Summary
Galleria mellonella son zamanlarda Mycobacterium tüberküloz kompleksi için reproducible, ucuz ve etik olarak kabul edilebilir bir enfeksiyon modeli olarak kurulmuştur. Burada, Bioluminesans Mycobacterium bovis BCG Lux ile G. mellonella 'nın başarılı enfeksiyonunu kurmak için alınan adımları tarif ediyoruz ve gösteriyoruz .
Abstract
Tüberküloz, bulaşıcı hastalık ölümlerinin önde gelen küresel nedenidir ve dünyanın nüfusu yaklaşık dörtte biri Mycobacterium tüberkülozile enfekte olduğuna inanılmaktadır. Onlarca yıl süren araştırmaya rağmen, M. tüberkülozunun patojenik bir organizma olarak başarısının arkasındaki mekanizmalar incelenmeye devam ediyor ve daha güvenli, daha etkili antimikobakteriyel ilaçların geliştirilmesi, yükselmenin üstesinden gelmek için acilen gerekli ilaç geçirmez tüberküloz yayılması. Ancak, tüberküloz araştırmalarının ilerlemesi pahalı, zaman alıcı ve etik açıdan zorlu olan geleneksel memeliyen enfeksiyon modelleri ile darboğazlıdır. Daha önce M. tüberküloz kompleksi üyeleri için bir roman, tekrarlanabilir, düşük maliyetli, yüksek verim ve etik olarak kabul edilebilir enfeksiyon modeli olarak böcek Galleria mellonella (büyük balmumu güvesi) larvaları kurduk. Burada Bioluminesans Mycobacterium bovis BCG Lux ile G. mellonella 'nın bakım, hazırlama ve enfeksiyonunu tarif ediyoruz . Bu enfeksiyon modelini kullanarak, Mikobakteriyel doz bağımlı virülans görülebilir, ve biyoluminesans ölçümleri kullanarak in vivo Mikobakteriyel yükü hızlı bir okuma kolayca ulaşılabilir ve yeniden oluşturulabilir. Transcriptomik analiz için tam açıklamalı genom eksikliği gibi sınırlamalar mevcut olsa da, genetik olarak benzer böceklere karşı ontolojik analiz yapılabilir. Tüberküloz için düşük maliyetli, hızlı ve etik olarak kabul edilebilir bir model olarak, G. mellonella ilaç etkinliğini ve toksisitesi belirlemek için bir ön ekran olarak kullanılabilir ve konvansiyonel memelilerin kullanımından önce karşılaştırmalı Mikobakteriyel virülans belirlemek için Model. G. mellonella-mycobakteriler modelinin kullanımı, tüberküloz araştırmalarında Şu anda kullanılan hayvanların önemli sayıda azalmasına yol açacaktır.
Introduction
Tüberküloz (TB) yıl başına 9.000.000 yeni vaka ve 1.500.000 ölüm1ile küresel kamu sağlığı için önemli bir tehdittir. Buna ek olarak, dünya nüfusunun dörtte birinin hastalığın etken maddesi, Mycobacterium tüberküloz (MTB) ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir. Virüslü nüfus arasında, 5 − 10% ömrü boyunca aktif TB hastalığı gelişecektir. Ayrıca, çok ilaç dirençli (MDR) ve kapsamlı-ilaç (XDR) dirençli MTB ortaya çıkması ve yayılması, 123 ülkeleri en az BIR XDR vaka1raporlama ile hastalık kontrolü için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. TB tedavisi, en az dört Anti-Mikobakteriyel ilaçların bir kokteyli gerektirir, hangi izoazid ve rifampisin altı ay minimum süre için reçete edilir; tedavi genellikle karmaşık yan etkileri ve toksisite ile ilişkilidir. TB karşı tek lisanslı aşı koruma, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), değişken2. Tüberküloz patogenezinin tamamlanmamış bir anlayışı, yeni terapötik ve aşılama stratejilerinin gelişmesini önemli ölçüde engelliyor.
