Summary
تم تأسيس غاليريا ميلونيلا مؤخرا كنموذج للعدوى القابلة للاستنساخ ورخيصة ومقبولة أخلاقيا لمجمع السل الميكوباكتيريوم. هنا نحن وصف وبيان الخطوات المتخذة لإنشاء عدوى ناجحة من ج. ميلونيلا مع الميكوباكتيريوم بوفيس BCG لوكس.
Abstract
السل هو السبب العالمي الرئيسي لوفيات الأمراض المعدية، ويعتقد أن ما يقرب من ربع سكان العالم مصابون بالسل الميكوباكتيريوم. على الرغم من عقود من البحث، العديد من الآليات الكامنة وراء نجاح M. السل ككائن ممرض لا يزال يتعين التحقيق، وتطوير أكثر أمانا، وأكثر فعالية العقاقير المضادة للبكتيريا هناك حاجة ماسة لمعالجة ارتفاع و انتشار السل المقاوم للأدوية. ومع ذلك، فإن تطور أبحاث السل هو عنق الزجاجة من قبل نماذج عدوى الثدييات التقليدية التي هي مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، وتحديا أخلاقيا. في السابق أنشأنا يرقات الحشرة غاليريا ميلونيلا (عثة الشمع الأكبر) كنموذج جديد، قابل للتكرار، منخفض التكلفة، عالي الإنتاجية ومقبول أخلاقياً لأعضاء مجمع السل M. هنا نحن وصف الصيانة والإعداد، والعدوى من ج. ميلونيلا مع الميكوباكتريوم بوفيس BCG لوكس. باستخدام هذا النموذج العدوى، يمكن ملاحظة جرعة ميكونية تعتمد على الفوعة، وقراءة سريعة من العبء الفطري في الجسم الحي باستخدام قياسات الإضاءة الحيوية يمكن تحقيقها بسهولة وقابلة للاستنساخ. على الرغم من وجود قيود، مثل عدم وجود جينوم مشروح بالكامل للتحليل المستنسخ، يمكن إجراء تحليل الانطولضد ضد الحشرات المتشابهة وراثيا. كنموذج منخفض التكلفة وسريع ومقبول أخلاقيا ً للسل، يمكن استخدام G. ميلونيلا كشاشة مسبقة لتحديد فعالية الدواء وسميته، وتحديد الفيوية البكتيرية النسبية قبل استخدام الثدييات التقليدية نماذج. استخدام نموذج ج. ميلونيلا-البكتيريا الفطرية سيؤدي إلى انخفاض في عدد كبير من الحيوانات المستخدمة حاليا في أبحاث السل.
Introduction
السل هو تهديد كبير للصحة العامة في العالم مع 9 ملايين حالة جديدة سنويا و 1.5 مليون حالة وفاة1. وبالإضافة إلى ذلك، ويقدر أن ربع سكان العالم مصابون بالعامل المسبب للمرض، وهو مرض السل الميكوباكتيريوم (Mtb). ومن بين المصابين، سيصاب 5-10% بمرض السل النشط على مدى حياتهم. وعلاوة على ذلك، فإن ظهور وانتشار مقاومة للأدوية المتعددة ومقاومة للأدوية على نطاق واسع يشكل تهديدا خطيرا لمكافحة الأمراض، حيث أبلغ 123 بلدا عن حالة واحدة على الأقل من حالات الـ XDR1. ويتطلب علاج السل تناول ما لا يقل عن أربعة عقاقير مضادة للبكتيريا، توصف منها الإيزونيازيد والريفامبيتسين لمدة لا تقل عن ستة أشهر؛ غالباً ما يرتبط العلاج مع الآثار الجانبية المعقدة والسموم. الحماية من اللقاح الوحيد المرخص ضد السل، الميكوباكتريوم بوفيس عصية كالميت-غيرين (BCG)، هو المتغير2. إن الفهم غير الكامل لمسببات الإمراض التي تسببها السل يعوق بشكل كبير وضع استراتيجيات علاجية وتطعيمجديدة.
