Summary
هذا في الوقت الحقيقي RT-PCR باستخدام صبغ dsDNA intercalating هو مناسبة لتشخيص التهابات فيروس ليسا. تبدأ الطريقة مع الحمض النووي الريبي المستخرج من داء الكلب المشتبه به قبل الوفاة أو عينات ما بعد الوفاة، بالتفصيل إعداد المزيج الرئيسي، إضافة RNA، وإعداد الجهاز في الوقت الحقيقي والتفسير الصحيح للنتائج.
Abstract
الاختبارات الجزيئية سريعة وحساسة ومحددة، وأصبحت مركزية لتشخيص داء الكلب. وقد استخدمت الاختبارات المستندة إلى PCR لعقود لتأكيد تشخيص داء الكلب ولكن لم تقبلها المنظمة العالمية لصحة الحيوان إلا مؤخراً كطريقة أولية للكشف عن عدوى داء الكلب. توفر عمليات اختبار RT-PCR في الوقت الحقيقي بيانات في الوقت الحقيقي، وهي أنظمة أنابيب مغلقة، مما يقلل من خطر التلوث أثناء الإعداد. لا تتطلب اختبارات RT-PCR المتداخلة مع الحمض النووي الفلوروكروم في الوقت الحقيقي تحقيقات مكلفة، مما يقلل من تكلفة العينة الواحدة، وعندما يتم تصميم المواد التمهيدية في المناطق المحفوظة، فإن الاختبارات المحددة عبر أجناس الفيروس بدلاً من التحديد لفيروس واحد فقط الأنواع ممكنة. هنا نقوم بوصف جهاز الـ "آر تي-بي آر" في الوقت الحقيقي الذي يكشف فيروسات الليسا في جميع أنحاء جنس ليسافيروس، بما في ذلك الفيروسات الأكثر تبايناً IKOV وWCBV وLLEBV. وبالاقتران مع تحليل منحنى التفكك، فإن هذا الاختبار حساس ومحدد، مع ميزة الكشف عن جميع أنواع فيروس الليسا. وقد تم اعتماد الفحص في العديد من مختبرات التشخيص مع بيئات مضمونة الجودة، مما يتيح تشخيص قوي وسريع وحساس لحالات داء الكلب الحيواني والبشري.
Introduction
وقد قبلت منظمة الطاقة العالمية تشخيص داء الكلبباستخدام المنهجيات الجزيئية في عام 2018 1، مع الاعتراف بمزايا هذه التقنيات في تأكيد حالات داء الكلب، لا سيما في الحالات التي تكون فيها العينات دون المستوى الأمثل، أو لتشخيص ما قبل الوفاة، كما لا يوجد شرط للفيروس الحية أو عينات جديدة. تتطلب عمليات فحص PCR للفيروسات الليسافية نسخًا عكسيًا (RT) قبل أن يبدأ PCR لأن الجينوم هو الحمض النووي الريبي. تعتبر الاختبارات RT-PCR التي تكشف عن المنطقة القريبة من 3' من الجينوم الأكثر حساسية، كما تحدث التدرجات النسخي أثناء النسخ المتماثل فيروس lyssa. يمكن تقسيم الاختبارات RT-PCR الشائعة الاستخدام بشكل عام إلى فئتين، نقطة النهاية (أو المستندة إلى هلام) وفي الوقت الحقيقي. وكلا النهجين حساس انما محدد؛ ومع ذلك، فإن الاختبار في الوقت الحقيقي له بعض الفوائد الإضافية مثل الحصول على نتائج في "الوقت الحقيقي" ويجري تنفيذها في نظام أنبوب مغلق تماما، وبالتالي الحد من احتمال تلوث المشغل. هناك نهجان رئيسيان للكشف عن التضخيمات الخاصة بفيروس ليسا التي تم الحصول عليها باستخدام الاختبارات في الوقت الحقيقي. الأولى تستخدم تحقيقات التحلل المائي (مثل تحقيقات تقوى) التي تحتوي على فلوروفور وquencher. وعندما يرتبط المسبار بالمنطقة المستهدفة أثناء