet av bioluminesens måling. I tillegg bør RLU/CFU ratio in vivo bestemmes med nye Puerto Mosquito reporter eller aksjer, som forholdet vil trolig variere.
G. mellonella har flere fordeler fremfor konvensjonelle modeller av TB infeksjon, inkludert billigere erverv og vedlikeholdskostnader, enkel infeksjon og forskning gjennomstrømming, spesielt i kombinasjon med Puerto Mosquito stammer16. Mangelen på etiske begrensninger gir større utvalgsstørrelse (minimum 20 − 30 larver per gruppe) sammenlignet med pattedyr modeller, noe som gir større trygghet og pålitelighet i resultatene oppnådd26,27. Det finnes imidlertid en rekke begrensninger i bruken av G. mellonella som en infeksjons modell. Som virvelløse, de naturlig mangler adaptive immunitet gjør dem uegnet for antigenisiteten eller immunologiske studier10. Cellulære medfødte immunreaksjoner av G. mellonella består av en rekke hemocyte typer, og plasmatocytes og granulocytter har blitt rapportert å fungere på samme måte som pattedyr phagocytes (nøytrofile og makrofager)12. Imidlertid er rolle og mekanismer av disse celletyper fortsatt under preget, og direkte sammenlignende studier mellom pattedyr og insekt phagocytes er ennå ikke utført. Videre, mangelen på en kommenterte G. mellonella Genova hindrer analyse av verten respons på infeksjon, og dette er for tiden avhengig av gen ontologi analyse mot transcriptomic biblioteker av andre virvelløse dyr, for eksempel Drosophila melanogaster og Bombyx Mori28.
Som en TB infeksjon modell, G. mellonella har en lovende fremtid med sin evne til å utvikle granulom-lignende strukturer som svar på BCG Lux infeksjon16, som er avgjørende patofysiologiske kjennetegn på TB infeksjon og er en nøkkel funksjonen i utviklingen av LTBI. Fremtidig arbeid vil sikte på å karakterisere denne modellen med en spesiell interesse i dannelsen av granulom strukturer ved hjelp av referanse, klinisk og mutant MTB ISOLERER under CL3 forhold. I tillegg forventer vi at det kan også være nyttig for romanen anti-mykobakterieinfeksjoner agent screening, som en lignende G. mellonella modellen ble brukt for NTMs18, men dette gjenstår å bestemmes. Vedtakelsen av denne modellen har evnen til å redusere antall dyr som brukes innenfor TB forskningsmiljø, samtidig akselerere i vivo TB forskning produksjon under etisk mer akseptable forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av tilskudd fra bioteknologi og biologisk vitenskap Research Council (BBSRC), tildelt PRL og YL (BB/P001262/1), og National Center for utskifting, raffinement og reduksjon av dyr i forskning (NC3Rs) tildelt PRL, SMN, BDR og YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. , Geneva. (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