على مدى عقود كانت نماذج العدوى الحيوانية حيوية لأبحاث السل لفهم مسببات الأمراض الأساسية واستجابة المضيف للعدوى، وتقييم العوامل الجديدة المضادة للبكتيريا، والعلاجات المناعية والمرشحات لقاح جديد3، 4. ومع ذلك، فإن البحوث التي تستخدم نماذج العدوى الحيوانية من السل من الصعب جدا ً ً ً، حيث أن الإمراض وتطور عدوى السل معقدة، ولا يوجد نموذج واحد للأنواع الحيوانية يحاكي الطيف الكامل والسمات الهامة للمرض5 6. وعلاوة على ذلك، فإن التجارب على الحيوانات مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا للقيام بها وتتطلب تبريرا أخلاقيا كاملا. ومع ذلك، تم وصف نماذج العدوى الحيوانية للسل في الرئيسيات غير البشرية (مثل المكاك)، وخنازير غينيا، والأرانب، والماشية، والخنازير، والفئران وأسماك الحمار الوحشي، مع وجود حدود كل منها3،4. نموذج المورين هو النموذج الأكثر استخداما بسبب التكلفة، وتوافر خطوط أصيلة، وإمكانية تكرار العدوى ووفرة الكواشف المناعية. ومع ذلك، فإنها لا تشكل عادة الأورام الحبيبية المرتبطة بمناطق نقص الأكسجة التي هي سمة من سمات عدوى السل الكامنة (LTBI)6. والخنازير الغينية شديدة التأثر بعدوى الفيتامين المتري، مع الإصابة بأمراض الأمراض وتشكيل الورم الحبيبي المبكر على غرار تلك الموجودة لدى البشر، وتستخدم على نطاق واسع في اختبار اللقاحات؛ بعد عدم وجود الكواشف المناعية يعوق استخدامها كنموذج العدوى7. أسماك حمار وحشي مناسبة للفحص على نطاق واسع في الدراسات قبل السريرية في مرحلة مبكرة بسبب صغر حجمها، والتكاثر السريع والأدوات الوراثية المتقدمة، ولكنها مختلفة تشريحيا وفسولوجيا للبشر وغير عرضة فقط ل الميكوباكتيريوم المانوم العدوى3. النماذج الحيوانية تشبه عن كثب عدوى Mtb البشرية هي الرئيسيات غير البشرية (على سبيل المثال، المكاك)، لكنها مكلفة ولها اعتبارات أخلاقية وعملية كبيرة التي تحد إلى حد كبير من استخدامها8.
اليرقة الحشرات من العثة الشمع أكبر أو عثة العسل، غاليريا ميلونيلا ، أصبحت شعبية متزايدة كنموذج للعدوى لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية9، وكشاشة لمرشحين المخدرات المضادة للميكروبات رواية 10. ج. ميلونيلا هو نموذج لافقاري ناجح بسبب جهازه المناعي الفطري المتطور (المؤلف من دفاعات خلوية وفكاهية) الذي يتقاسم درجة عالية من التشابه الهيكلي والوظيفي مع نسبة الفقاريات11 . وهذا يشمل آليات المناعة مثل البلوسيات من مسببات الأمراض من قبل الخلايا الهيموسيد (وظيفيا مماثلة لبلبلة الثدييات والعدلات)12،13، وإنتاج وتداول الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) و البروتينات الشبيهة بالتكامل داخل الهيمولم (مشابهة لدم الثدييات) من G. ميلونيلا11. مزاياأخرى 9،14،15 من اليرقات G. ميلونيلا كنموذج تشمل 1) حجمها الكبير (20-30 ملم) الذي يسمح لسهولة التلاعب والعدوى، فضلا عن جمع الأنسجة و الهيمولم للتحاليل، 2) صيانة سهلة في 37 درجة مئوية، متوافقة لدراسة مسببات الأمراض البشرية، 3) عدوى دقيقة عن طريق الحقن دون الحاجة إلى التخدير، 4) فعالية من العوامل المضادة للميكروبات يمكن تقييماستخدام أقل المخدرات للتقييم، 5) عدم وجود القيود الأخلاقية مقارنة باستخدام الثدييات، 6) يمكن استخدام أحجام المجموعات الكبيرة مقارنة بالنماذج الحيوانية التي تسمح بقدر أكبر من الاستنساخ، و 7) يلزم أوقات أقصر لتجارب العدوى.