التضخيم، يؤدي نشاط الإثارة للبوليميراز إلى تفكك الفلوروفور وعصارة الفلور، مما يمكّن من قياس الفلورة الناتجة عن ذلك. والثاني يستخدم صبغة الحمض النووي المتداخلة (فلوروكروم مثل SYBR الأخضر) التي تربط لمضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل أثناء التضخيم. تنبعث من الفلوروكرومات المقيدة الفلورة التي يتم الكشف عنها في كل دورة، مما يسمح بالكشف في الوقت الحقيقي والقياس الكمي للمنتج. نظرا ً للطبيعة غير المحددة للربط بأي dsDNA، يتم إجراء تحليل منحنى التفكك لتأكيد خصوصية رد الفعل. وتكون الـ RT-PCRs في الوقت الحقيقي سريعة بسبب أحجام الاملييكون الصغيرة، التي يقل طولها عادة عن 200 نقطة أساس؛ ومع ذلك، فإن تحديد المناطق المناسبة لتصميم المواد التمهيدية وتحقيقات في المناطق المحفوظة، يمكن أن يثبت تحديا، وبالتالي إزالة شرط التحقيق هو ميزة متميزة.
وقد تم تصميم عدد من الـ RT-PCRs في الوقت الحقيقي للكشف على وجه التحديد عن سلالات فردية أو سلالات من RABV2 وأيضا للكشف عن الفيروسات الليسا في جميع أنحاء جنس3،4،5،6، 7،8،9. جميع الاختبارات سيكون لها حد من الكشف تعتمد على كيفية الحفاظ على التمهيدي (وإذا لزم الأمر، والمسبار) تسلسل هي عبر جنس. والواقع أن سلالات الفيروس الناشئة أو الجديدة قد تجعل الاختبارات المحددة للغاية القائمة على المسبار غير فعالة. اختيار الكشف في الوقت الحقيقي (صبغ مقابل التحقيق) سوف تعتمد على التطبيق المقصود. بالنسبة لمختبر يقوم بمراقبة مواد الدماغ من مصادر محلية ويتوقع أعداد كبيرة من العينات السلبية، فإن استخدام الصبغة المتداخلة الأرخص هو خيار معقول. كما أن النهج الأخضر SYBR سيكون الأمثل عند إجراء مراقبة المسح الضوئي حيث لا يزال وجود فيروسات ليسا جديدة أو متباينة دون الكشف عنها من خلال اختبارات أكثر تقييدا المستندة إلى التحقيق.
جميع أعضاء جنس Lyssaفيروس يسبب مرض داء الكلب، الذي هو قاتل ة بمجرد ظهور الأعراض. الغالبية العظمى من حالات داء الكلب البشري والحيواني بسبب فيروس داء الكلب (RABV)، الخزان المهيمن الذي هو الكلب المنزلي10. الخفافيش هي الخزانات المضيفة الهامة للفيروسات الليسافيروس وجميع ما عدا اثنين من أنواع فيروس ليسا تتميز تم التعرف عليها مباشرة في الخفافيش — إيكوما ليسافيروس (IKOV) وفيروس موكولا (MOKV) - ومن هذين، وقد تم التكهن IKOV أن يكون خزان المضيف الخفافيش 11.بالإضافة إلى 16 الأنواع المعترف بها lyssavirus12, هناك اثنين من الفيروسات lyssaالتي تم وصفها مؤخرا: تايوان الخفافيش lyssavirus (TWBLV)13 وKotalahti الخفافيش lyssavirus (KBLV)14. يمكن تقسيم فيروسات الليسا وراثيا إلى ثلاث مجموعات فيلو، مع غالبية الفيروسات الليسافية، بما في ذلك RABV، تنتمي إلى مجموعة فيلوجروب 1. ومع ذلك، فإن فيروسات الليسا الأكثر تبايناً تنتمي إلى المجموعة الثالثة من الليسوجروب، ومن غير المرجح أن يتم اكتشافها بواسطة RT-PCRs المصممة لاستهداف تسلسلات فيروس RABV أو phylogroup I.