Onlarca yıl boyunca hayvan enfeksiyonu modelleri tüberküloz araştırmalarında enfeksiyona temel patogenezi ve ev sahibi tepkisini anlamaları ve yeni anti-Mikobakteriyel ajanlar, immüno-terapi ve aşı adaylarının3' ü değerlendirmek için hayati önem taşıyor. 4. ancak, TB enfeksiyonunun patogenezi ve ilerlemesi karmaşıktır ve hastalığın tam spektrumunu ve önemli özelliklerini taklit eden tek bir hayvan modeli olmadığı için, tüberkülozdaki hayvan enfeksiyonu modellerini kullanarak araştırma oldukça zordur5 ,6. Ayrıca, hayvan deneyleri pahalı, zaman alıcı taahhüt ve tam etik gerekçe gerektirir. Yine de, TB hayvan enfeksiyonu modelleri (örneğin, Macaques), kobay, tavşan, sığır, domuz, fareler ve zebrafish insan olmayan primatlar, her biri kendi sınırlamaları3,4sahip açıklanmıştır. Duvar modeli, maliyet, doğuştan hatları, enfeksiyon ve immünolojik reaktifler bolluğu tekrarlanabilirlik mevcudiyeti nedeniyle en sık kullanılan modeldir. Ancak, genellikle gizli Tüberküloz enfeksiyonu (LTBI)6karakteristik olan hipoksi alanları ile ilişkili granülomlar oluşturmaz. Gine domuzları MTB enfeksiyonuna son derece hassastır, patolojiler ve insanlarda benzer erken Granülom oluşumu ile, ve aşı testinde yaygın olarak kullanılır; henüz immünolojik reaktiflerin eksikliği bir enfeksiyon modeli olarak kullanımını engelliyor7. Zebrafish küçük boyutu, hızlı üreme ve gelişmiş genetik araçlar nedeniyle erken evre preklinik çalışmalarda büyük ölçekli tarama için uygundur, ancak anatomik ve fizyolojik olarak insanlara farklı ve sadece duyarlı Mycobacterium Marinum enfeksiyonu3. İnsan MTB enfeksiyonu en yakından benzeyen hayvan modelleri insan olmayan primatlar (örn., macaque), ama pahalı ve önemli ölçüde kullanımı sınırlar ciddi etik ve pratik hususlar var8.
Büyük balmumu güvesi veya petek güve böcek larva,Galleria mellonella, bakteriyel ve mantar patojenler çeşitli için bir enfeksiyon modeli olarak giderek daha popüler hale gelmiştir9, ve yeni antimikrobiyal uyuşturucu adayları için bir ekran olarak 10. G. mellonella onun sofistike doğuştan gelen bağışıklık sistemi nedeniyle başarılı bir omurgasız model (hücresel ve humoral savunma oluşur) bu vertebratlar için yapısal ve işlevsel benzerlik yüksek ölçüde hisse11 . Bu hemanositler tarafından patojenlerin phagositoz gibi bağışıklık mekanizmaları içerir (işlevsel olarak memeliler makrophaj ve nötrofiller benzer)12,13, anti-mikrobiyal peptidler üretim ve dolaşım (amper) ve G. mellonella11' in hemolymph içinde (mammalin kanına benzer) tamamlayıcı benzeri proteinler. Diğer avantajları9,14, G. mellonella larvaları bir model olarak15 dahil) onların büyük boyutu (20 − 30 mm) kolay manipülasyon ve enfeksiyon sağlar, yanı sıra doku toplama ve analizler için hemolymph, 2) 37 °C ' de kolay bakım, insan patojenleri okumak için uyumlu, 3) anesteziye gerek duymadan enjeksiyon ile hassas enfeksiyon, 4) antimikrobiyal ajanların etkinliği, değerlendirme için daha az ilaç kullanılarak değerlendirilebilir, 5) eksikliği memelilerin kullanımına kıyasla etik kısıtlamalar, 6) büyük grup boyutları, daha fazla yeniden Üretilebilirlik sağlayan hayvan modellerine göre kullanılabilir ve 7) enfeksiyon deneyleri için daha kısa saatler gereklidir.