في دراسة حديثة، أظهرنا أن G. ميلونيلا يمكن استخدامها كنموذج عدوى جديدة لدراسة مسببات الأمراض من قبل الإضاءة الحيوية M. بوفيس BCG لوكس، وهي نسخة معدلة وراثيا من سلالة اللقاح وعضو 16 ةيلابةةيلاف ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلا في حين تم سابقا استخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى للبكتيريا الفطرية غير السلية (NTM), أساسا M. المارينيوم وخراج الميكوباكتيريوم17,18, تقتصر الدراسات باستخدام MTBC إلى أن من لي وآخرون16. سلالات ميكونجتيرية غير مسببة للأمراض، والتي يمكن استخدامها عند مستوى الاحتواء (CL) 2 كبديل لMtb، توفر مزايا السلامة والتطبيق العملي على البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض. بعد العدوى مع BCG لوكس، تبدأ اليرقات في تطوير هياكل تشبه الورم الحبيبي المبكر ، والتي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة قيمة في دور المناعة الفطرية في إنشاء عدوى السل16. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النموذج البسيط من العدوى اللافقارية ينطوي على إمكانية توفير تقييم سريع ومنخفض التكلفة وموثوق به لمسببات مرض السل يتضمن تحديًا خاضعًا للرقابة وتكرارًا متعددًا لإمكانية التكاثر. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج ينطوي على إمكانية استخدامه لفحص المرشحين الرواية للأدوية واللقاحات المضادة للسل في مرحلة مبكرة من التطوير، مما يقلل من العدد الإجمالي للحيواناتهم في التجارب. كما أن القدرة على قياس التغيرات في هيكل المضيف والممرض، والنسخ، والبروتيتومي لتحديد أهداف المخدرات وتقييم آليات عمل العقاقير الجديدة واللقاحات العلاجية، هي أيضاً مفيدة.
هنا نحن نوصف البروتوكولات التجريبية لإعداد الإنارة الحيوية M. بوفيس BCG لوكس inoculum وG. ميلونيلا اليرقات للعدوى الفطرية، فضلا عن تحديد كل من اليرقات وmycobacterial البقاء على قيد الحياة استجابة للعدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: جميع الأعمال الموصوفة أدناه يجب القيام بها في مختبر CL2 ضمن خزانة السلامة الميكروبيولوجية من الفئة 2 (MSC) باتباع المبادئ التوجيهية المحلية للصحة والسلامة.
1. إعداد M. بوفيس BCG لوكس للعدوى
- تذويب الجلسرين المجمد 1.2 مل (15%) الأسهم من M. بوفيس BCG لوكس, سلالة لقاح مونتريال تحولت مع pSMT1 plasmid المكوك تحمل الجينات لوكساب من فيبريو هارفيي ترميز إنزيم لوسيفيراز19.
- التلقيح 15 مل من مرق ميدلبروك 7H9 تحتوي على 0.2٪ الجلسرين، 10٪ الزلال، سكر العنب، الكاتالاز (ADC) التخصيب و 50 ميكروغرام / مل hygromycin مع a defrosted 1.2 مل aliquot من BCG لوكس، في المسمى 250 مل Erlenmeyer قارورة.
- ضع القارورة في حاوية أمان بيولوجي مختومة واحضنها عند 37 درجة مئوية في حاضنة الهزاز المداري بسرعة 220 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة (أو حتى تصل الثقافة إلى مرحلة النمو في منتصف السجل).
- تحقق من نمو ثقافة BCG لوكس عن طريق إعداد 1:10 التخفيفات من الثقافة في أنابيب مقياس الإنارة باستخدام الفوسفات العازلة المالحة (PBS، pH 7.4، 0.01 M الفوسفات العازلة، 0.0027 M كلوريد البوتاسيوم و 0.137 كلوريد الصوديوم M) في مكررة. دوامة، وتحميل أنابيب مقياس الإنارة في مقياس الإنارة وقياس الإضاءة الحيوية (وحدة الإضاءة النسبية [RLU]/مل) باستخدام ن-ديكل ألدهيد كركيزة (1٪ V / v في الإيثانول المطلق)20.
ملاحظة: تم تحديد نسبة وحدات تشكيل RLU /مستعمرة (CFU) سابقا لتكون 3:1 عندما نمت BCG لوكس في المختبر في ميدلبروك 7H9 مرق20. - طارد ة الثقافة في 2175 x ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لpellet الخلايا ونبذ supernatant في مطهر مناسب مع النشاط الميكوباكتيري المعروف. تخلص من جميع النفايات الثقافية مع المطهرات المناسبة للبكتيريا الفطرية باتباع المبادئ التوجيهية المحلية.
- غسل بيليه الخلية مرتين في PBS تحتوي على 0.05٪ بوليسوربات 80 (PBS-T) لمنع التكتل البكتيري.