يستخدم الوصف الموضح هنا زوج التمهيدي في الوقت الحقيقي JW12-N165، الذي تم وصفه لأول مرة في عام 20053. تم تصميم المواد التمهيدية لتكون فيروس pan-lyssaعلى الرغم من أن التطبيق الأصلي كان بمثابة إجراء تحقيق من قبل شركة TaqMan مع تحقيقات للتمييز بين أنواع فيروس ليسا. تم تحقيق تأكيد لاحق أن الزوج التمهيدي كان pan-lyssavirus في خصوصية باستخدام اختبار SYBR 2-الخطوة في الوقت الحقيقي على جميع أنواع فيروس lyssa المتاحة بما في ذلك WCBV15. ويرد وصف الزوج التمهيدي هنا في اختبار RT-PCR من خطوة واحدة في الوقت الحقيقي باستخدام الفلوروكروم intercalating، والتحقق من صحة باستخدام ممثلين من جميع الأنواع 16 فيروس lyssa المعترف بها. هذا التقييم في الوقت الحقيقي خطوة واحدة هو سريع, حساسة, اختبار فيروس ليسا محددة ويدل على أن قوة التمهيدي مجموعة لتحديد حتى الأنواع فيروس ليسا متباينة للغاية.
Protocol
عينات من المواد التشخيصية التي تم تلقيها في APHA بعد العدوى الطبيعية، أو التي تم الحصول عليها عن طريق تلقيح الفئران باستخدام بروتوكولات تقيمها لجنة أخلاقيات وإحصاءات APHA بموجب لوائح وزارة الداخلية في المملكة المتحدة بموجب الترخيص 70/7394.
1. القياس الكمي للحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم
- تأكد من تعيين إعدادات مقياس الطيف الضوئي إلى RNA.
- استخدم 1-2 ميكرولتر من الماء الجزيئي لتهيئة الجهاز وتعيين خط أساس.
- استخدام 1-2 ميكرولتر من كل عينة الحمض النووي الريبي اختبار لتقييم كمية RNA.
- حفظ القراءات والمستند.
- ضبط الحمض النووي الريبي إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر، إذا لزم الأمر.
ملاحظة: يجب أن تبقى الحمض النووي الريبي على الجليد (أو في كتلة باردة) في جميع الأوقات. إذا تم الحصول على الحمض النووي الريبي باستخدام عمود، أو طريقة قائمة على حبة الحمض النووي الريبي عادة أقل من 1 ميكروغرام / ميكرولتر. في هذه الحالة استخدام الحمض النووي الريبي أنيق.
2. إعداد سلسلة تخفيف الحمض النووي الريبي لتحديد حساسية نقطة النهاية
-
جعل تخفيف المسلسل 10 أضعاف من الحمض النووي الريبي.
- أنابيب التسمية مع سلسلة التخفيف (على سبيل المثال، 10-1، 10-2، الخ) وتفاصيل الحمض النووي الريبي.
- إضافة 45 درجة مئوية من الماء الصف الجزيئي إلى كل أنبوب.
- إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (المخفف سابقا إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر) وتخلط جيدا.
- تخلص من طرف الماصات في مطهر مناسب واستبداله بطرف جديد.
- تأخذ 5 درجة مئوية من 10-1 وإضافة إلى أنبوب 10-2 وتخلط جيدا.
- كرر 2.1.3-2.1.5 مع التخفيفات المتبقية.
ملاحظة: يجب أن تبقى الحمض النووي الريبي على الجليد (أو في كتلة باردة) في جميع الأوقات.