Yeni bir çalışmada, biz G. mellonella Bioluminesans M. Bovis BCG Lux, aşı gerilme ve üye genetiği değiştirilmiş versiyonu tarafından enfeksiyonun patogenezi okuyan için bir yeni enfeksiyon modeli olarak kullanılabilir göstermiştir MTB kompleksi (mtbc)16. G. mellonella daha önce tüberküloz olmayan mikobakteriler (NTM) için bir enfeksiyon modeli olarak kullanıldığında, özellikle M. Marinum ve Mycobacterium abscessus17,18, mtbc kullanarak çalışmalar sınırlıdır Li ve al.16. MTB için bir vekil olarak koruma SEVIYESINDE (CL) 2 ' de kullanılabilecek Bioluminesans olmayan patojenik Mikobakteriyel suşlar, patojenik mikobakteriler üzerinde güvenlik ve pratiklik avantajlarını sunar. BCG Luxile enfeksiyonun ardından LARVALARı, TB enfeksiyonu16' nın kurulması sırasında doğuştan gelen dokunulmazlığın rolü ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilen erken granülom benzeri yapıları geliştirmeye başlar. Buna ek olarak, bu basit omurgasız enfeksiyon modeli, kontrol edilen zorluk ve yeniden üretilebilirlik için birden çok çoğaltır içeren TB patogenezinin hızlı, düşük maliyetli ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine imkân sağlar. Ayrıca, model, deney hayvanların genel sayısını azaltarak, erken gelişiminde yeni anti-TB ilaç ve aşı adaylarını ekrana kullanılacak potansiyele sahiptir. Ev sahibi ve patojen yapısında, transkriptom ve proteomdaki değişiklikleri, uyuşturucu hedeflerini belirlemek ve yeni ilaçların ve terapötik aşıların eylem mekanizmalarını değerlendirmek için ölçmek yeteneği de avantajlıdır.
Burada, Mikobakteriyel Enfeksiyon için Bioluminesans M. Bovis BCG Lux inokulumunu ve G. mellonella larvaları hazırlanması için deneysel protokoller ve hem larva hem de Mikobakteriyel enfeksiyona yanıt olarak hayatta kalma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: aşağıda açıklanan tüm çalışmalar, yerel sağlık ve güvenlik kurallarına uygun bir sınıf 2 Mikrobiyolojik Emniyet kabininde (MSC) CL2 bir laboratuvarda gerçekleştirilecektir.
1. enfeksiyon için M. Bovis BCG Lux hazırlanması
- Dondurulmuş 1,2 mL gliserol (% 15) defrost M. Bovis BCG Luxhisse senedi, Montreal aşı gerinim Vibrio harveyi Lusiferaz enzim19kodlama luxab genler taşıyan mekik Plasmid pSMT1 ile dönüştürülmüş.
- % 0,2 gliserol,% 10 albumin, dekstroz, katalaz (ADC) zenginleştirme ve 50 μg/ml higromisin içeren 15 ml Middlebrook 7h9 suyunda, bir etiketli 250 ml Erlenmeyer Flask içinde BCG Lux, buzunu 1,2 ml kısım ile inoculate.
- Flask mühürlü bir Biyogüvenlik konteynırı yerleştirin ve 37 °C ' de bir orbital Shaker kuluçta 220 RPM için 72 h (veya kültür büyüme orta günlük aşamasına ulaştığında) içinde inkük.
- Fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4, 0,01 M fosfat tamponu, 0,0027 M potasyum klorür ve 0,137 M sodyum klorür) kullanılarak Luminometre tüplerinde kültürün 1:10 dillerinin hazırlanması ile BCG lüks kültürünün büyümesini kontrol edin. Vortex ve Luminometre tüpleri luminometreye yükleyin ve biyolüminesans ölçmek (bağıl ışık ünitesi [RLU]/ml) substrat olarak n-Decyl aldehit kullanarak (1% v/v mutlak etanol)20.
Not: RLU/Colony şekillendirme birimlerinin oranı (CFU) daha önce BCG lüks Middlebrook 7H9 suyu20içinde vitro yetiştirilen olduğu 3:1 olarak belirlendi. - 2.175 x g 'de kültürü santrifüjle, hücreleri Pelet etmek ve süpernatant 'ı bilinen mycobactericidal aktivite ile uygun bir dezenfektan içine atmak için oda sıcaklığında 10 dk. Tüm kültür atıklarının yerel yönergelere göre Mikobakterilere uygun dezenfektanlarla atılması.
- Bakteri kümesini önlemek için% 0,05 polisorbat 80 (PBS-T) içeren PBS 'de iki kez hücre pelsini yıkayın.