- بعد الغسيل النهائي، والنفايات decant supernatant، إعادة تعليق بيليه الخلية mycobacterial في PBS-T وتخفيف تعليق mycobacterial إلى كثافة الخلايا المطلوبة باستخدام قياسات RLU.
- إعداد عشرة أضعاف التخفيفات التسلسلية للتلقيح في لوحات 24 جيدا باستخدام PBS-T. لوحة من 10 ميكرولتر على ميدلبروك 7H11 لوحات أجار (0.5٪ الجلسرين، 50 ميكروغرام / مل hygromycin، 10٪ حمض الأوليك، الزلال، سكر العنب، catalase [OADC]) في تكرار لتعداد الكحول الوحدة.
2. إعداد اليرقات ج. ميلونيلا
- شراء اليرقات النجمة الأخيرة من المصادر المناسبة والحفاظ على اليرقات في الظلام عند 18 درجة مئوية عند الوصول واستخدامها في غضون أسبوع واحد من الشراء. وبدلاً من ذلك، يمكن تربية اليرقات ذاتياً وفقاً لبروتوكول جوجوا وآخرون21. لليرقات التي تم شراؤها، قم بتجاهل أي يرقات ميتة أو تغير لونها أو جروت قبل التخزين.
ملاحظة: اليرقات الجرو هي القابلة للتمييز بشكل مورفولوجي إلى يرقات النجم الأخير. - تحديد واختيار يرقات صحية للتجريب، استناداً إلى لون كريم موحد مع القليل من اللون أو بدون (الميلانزين)، والحجم (2-3 سم في الطول)، والوزن (حوالي 250 ملغ)، وعرض مستوى عال من الحركة، وامتلاك القدرة على الحق أنفسهم عندما تحولت.
- عد بعناية اليرقات الصحية (20-30 لكل مجموعة) في طبق بيتري (94/15 ملم) تصطف مع طبقة من ورقة التصفية (94/15 ملم) باستخدام ملاقط حادة للحد من التلوث وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى الاستخدام.
3. إصابة ج. ميلونيلا مع لوكس بكج
- تقليل الفوضى داخل MSC للحد من خطر التلوث وإصابة إبرة عصا.
- قم بتحضير منصة الحقن عن طريق تسجيل ورقة تصفية دائرية (94 مم) على سطح سطح مستوٍ. يمكن استخدام الأسطح الناعمة أو الصلبة وهي تعتمد اعتماداً كلياً على تفضيل المستخدم، مثل أغطية صندوق الماصة أو إسفنجة النايلون.
- قم بتعقيم ميكروحقنة 25 ميكرولتر (25 جرام) عن طريق تصنيف 3 مجلدات من الإيثانول بنسبة 70% وشطف هاون آخر مع 3 مجلدات من PBS-T المعقمة.
- استنشق 10 ميكرولتر من BCG لوكس إينوكوم (أعدت في القسم 1) أو PBS-T في ميكروحقن 25 ميكرول معقم. استخدام حقنة منفصلة للسيطرة السلبية PBS-T.
ملاحظة: إعادة تعليق الإنوكوم BCG لوكس بعد 10 حقن لضمان تعليق خلية موحدة. - استخدام ملاقط لالتقاط يرقة واحدة ووضعها على منصة الحقن.
- على المنصة، الوجه اليرقة على ظهره وتعطيل عن طريق تأمين الرأس والذيل مع ملاقط. حدد مكان آخر proleg الأيسر العد التنازلي من رأس اليرقة وبعناية إدراج طرف الإبرة (5-6 ملم) في زاوية 10-20 درجة إلى المستوى الأفقي.
ملاحظة: ملاقط قصيرة وضيقة تسمح لسهولة تجميد مع الحد الأدنى من الإجهاد اليرقات. إيلاء الاهتمام لا لاختراق أكثر من التي قد ثقب القناة الهضمية وتسبب عدم BCG لوكس الميلانزين محددة أو الموت. - عد اليرقات المصابة في طبق بيتري مبطن بطبقة من ورق التصفية، يمكن لطبق واحد من بيتري عيار 90 ملم أن يستوعب ما يصل إلى 30 يرقة.
- قم بتخزين طبق بيتري الذي يحتوي على اليرقات في صندوق داكن تنفيس أو غير مختوم داخلالحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون 2.
4. رصد بقاء ج. ميلونيلا بعد العدوى
- على مدى دورة الوقت، ورصد بقاء اليرقات كل 24 ح. تعتبر اليرقات ميتة عندما تفشل في التحرك ردا على اللمس.