3. إعداد ردود الفعل RT-PCR في الوقت الحقيقي
- باستخدام جدول بيانات، قم بتخطيط تخطيط اللوحة وفقًا لعدد عينات الاختبار وعينات التحكم، لكل من اختبارات lyssavirus وß-actin.
ملاحظة: إذا كان سيتم اختبار 4 عينات في تكرار مع سيطرة إيجابية وسلبية، وهذا يعادل 10 ردود الفعل لكلا الاختبارين. - في "غرفة نظيفة" أو منطقة منفصلة عن قالب RNA، امسح الأسطح بمطهر مناسب قبل الاستخدام أو إعداد محطة عمل PCR (عند الاستخدام). لإعداد محطة العمل، امسح سطح الخزانة بمطهر مناسب ووضع العناصر المطلوبة في محطة العمل وأغلق الأبواب. قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق
- إزالة الحكام والتمهيديات من الثلاجة وذوبان (الكواشف المدرجة في الجدول 1 والتمهيديات في الجدول2).
ملاحظة: يتم تخزين مزيج الإنزيم في الجلسرين لذلك لا يتطلب ذوبان ويجب أن تبقى على الجليد (أو في كتلة باردة) في جميع الأوقات. يمكن إذابة جميع الكواشف الأخرى في درجة حرارة الغرفة. - بمجرد إذابة، مزيج الكواشف والطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع السائل.
ملاحظة: لا دوامة مزيج الإنزيم، فقط الطرد المركزي لفترة وجيزة. - إعداد يمزج رئيسية منفصلة لlyssavirus وß-actin. لكل رد فعل، إضافة 7.55 درجة مئوية من الماء الصف الجزيئي، 10 ميكرولتر من 2X العالمي SYBR مزيج التفاعل الأخضر، 0.6 ميكرولتر من التمهيدي إلى الأمام، 0.6 ميكرولتر من التمهيدي العكسي، 0.25 ميكرولتر من مزيج إنزيم iTaq RT.
- استخدم جدول بيانات لحساب وحدات التخزين الصحيحة لتجنب الأخطاء في الحساب اليدوي. ضمان ما يكفي من ماستر ميكس على استعداد للتعويض عن خطأ الأنابيب. لذلك إذا كانت هناك حاجة إلى 10 ردود فعل (انظر ملاحظة في 3.1)، وإعداد 12 ردود الفعل
- إعداد سيد مزيج على الجليد (أو في كتلة باردة) والبقاء على الجليد حتى توضع في آلة في الوقت الحقيقي.
- خلط اليمزج الرئيسي المعدة، الطرد المركزي لفترة وجيزة والاستغناء 19 درجة مئوية في الآبار ذات الصلة من أنابيب الشريط أو لوحة 96 جيدا متوافقة مع آلة في الوقت الحقيقي في الاستخدام.
ملاحظة: تقليل إنتاج فقاعات في الآبار في حين الأنابيب. - في غرفة منفصلة، أو في خزانة الأشعة فوق البنفسجية أعدت كما هو موضح في 3.2، إضافة بعناية 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تعديلها سابقا إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر (انظر الخطوة 1.5) تحت سطح البئر سيد المزيج المناسب ة ومزيج بلطف. تخلص من طرف الماصات إلى مطهر مباشرة بعد الاستخدام (تحت السطح).
- إضافة عناصر التحكم بعد عينات الاختبار، مع إضافة عنصر التحكم الإيجابي التالي وعنصر تحكم القالب لا (NTC - الماء الصف الجزيئي) وأضاف الأخير. يمكن تغيير كمية الحمض النووي الريبي المستخدمة اعتمادا على نوع العينة، واستخراج الحمض النووي الريبي المستخدمة. يجب التحقق من صحة المبلغ المستخدم لضمان تحسين رد الفعل.