- Son yıkama, dikkatle boşaltmak atık supernatant takip, PBS-T Mikobakteriyel hücre peletini pelletini ve RLU ölçümleri kullanarak istenilen hücre yoğunluğuna Mikobakteriyel süspansiyon seyreltici.
- PBS-T kullanarak 24-kuyu plakalarında inokulumunu on kat seri dilüsyonları hazırlayın. 10 μL üzerine Middlebrook 7h11 agar plakaları üzerine plaka (0,5% gliserol, 50 μg/ml higromisin,% 10 oleik asit, albümin, dekstroz, katalaz [oadc]) yinelenen inokulumunu CFU sayar numaralandırmak için.
2. G. mellonella Larvae hazırlanması
- Son INSTAR larvaları uygun kaynaklardan satın alın ve varışta 18 °c ' de karanlıkta larvaları koruyun ve satın alma işleminden sonra 1 hafta içinde kullanın. Alternatif olarak, larvaları Jojāo ve al.21protokolünün ardından kendi kendine yetiştirilen olabilir. Satın alınan larvaları için, depodan önce herhangi bir ölü, renksiz veya pupan larvaları atın.
Not: Pupating larva son INSTAR larvaya morfolojik olarak ayırt edilir. - Bir renk değişikliği (melanasyon), boyutu (2 − 3 cm uzunluğunda), ağırlık (yaklaşık 250 mg), yüksek düzeyde motilite görüntüleme ve doğru yeteneğine sahip olan tek tip krem rengine dayanan deney için sağlıklı larvaları belirleyin ve seçin kendilerini geri çevirdi.
- Sağlıklı larvaları (grup başına en az 20 − 30), kontaminasyonu en aza indirmek ve kullanım kadar karanlık oda sıcaklığında saklamak için künt-uç Cımbız kullanarak bir filtre kağıdı (94/15 mm) katmanına sahip bir petri tabağı (94/15 mm) içine dikkatle say.
3. BCG Lux ile G. mellonella bulaşmasını
- Kontaminasyon ve iğne sopa hasarı riskini azaltmak için MSC içindeki karmaşayı minimize et.
- Dairesel Filtre kağıdını (94 mm) düz bir yükseltilmiş yüzeye yapıştırarak enjeksiyon platformunu hazırlayın. Yumuşak veya sert yüzeyler kullanılabilir ve tamamen Kullanıcı tercihi, örneğin, pipet kutusu kapakları veya bir naylon fırçalama sünger bağlıdır.
- 25 μL mikroşırınga (25 G), 3 hacim% 70 etanol aspirasyon ve 3 hacim steril PBS-T ile daha fazla durulama ile sterilize edin.
- 10 μL BCG Lux inokulumunu (Bölüm 1 ' de hazırlanmış) veya PBS-T sterilize 25 μL mikroşırınga içine aspirate. PBS-T negatif kontrol için ayrı bir şırınga kullanın.
Not: Tek hücreli süspansiyon sağlamak için 10 enjeksiyonları takiben BCG Lux inokulumunu resuspend. - Bir larva almak ve enjeksiyon platformu üzerine yerleştirmek için cımbız kullanın.
- Platformda, arka için larva çevirmek ve cımbız ile baş ve kuyruk güvenliğini sağlayarak hareketsiz. Larva başından aşağı sayma son sol proleg bulun ve dikkatle iğne ucu (5 − 6 mm) yatay düzleme 10 − 20 ° açı olarak takın.
Not: Kısa ve dar cımbız minimum larva stres ile kolay immobilizasyon için izin verir. Üzerinde bağırsak delinebilir ve olmayan BCG Lux spesifik melanizasyon veya Ölüm neden nüfuz üzerinde dikkat edin. - Virüslü larvaları, filtre kağıdı tabakası ile kaplı bir petri tabağı olarak saymak, tek 90 mm Petri tabağı 30 larvaya kadar kalabilir.
- Larvaları içeren Petri çanağını, 37 °C ' de,% 5 CO2ile bir inkübatör içinde, muhafazalı veya mühürlenmeyen bir karanlık kutuda saklayın.
4. enfeksiyon sonrasında G. mellonella Survival izleme
- Zaman kursunda, larvaları her 24 h. larvasının hayatta kalmasını izlemek, dokunmaya yanıt olarak hareket etmeye başarısız olduğunda ölü olarak kabul edilir.