5. قياس في فيفو عبء من BCG لوكس في ج. ميلونيلا
- في كل نقطة زمنية، حدد عشوائيا خمس يرقات مصابة أعدت سابقا في القسم 3 وتعقيم بلطف الأسطح اليرقات باستخدام مسحات برعم القطن غارقة في 70٪ الإيثانول.
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة عندما التجانس اليرقات الطلاء لتعداد CFU mycobacterial كما اليرقات غير المعقمة يمكن أن يؤدي إلى التلوث. - ضع اليرقات بشكل فردي في أنابيب مصفوفة التثليل 2 مل التي تحتوي على 800 ميكرولتر من PBS المعقمة.
- تجانس اليرقات باستخدام المجانسة لمدة 60 في 6.0 م / س.
- طرد مركزي في أنابيب التخلص في 3500 x ز لمدة 5 ق لإزالة التجانس من الأغطية، وdecant بعناية التجانس في أنابيب مقياس اللمعان المعقمة بشكل فردي.
ملاحظة: بالنسبة لتعداد CFU (الخطوة 5.7)، تأكد من حجز 100 ميكرولتر من التجانس في أنبوب تفاعل معقم سعة 1.5 مل. - استرداد أي التجانس المتبقي ة بغسل أنابيب مصفوفة التسييل مع 1 مل من PBS-T والماصة في أنابيب مقياس الإضاءة المقابلة.
- دوامة أنابيب مقياس الإنارة وقياس الإضاءة الحيوية للمتجانسات المذكورة سابقا في الخطوة 1.4.
- إعداد عشرة أضعاف التخفيفات التسلسلية للتجانس في لوحات ثقافة 24 جيدا باستخدام PBS-T. لوحة من 10 ميكرونلتر من التخفيف على ميدلبروك 7H11 لوحات أجار تحتوي على 0.5٪ الجلسرين، 50 ميكروغرام / مل hygromycin، 10٪ OADC و 20 ميكروغرام / مل بيبيراسيلين، لتحديد نسبة RLU / CFU من BCG لوكس التالية في العدوى الحية.
ملاحظة: بيبيراسيلين يلغي الأصلي ج. ميلونيلا ميكروبيوتا مع الحد الأدنى من تثبيط النمو من BCG لوكس16.
6 - التحليل الإحصائي
- رسم منحنى البقاء على قيد الحياة كابلان-ماير باستخدام البيانات التي تم جمعها وتنفيذ اختبار مانتل-كوكس (سجل رتبة) لتحديد أهمية النتيجة، حيث * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001, و ****p < 0.0001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا نقدم البيانات التمثيلية التي يمكن الحصول عليها باستخدام G. ميلونيلا - نموذج العدوى BCG لوكس وتسليط الضوء على فوائد ج. ميلونيلا كنموذج للعدوى لأعضاء MTBC (الشكل 1). ويرد في الشكل 2موجز للإجراءات التجريبية التي تحتوي على نقاط تقنية رئيسية.
الشكل 1: فوائد ج. ميلونيلا كنموذج للعدوى. وقد تم تكييف هذا الرقم من كافاناغ وشيهان22. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط الإجراءات التجريبية. (أ) صيانة وإعداد G. ميلونيلا للعدوى مع M. بوفيس BCG لوكس. (ب) إعداد ثقافة BCG لوكس والتلقيح للإصابة. (ج) عدوى ج. ميلونيلا مع لوكسبكغ. (د) قياس الفوعة والعبء الحي لـ BCG lux في يرقات ج. ميلونيلا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لوحظت جرعة BCG لوكس تعتمد على الفوعة في يرقات ج. ميلونيلا على مدى فترة حضانة 96 ح (الشكل3),والجرعة المميتة المطلوبة لوفيات اليرقات 50٪ (LD50)تم تحديد أن تكون 1 X 107 CFU. وكان توزيع البقاء على قيد الحياة الذي يعكس الفوعة من جرعات لوكس BCG اختبار مختلفة إلى حد كبير (p < 0.0001). مجموعات التحكم حقن مع جرعة 10 لتر من PBS-T أو تلك ببساطة وخز الإصابات إبرة محاكاة, لم تؤثر على صحة اليرقات أو يؤدي إلى زيادة في معدل الوفيات كما هو محدد من خلال الفحوصات المراقبة على الحركة والتكميل في نقاط زمنية مختلفة.