- ختم لوحة باستخدام أغطية الشريط أو السدادة رعاية لضمان إغلاق جميع الأغطية بحزم ووضع العلامات بما فيه الكفاية لتوجيه العينات. تسمية حافة أنابيب لوحة / قطاع.
- تدور أسفل العينات باستخدام جهاز طرد مركزي لجمع كل السائل في الجزء السفلي من الآبار.
- نقل لوحة إلى آلة PCR في الوقت الحقيقي، وفتح الباب والمكان في حامل ضمان الموقع الصحيح / التوجه من العينات وفقا لتخطيط لوحة.
ملاحظة: إذا تم استخدام شرائط أنبوب، تأكد من حامل في مكان. - فتح برنامج آلة PCR في الوقت الحقيقي واختيار الخيار لتجربة SYBR في الوقت الحقيقي مع منحنى التفكك. قم ببرمجة جهاز PCR في الوقت الحقيقي باستخدام شروط ركوب الدراجات الحرارية المحددة في الجدول3، بما في ذلك نقاط جمع البيانات.
- حدد SYBR كصبغة الفلورسنت وحدد غير معروف كنوع العينة وإدراج اسم في المربع اسم العينة الصحيح.
ملاحظة: تمييز بين ال ينسخ وأيضا بين ال [ليسّووسفير] و [أس-أكتين] آبار. - اختر موقع ملف لحفظ البيانات التجريبية، وتأكد من إيقاف تشغيل المصباح في نهاية التشغيل، ثم بدء التشغيل.
ملاحظة: كما الخطوة الأولى هي مرحلة RT، يتم جمع أي بيانات خلال هذا الوقت، وبالتالي، إذا كان المصباح يتطلب فترة الاحماء يمكن أن يحدث هذا خلال مرحلة RT. الجهاز في الوقت الحقيقي والبرمجيات سوف عرض منحنيات التضخيم في الوقت الحقيقي، في حين سيتم إنشاء منحنى ذوبان في نهاية الدورة.
4- تحليل البيانات
-
بمجرد الانتهاء من تشغيل تنفيذ تحليل البيانات كما يلي.
- أولا تحليل نتائج مؤامرة تضخيم عينات الاختبار جنبا إلى جنب مع عينات التحكم. تعرض العينات الإيجابية سلالم أسية، تليها عادة هضبة وقيمةC t. عينات سلبية عرض قطع التضخيم شقة مع عدم وجود قيمر C (الشكل1A). يتم حساب قيمةC t تلقائياً بواسطة البرنامج، على الرغم من أنه يجب فحص هذا وتغييرها يدويًا إذا لزم الأمر.
- ثانياً، تحليل نتائج منحنى التفكك لعينات الاختبار إلى جانب عينات التحكم. عينة إيجابية سيكون لها درجةحرارة ذوبان (T م) 77 - 80 درجة مئوية، وتتداخل مع السيطرة الإيجابية الشكل 1B).
- الحصول على نتيجة التشخيص الكلي عن طريق التأكد من صحة عناصر التحكم. استخدم الجدول 4 لتفسير النتائج فيما يتعلق بالتحكم الداخلي في الأكتين. إذا كانت عينات التحكم الموجبة سالبة و/أو العينات السالبة موجبة، يجب تجاهل التشغيل.
- تسجيل قيم Ct و Tm التي تم الحصول عليها للتحكم RNA في "بطاقة التحكم" لتمكين تحليل الاتجاه والمساعدة في تحديد الانجرافات في حساسية السحب.