5. g. mellonella 'da BCG Lux 'ın In vivo yükünü ölçme
- Her zaman noktasında, rasgele 5 enfekte larvaları daha önce bölüm 3 ' te hazırlanan seçin ve yavaşça% 70 etanol içinde ıslatılmış pamuk tomurcuk Bezlerden kullanarak larva yüzeyleri sterilize.
Not: Bu adım, steril olmayan larva olarak mycobakteriyel CFU numaralandırma için larva Homojenat kaplama kontaminasyona yol açabilir önemlidir. - Larvaları, 800 μL steril PBS içeren 2 ml parçalanması matris tüplerine ayrı olarak yerleştirin.
- 60 s için bir Homogenizer kullanarak larva homojenize 6,0 m/s.
- 5 s için 3.500 x g 'de parçalanması tüpleri santrifüjler, kapakların homojenliği kaldırmak ve dikkatle steril Luminometre tüpler içine homojenlik ayrı tek.
Not: CFU sabit listesi için (adım 5,7), steril bir 1,5 mL reaksiyon tüpünde 100 μL Homojenat ayırtmak için emin olun. - 1 ml PBS-T ve pipet ile ilgili Luminometre tüplerine parçalanması Matrix tüplerini yıkayarak kalan homojenini kurtarın.
- Luminometre tüpleri Vortex ve daha önce adım 1,4 açıklanan homojenlerin biyolüminesans ölçmek.
- PBS-T kullanarak 24-Well kültür plakaları homojenin on kat seri dilüsyonları hazırlayın. % 0,5 gliserol, 50 μg/mL higromisin,% 10 OADC ve 20 μg/ml piperakilin içeren Middlebrook 7H11 agar plakaları üzerine seyreltme 10 μL plaka dışarı, BCG Lux aşağıdaki RLU/CFU oranı belirlemek için in vivo enfeksiyon.
Not: Piperacillin BCG Lux16minimal büyüme inhibisyonu ile yerli G. mellonella Mikrobiyota ortadan kaldırır.
6. istatistiksel analizler
- Toplanan verileri kullanarak Kaplan-Meier hayatta kalma eğrisi Plot ve Mantel-Cox yürütmek (log-rank) sonucu önemini belirlemek için test, burada * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001, ve * * * * p < 0,0001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada g. mellonella -BCG Lux enfeksiyon modeli kullanılarak elde edilebilir temsili veri sunuyoruz ve mtbc üyeleri için bir enfeksiyon modeli olarak g. mellonella yararları vurgulamak (Şekil 1). Önemli teknik noktalarıyla deneysel prosedürler Şekil 2' de özetlenmiştir.
Şekil 1: G. mellonella 'nın bir enfeksiyon modeli olarak faydaları. Bu rakam, karavandan ve Sheehan22' den adapte edilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: deneysel prosedürler anahattı. (A) M. Bovis BCG Luxile enfeksiyon için G. mellonella 'nın bakımı ve hazırlanması. (B) BCG Lux kültürünün ve inokulumunu enfeksiyonu için hazırlanması. (C) BCG Luxile G. mellonella enfeksiyonu. (D) G. mellonella larva 'da BCG Lux 'ın virülans ve in vivo yükü ölçümü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
BCG lüks doz bağımlı virülans G. mellonella larvaları üzerinde bir 96 h kuluçka döneminde gözlendi (Şekil 3), ve ölümcül doz için gerekli 50% larva mortalite (ld50) olarak belirlendi 1 x 107 CFU. BCG lüks dozlarda virülans yansıtan hayatta kalma dağılımı test önemli ölçüde farklıydı (p < 0,0001). 10 μL doz PBS-T ile enjekte edilen veya sadece iğne yaralanmalarını simüle eden kontrol grupları, larva sağlığını etkilemez ya da farklı zaman noktalarında motilite ve melanizasyon üzerinde gözlemsel kontroller ile belirlendiği gibi mortalitenin artmasına yol açar.