الشكل 3: منحنى بقاء كابلان مئير من ج. ميلونيلا استجابة لتطعيم متفاوتة من M. بوفيس BCG لوكس. اليرقات الصحية (ن ≥ 10 لكل مجموعة)، كانت مصابة بجرعات متفاوتة من BCG لوكس. وقد تم احتضان اليرقات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ورصدها من أجل البقاء على قيد الحياة كل 24 ساعة لمدة تصل إلى 96 ساعة. تم حقن المجموعة غير المصابة مع PBS، وأظهرت مجموعة وخز (إدخال إبرة فقط) تأثير إصابة إبرة على صحة اليرقات. يتم عرض وسائل تجربتين مستقلتين، مع فاصل ثقة 95%، ممثلة كخطوط منقط في اللون المقابل للإنوكوم. وقد تم تكييف هذا الرقم من Li et al.16. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
جميع اليرقات المصابة بBCG lux تظهر تغيرات فسيولوجية مع مرور الوقت، وبالنسبة لليرقات المصابة بجرعة CFU 2 x 107 من BCG lux، لوحظ تربيع خط اليرقات اليرقي من 48 ساعة بعد العدوى (pi)، ومنهجية لوحظ تمنية من 96 ح بي (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، انخفضت حركة اليرقات مع شدة التكميل وفقدت قدرة اليرقات على pupate عند العدوى بالمقارنة مع الضوابط غير المصابة.
الشكل 4: ميلنة من ج. ميلونيلا ردا على العدوى مع M. بوفيس BCG لوكس. وقد أصيبت اليرقات صحية في 0 ح مع 2 X 107 CFU جرعة من BCG لوكس. في 48 ح و 96 ح بي، لوحظ الميلانز على طول خط الظهر اليرقي والميلانز المنهجي، على التوالي.
تم تحديد بقاء BCG لوكس داخل يرقات G. ميلونيلا على مدى 2 أسابيع من خلال قياس الإضاءة الحيوية من اليرقات المتجانسات. أدت العدوى بجرعة CFU 1 x 107 من BCG lux إلى انخفاض أولي للإضاءة الحيوية BCG lux من 0-72 h pi. ومع ذلك، من 72-144 ح بي، استقر تلاؤم بالحيوية من BCG لوكس، مما يدل على وجود عدوى مستمرة (الشكل5).
الشكل 5: في الجسم الحي عبء M. بوفيس BCG لوكس في G. ميلونيلا كمي باستخدام الإضاءة الحيوية (وحدة الضوء النسبي، RLU / مل) على مدى دورة لمدة أسبوعين. وقد أصيبت اليرقات الصحية (ن = 30) بجرعة CFU 1 x 107 من BCG lux. في الجسم الحي تم تحديد حجم العبء عن طريق التجانس خمس يرقات في كل نقطة زمنية (0، 24، 48، 72، 96، 168، 336 ح)، وقياس الإضاءة الحيوية للتجانس. يتم عرض وسائل ثلاث تجارب مستقلة، وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط. وقد أعيد طبع هذا الرقم من Li et al.16. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كما تم تحديد القياس الكمي السريع والقابل للتكرار للنمو الفطري في الجسم الحي في هذه الدراسات عن طريق قياس الإضاءة الحيوية، وينبغي أيضا تحديد نسبة RLU وCFU في الجسم الحي. في نظام العدوى الخاص بنا، تراوحت نسبة في الجسم الحي من RLU و CFU من 2:1-5:1،بمتوسط 4:1 على مدى دورة الوقت 168-H (الشكل 6).
الشكل 6: تحديد نسبة RLU/CFU في الجسم الحي من M. بوفيس BCG لوكس في G. ميلونيلا. وقد أصيبت اليرقات الصحية (ن = 30) بجرعة CFU 1 x 107 من BCG lux. في كل نقطة زمنية (0، 24، 96 و 168 ساعة)، تم تجانس أربع يرقات مصابة/مراقبة (PBS-T)، وتم قياس التجانسات للإضاءة الحيوية ومطلية على 7H11 agar لتعداد الكفو التهم. يتم عرض وسائل تجربتين مستقلتين وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تأسيس استخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى لعدد من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية لدراسة الفوعة، والتفاعل بين المضيف وممرض، وكشاشة لعلاجات جديدة10،22. وتستند المناقشة التالية على الإجراء التجريبي لاستخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى MTBC.
صحة اليرقات الساذجة قبل التجريب يمكن أن يكون لها تأثير كبير على نتيجة التجربة. ولذلك، من الضروري إزالة أي يرقات مشوهة و/أو مصابة عند الوصول وعدم استخدامها في أي تجربة. إذا تم العثور على عدد كبير من اليرقات ميتة داخل نفس الحاوية عند الوصول، فمن المستحسن تجاهل الدفعة كما العدوى الموجودة من قبل قد يكون سبب الوفاة. عند الإمكان إجراء تجارب باستخدام اليرقات أقرب إلى يوم الشراء / الوصول. قبل الاستخدام ضمان لتخزين اليرقات في 18 درجة مئوية لمنع الجرو وتعظيم عدد اليرقات المتاحة للتجريب. يمكن استخدام يرقات صحية لمدة تصل إلى 7 أيام بعد الولادة / الشراء. بعد العدوى ، تأكد من إزالة أي يرقات ميتة من طبق بيتري ، ولأسباب غير معروفة حتى الآن ، يبدو أن وجود اليرقات الميتة يزيد من معدل الوفيات في عينة السكان. بالنسبة لمستخدمي اليرقات ذاتية التربية، من المهم أن تكون على بينة من التغير البيولوجي بالمقارنة مع اليرقات المشتراة، لأن التباين في النظام الغذائي وظروف النمو يمكن أن يكون له تأثير على مناعة اليرقات21،23. ويمكن الحد من التغيرات بين التجارب عن طريق الحفاظ على المصدر، إذا تم شراؤها، أو تغذية وظروف النمو لليرقات التي تربى متسقة بين التجريب. وفي جميع التجارب، من الضروري إدراج عناصر تحكم سلبية "فارغة" و"مُخزية"؛ السيطرة الفارغة هي مؤشر على التلوث أو السمية لمصفوفة التعليق (PBS-T أو مرق الوسائط)، والسيطرة وخز يحاكي تأثير إصابة إبرة على صحة اليرقات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الضوابط تطبيع أي اختلاف بيولوجي بين دفعات من اليرقات، وضمان إعادة الاستنساخ والدقة بين التجارب.
لحقن يرقات G. ميلونيلا، ينصح باستخدام إبرة 25 G كما الإبر مقياس أكبر يمكن أن يسبب نزيف مفرط وأدق أصغر مقياس الإبر يمكن بسهولة ثقب القناة الهضمية لليرقات، مما يؤدي إلى وفيات اليرقات وإيجابية كاذبة نتائج. الطرق التقليدية لحقن الإبرة عادة ما يتم شل اليرقات باليد، مما يزيد من خطر إصابة الإبرة. باستخدام ملاقط لشل حركة اليرقات ، يتم تقليل خطر إصابة عصا الإبرة بشكل كبير حيث أن اليد ليست على مقربة من الإبرة في أي وقت أثناء العدوى. بدلا من ذلك، يمكن أن تكون اليرقات متوقفة عن الحركة عن طريق التبريد. ومع ذلك، تم توثيق صدمة باردة عند 12 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل العدوى لتعزيز الاستجابة المناعية الفطرية للعدوى. ولذلك، فإن تحليل النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق التبريد ينبغي أن تنظر بعناية في تأثيرها24. باستخدام تقنيتنا، يمكن تحقيق الإنتاجية المتوسطة للحقن (2-3 يرقات في الدقيقة) مع ممارسة المستخدم؛ وهذا يماثل سرعة الحقن التقليدي من تجربتنا (3-4 يرقات في الدقيقة). وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف أسلوبنا لحقن أعلى الإنتاجية باستخدام دواسة تعمل منصة حقن تتألف من مضخة ضخ مع حقنة المتاح متصلة قنية فراشة 25 G.