Şekil 3: M. Bovis BCG Lux'ın değişen Inokula yanıt olarak G. mellonella kaplan-Meir hayatta kalma eğrisi. Sağlıklı larvaları (grup başına n ≥ 10), BCG Luxçeşitli dozlarda bulaşmış. Larva 37 °C ' de inkübe edildi ve her 24 saat 96 h 'ye kadar hayatta kalabilmek için izleniyor. Enfekte olmayan Grup PBS ile enjekte edildi, ve bir pricked grup (sadece iğne ekleme) larva sağlık iğne hasarı etkisini göstermiştir. İki bağımsız deney Aracı,% 95 güven aralığı ile, karşılık gelen renk inoculum noktalı çizgiler olarak temsil gösterilir. Bu rakam li ve al.16' dan uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
BCG Lux ile enfekte tüm larvaları zaman içinde fizyolojik değişiklikler gösteriliyor ve, bir 2 x 107 CFU doz BCG Luxile enfekte larvaları için, larva dorsal çizgisinin melanizasyon 48 h sonrası enfeksiyon gözlendi (Pi), ve sistematik melizasyon 96 h pi (Şekil 4) ' den görüldü. Ayrıca, larvların motilitesi melanizasyon şiddetiyle azaltılmış ve larvalar için PuPaT yeteneği enfekte olmayan kontroller ile karşılaştırıldığında enfeksiyon üzerine kayboldu.
Şekil 4: M. Bovis BCG Luxile enfeksiyona yanıt olarak G. mellonella 'nın melanization. Sağlıklı larvalar 0 h BCG Lux2 x 107 CFU doz ile enfekte edildi. 48 h ve 96 h pi 'de, larva dorsal hattı boyunca melanizasyon ve sistematik melanasyon sırasıyla gözlenmiştir.
G. mellonella larvaları içinde BCG Lux 'ın hayatta kalması, larva homojenleri biyoluminesans ölçümü ile 2 hafta içinde belirlendi. 1 x 107 CFU doz BCG Lux ile enfeksiyon 0 − 72 h pi BCG Lux biyolüminesans bir ilk düşüş sonuçlandı. Ancak, 72 − 144 h pi 'den, BCG Lux 'ın biyoluminesans plateaued, kalıcı enfeksiyon kurulması gösteren (Şekil 5).
Şekil 5: G. mellonella 'da M. Bovis BCG Lux In vivo yükü, iki haftalık bir ders boyunca biyolüminesans (bağıl ışık ünitesi, RLU/ml) kullanılarak nicelleşmiş. Sağlıklı larvaları (n = 30) BCG Lux1 x 107 CFU doz ile enfekte edildi. In vivo yükü her zaman noktasında beş larvaları homojenleştirerek ölçülmüş (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h) ve homogenate biyolüminesans ölçme. Üç bağımsız deneylerin araçları gösterilir ve hata çubukları ortalama standart sapmasını temsil eder. Bu rakam li ve al.16' dan yeniden basılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Bu çalışmalarda in vivo Mikobakteriyel büyümenin hızlı ve tekrarlanabilir miktarının biyoluminesans ölçümü ile belirlendiği, RLU ve CFU oranı da in vivo olarak belirlenmelidir. Bizim özel enfeksiyon sisteminde, RLU ve CFU in vivo oranı 2:1-5:1 dan, 168-h zaman kursu üzerinde 4:1 ortalama ile değişmektedir (Şekil 6).
Şekil 6: G. mellonella'da M. Bovis BCG Lux 'ıN In vivo RLU/CFU oranını belirleme. Sağlıklı larvaları (n = 30) BCG Lux1 x 107 CFU doz ile enfekte edildi. Her zaman noktasında (0, 24, 96 ve 168 h), dört enfekte/kontrol (PBS-T) larvaları homojenize edildi ve homojenatlarındaki biyolüminesans için ölçülen ve CFU sayıları numaralandırmak için 7h11 agar üzerine kaplama. İki bağımsız deney aracı gösterilir ve hata çubukları ortalama standart sapmasını temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. mellonella 'nın bir enfeksiyon modeli olarak kullanımı, virulence, ana bilgisayar patojen etkileşimi ve yeni terapi10,22için bir ekran olarak bir dizi bakteriyel ve mantar patojenler için kurulmuştur. Aşağıdaki tartışma MTBC için bir enfeksiyon modeli olarak G. mellonella kullanımı için deneysel prosedür dayanmaktadır.