ويستند إعداد الإنكوليوم BCG لوكس على التقدير السريع من CFU باستخدام RLU من ثقافة mycobacterial20. في تجربتنا مع ثقافة المرق، ونسبة RLU إلى CFU هو 3:120،على النقيض من BCG لوكس تنمو في G. ميلونيلا حيث نسبة RLU إلى CFU هو 5:120. يمكن أن يكون لتجميع الخلايا المُجراثيم أو "التكتل" الذي يُرى عادة في الثقافات الكثيفة تأثير على قياسات RLU، حيث يمكن أن يؤدي التكتل إلى قياسات الإضاءة الحيوية غير الموثوقة. على هذا النحو، لا ينصح باستخدام ثقافة متكونية متكتل لإعداد التلقيح. ومع ذلك، فإن إضافة بوليسوربات 80 إلى وسائل الإعلام النمو يقلل من تكتل الخلايا دون تغيير نمو BCG لوكس. 16 يمكن حل أي تكتل خلية ثانوية عن طريق غسل الثقافة مع PBS-T وهو أمر حيوي لإعداد تطعيم دقيق باستخدام RLU كقراءات. وعلاوة على ذلك، فإن غسل PBS-T أمر حيوي لإزالة أي عامل الفوعة خارج الخلية يفرز أثناء النمو. وينبغي أيضا أن تؤخذ في الاعتبار سلالة الميبكتيرية وعدد المرور، وهذا يمكن أن يؤثر على شدة تراكم mycobacterial25. في جميع الحالات، يجب تعداد الملقا بواسطة CFU على لوحات الغار 7H11 لضمان أن CFU الصحيح تم إعداده عن طريق قياس الإضاءة الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تحديد نسبة RLU/CFU في الجسم الحي مع مراسل أو مخزونات جديدة مضيئة بيولوجيا، حيث أن النسبة ستختلف على الأرجح.
G. ميلونيلا يحمل العديد من المزايا على النماذج التقليدية للعدوى السل، بما في ذلك أرخص تكاليف الاستحواذ والصيانة، وسهولة العدوى وإنتاجية البحوث، وخاصة في تركيبة مع سلالات الإضاءة الحيوية16. ويتيح عدم وجود قيود أخلاقية زيادة حجم العينة (الحد الأدنى من 20-30 يرقة لكل مجموعة) بالمقارنة مع نماذج الثدييات، مما يعطي ثقة وموثوقية أكبر في النتائج التي تم الحصول عليها26،27. ومع ذلك، هناك عدد من القيود في استخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى. كما اللافقاريات، فإنها تفتقر بطبيعة الحال المناعة التكيفية مما يجعلها غير مناسبة للدراسات المضادة للجينات أو المناعية10. الاستجابات المناعية الفطرية الخلوية من G. ميلونيلا تتألف من عدد من أنواع الهيموسيتيات، وقد تم الإبلاغ عن خلايا البلازما والمحببة لتعمل على غرار الخلايا الباغوسية الثدييات (العدلات والضامة)12. ومع ذلك، لا يزال دور وآليات هذه الأنواع من الخلايا تحت الخصائص، والدراسات المقارنة المباشرة بين الثدييات والحشرات الفاتسية لم يتم إجراؤها بعد. وعلاوة على ذلك، فإن عدم وجود جينوم مشروح من ج. ميلونيلا يعوق تحليل استجابة المضيف للعدوى، ويعتمد ذلك حالياً على تحليل الأنتولوجي الجيني ضد المكتبات المستنسخة لللافقاريات الأخرى، مثل دروسوفيلا الميلانوجاستر وبومبيإكس موري28.
كنموذج للعدوى بالسل، يحمل G. ميلونيلا مستقبلًا واعدًا بقدرته على تطوير هياكل تشبه الورم الحبيبي استجابةً للعدوى 16 التي تعتبر من السمات المرضية الفسيولوجية الحيوية للعدوى بالسل وهي مفتاح في تطوير LTBI. وسيهدف العمل المستقبلي إلى توصيف هذا النموذج باهتمام خاص بتشكيل هياكل شبيهة بالورم الحبيبي باستخدام عزلات Mtb مرجعية وسريرية ومتحولة في ظل ظروف CL3. بالإضافة إلى ذلك, ونحن نتوقع أنه قد يكون من المفيد أيضا لرواية مكافحة البكتيريا وكيل الفرز, كما تم استخدام نموذج G. ميلونيلا مماثلة لNTMs18, ولكن هذا لا يزال يتعين تحديد. وينطوي اعتماد هذا النموذج على القدرة على الحد بشكل كبير من عدد الحيوانات المستخدمة في أوساط البحوث المتعلقة بالسل، مع تسريع إنتاج البحوث في مجال السل في الجسم الحي في ظل ظروف أكثر قبولاً من الناحية الأخلاقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا المشروع بمنح من مجلس بحوث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC)، التي منحت لPRL وYL (BB/P001262/1)، والمركز الوطني لاستبدال الحيوانات في البحوث وصقلها والحد منها (NC3Rs) الممنوحة لـ PRL، SMN, BDR, and YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. , Geneva. (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