Deneyden önce saf larvaları sağlık, deney sonucu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenle, herhangi bir renk ve/veya yaralı larvaları varışta kaldırılır ve herhangi bir deney için kullanılmaz hayati önem taşımaktadır. Eğer larvalar çok sayıda vardıklarında aynı konteyner içinde ölü bulunursa, önceden mevcut enfeksiyonlar ölüm nedeni olabilir olarak toplu atmak için tavsiye edilir. Mümkün olduğunda, satın alma/varış gününe yakın olarak larvaları kullanarak deneyler gerçekleştirin. Kullanmadan önce pupasyon önlemek ve deney için mevcut larva sayısını maksimize etmek için 18 °C larvaları saklamak için emin olun. Sağlıklı larvalar, teslimat/satın alma işleminden sonraki 7 güne kadar kullanılabilir. Enfeksiyondan sonra, herhangi bir ölü larvaları Petri yeminden kaldırmak için emin olun, henüz bilinmeyen nedenlerle, ölü larvalar varlığı örnek nüfus mortalite oranını artırmak için görünür. Kendi kendine yetiştirilen larva kullanıcıları için, satın alınan larvalar ile karşılaştırıldığında biyolojik değişkenlik farkında olmak önemlidir, diyet ve büyüme koşullarında varyans larva bağışıklık üzerinde bir etkisi olabilir gibi21,23. Deneysel varyasyon kaynakları, satın alınırsa veya yenilebilir larvaları deney arasında tutarlı bir şekilde beslemeli ve büyüme koşullarında tutarak sınırlı olabilir. Tüm deneylerde, ' boş ' ve ' pricked ' negatif kontroller eklenmesi esastır; boş kontrol, süspansiyon matrisinin (PBS-T veya medya suyu) kontaminasyonu veya toksisitesi göstergesidir ve pricked kontrol, iğne yaralanmanın larva sağlığı üzerindeki etkisini taklit eder. Ayrıca, bu kontroller larva grupları arasında herhangi bir biyolojik varyasyon normalleştirmek, yeniden üretilebilirliği ve deneyler arasında doğruluk sağlanması.
G. mellonella larvaları enjeksiyon için, 25 G iğne kullanımı daha büyük ölçer iğneler aşırı kanama ve daha keskin küçük ölçer iğneler kolayca larva mortalitesi ve yanlış pozitif akrile lar gut delinme neden olabilir olarak tavsiye edilir Sonuç -ları. İğne enjeksiyonu konvansiyonel yöntemleri genellikle el ile larvaları hareketsiz, hangi iğne hasarı riskini artırır. Larvaları hareketsiz etmek için cımbız kullanarak, el enfeksiyon sırasında herhangi bir noktada iğne yakın olmadığı için iğne sopa yaralanma riski önemli ölçüde azalır. Alternatif olarak, larvalar soğutma ile immobilize olabilir. Ancak, enfeksiyon öncesinde 15 dakika boyunca 12 °C ' de soğuk şok, infeksiyon için doğuştan gelen bağışıklık tepkisi geliştirmek için belgelenmiştir. Bu nedenle, soğutma yoluyla elde edilen sonuçların analizi, etkisini dikkatle göz önünde bulundurmalıdır24. Tekniğimizi kullanarak, ortalama enjeksiyon verimi (dakikada 2 − 3 larva) Kullanıcı uygulaması ile elde edilebilir; Bu, deneyimlerimizin konvansiyonel enjeksiyonu hızıyla karşılaştırılabilir (dakikada 3 − 4 larva). Ayrıca, yöntemimiz, 25 G kelebek kanül bağlı tek kullanımlık şırınga ile bir infüzyon pompası oluşan bir pedal çalışan enjeksiyon platformu kullanarak daha yüksek verim enjeksiyon için adapte edilebilir.
BCG Lux inokulumunu hazırlanması Mikobakteriyel kültürün RLU kullanarak CFU hızlı tahmin dayanmaktadır20. Suyu kültürü ile deneyimimizde, CFU RLU oranı 3:1 olduğunu20, BCG lüks ile kontrast G. mellonella büyüyen nerede RLU CFU oranı 5:120. Mikobakteriyel hücre toplama veya ' küme ' yaygın olarak yoğun kültürlerde görülen RLU ölçümleri üzerinde bir etkisi olabilir, çünkü küpleme güvenilmez biyolüminesans ölçümleri neden olabilir. Bu nedenle, inokulumunu hazırlığı için kükobakteriyel kültürün kullanılması önerilmez. Ancak, büyüme medyasını polisorbat 80 ilavesi BCG Luxbüyümesini değiştirmeden hücre küpleme en aza indirir. 16 herhangi bir küçük hücre kümeleme PBS-T ile kültürü yıkayarak çözülebilir ve okuma olarak RLU kullanarak doğru bir inokulumunu hazırlamak için hayati öneme sahiptir. Ayrıca, PBS-T yıkama büyüme sırasında salgılanan herhangi bir ekstrülüler virülans faktörü kaldırmak için hayati önem taşımaktadır. Bu Mikobakteriyel toplama25şiddeti etkileyebilir gibi Mikobakteriyel gerinim ve geçiş numarası da dikkate alınmalıdır. Her durumda, inokulumunu, doğru CFU 'nun Bioluminesans ölçümü ile hazırlandığından emin olmak için 7h11 agar plakaları üzerinde CFU tarafından numaralandırılmalıdır. Ayrıca, RLU/CFU oranı içinde vivo yeni Bioluminesans muhabiri veya stokları ile belirlenmelidir, oranı büyük olasılıkla farklılık gösterecektir.
G. mellonella , özellikle Bioluminesans suşları16ile birlikte, daha ucuz satın alma ve bakım maliyetleri, enfeksiyon ve araştırma verimi de dahIl olmak üzere geleneksel TB enfeksiyonu modellerinde çeşitli avantajlara sahiptir. Etik kısıtlamaların olmaması, memelinin modellerine kıyasla daha fazla numune boyutu (grup başına en az 20 − 30 larva) sağlar, elde edilen sonuçlarda daha fazla güven ve güvenilirlik veren26,27. Ancak, bir enfeksiyon modeli olarak G. mellonella kullanımında sınırlamalar bir dizi vardır. Bir omurgasız olarak, doğal olarak onları yapılacak araştırmalar antijenite veya immünolojik çalışmalar için uygun olmayan adaptif bağışıklık eksikliği10. G. mellonella 'nın hücresel doğuştan gelen bağışıklık tepkisi, bir dizi hemoksit türünden oluşur ve plasmatanosit ve granülositlerin memeliler fagositlere (nötrofiller ve makrofajlar) benzer şekilde çalışması bildirildi12. Ancak, bu hücre türlerinin rolü ve mekanizmaları karakterize altında kalır ve meme ve böcek fagositleri arasında doğrudan karşılaştırmalı çalışmalar gerçekleştirilmelidir. Ayrıca, bir açıklamalı G. mellonella genom eksikliği enfeksiyona ev sahibi tepkisi analizini engelliyor, ve bu şu anda Drosophila gibi diğer omurgasızlar, transcriptomik kütüphanelere karşı gen Ontoloji analizi üzerinde güvenen melanogaster ve bombyx mori28.
TB enfeksiyon modeli olarak, G. mellonella , TB enfeksiyonunun hayati patolojileri olan ve önemli bir hastalık olan BCG Lux enfeksiyon16' ya yanıt olarak granüloma benzeri yapıları geliştirme yeteneğiyle birlikte umut verici bir geleceğe sahiptir. LTBı gelişiminde özelliği. Gelecekteki çalışmalar, CL3 koşullar altında referans, klinik ve mutant MTB yalıtır kullanarak granülom benzeri yapıların oluşumuna özel bir ilgi ile bu model karakterize hedefliyoruz. Ayrıca, NTMs18için benzer bir G. mellonella modeli kullanıldığı için, yeni anti-Mikobakteriyel Ajan taraması için de yararlı olacağını tahmin ediyoruz, ancak bu belirlenecek. Bu modelin benimsenmesi, TB araştırma topluluğunda kullanılan hayvanların sayısını önemli ölçüde azaltmak, aynı zamanda etik daha kabul edilebilir koşullarda in vivo TB araştırma çıktısının hızlandırılması yeteneğine sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu proje Biyoteknoloji ve biyolojik Bilim Araştırma Konseyi (BBSRC), PRL ve YL (BB/P001262/1) ve Ulusal Merkezi değiştirme, arıtma ve araştırma hayvanların azaltma (NC3Rs) için verilen hibe tarafından desteklenmektedir PRL, SMN, BDR ve YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. , Geneva. (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