Representative Results
بعد البروتوكول وصف أعلاه، وقد أظهرت حساسية pan-lyssavirus RT-PCR على سلسلة تخفيف من فيروس التحكم القياسية (CVS) (الشكل 1) ومجموعة من الفيروسات الليسا أخرى (الشكل 2والشكل 3). تم استخدام SYBR الأخضر أنا صبغ كعالمية خطوة واحدة RT-PCR، حيث يتم تنفيذ توليف cDNA وتضخيم PCR في أنبوب واحد. كما يحدث تضخيم الهدف المحدد، ومن ضم المزيد من الصبغة، مما أدى إلى زيادة مستويات الفلورة في الوقت الحقيقي. يجب تفسير جميع الاختبارات المتشابكة في الوقت الحقيقي على مرحلتين: التضخيم والتفكك. مرحلة التضخيم مطابق ة لأي تضخيم في الوقت الحقيقي (الشكل 1 ألف). وهناك "مرحلة مبكرة" خطية خلال الدورات المبكرة حيث لا يمكن حساب تضخيم الحمض النووي بسبب عدم كفاية الإشارة فيما يتعلق بالخلفية. ويرتبط طول هذا مباشرة إلى مقدار الهدف في العينة. في وقت لاحق، هناك مرحلة الأسي حيث يتم الكشف عن مضاعفة جزيئات الحمض النووي وتسجيلها. وأخيرا، يتم الوصول إلى مرحلة الهضبة (وبصرف النظر عن العينات المخففة للغاية التي قد لا تصل إلى هذه المرحلة قبل نهاية البرنامج). في هذه المرحلة ، فإن شدة مستويات الفلورة ، بسبب استنفاد الكواشف. قطع التضخيم التي لوحظت باستخدام تخفيف تسلسلي 10 أضعاف من CVS، مطابقة للمؤامرات المتوقعة (الشكل 1 ألفج) حيث أظهر التبيّر فيروس ليسا حساسية أعلى من مستوى الـ ß-actin. تم حساب منحنى التفكك بعد التضخيم، حيث تم فصل dsDNA إلى ssDNA عن طريق زيادة تدريجية في درجة الحرارة والفلورة رصدها كدالة لدرجة الحرارة (الشكل 1 باءمد - واو,). تسببت درجة حرارة العتبة التي ينفصل فيها amplicon المحدد في ssDNA، في إطلاق الفلورة، التي تم قياسها بواسطة برنامج الدراجات الحرارية (T)م). وقد وفرت مرحلة التفكك هذه بيانات عن حجم amplicon، مما مكن المستخدم من تفسير النتيجة بالمقارنة مع عنصر تحكم إيجابي، مما أدى إلى احتمال ضئيل للنتائج الإيجابية الكاذبة. ذا تيملوحظ لCVS باستخدام الإسبوروس (الشكل 1 باء) و [أس-أكتين] إنساي (الشكل 1 دال) متميزة، وساعدت المستخدم على تأكيد تحليل التحليل الصحيح من خلال ملاحظة Tمتم الحصول عليها (الشكل 1 هاء). وعلاوة على ذلك، فإن Cتيو Tمتم تقييم القيم بين التشغيل والمشغلين وتبين أن تكون قابلة للاستنساخ (الجدول 5). العتبة المستخدمة لحساب Cتيتم حساب القيمة تلقائيا من قبل البرنامج وتعتمد على العديد من العوامل، بما في ذلك مزيج رد الفعل أو أداة المستخدمة. على ال 12 يدير مستقلّة ال [ك] معلّةتيكان 20.66 (SD 0.63) لفحص فيروس ليسا و 27.5 (SD 1.13) لـ ß-actin assay. في المقابل فإن التباين الذي لوحظ في Tموكانت القيم أقل بشكل ملحوظ، وذلك بسبب عدم وجود تأثيرات خارجية على هذا القياس. على سبيل المثال، يعني Tمللحصول على فحص فيروس الليسا 78.92 (SD 0.16) (الجدول 5)، بالمقارنة مع متوسط جميع الفيروسات lyssas 78.81 درجة مئوية (SD 0.531) (الجدول 6والشكل 1 واو). هذا النقص في الاختلاف في Tمعبر Lyssavirusجنس مفيدة بما أنّ ال نفسه تحكم [رنا] يستطيع كنت استعملت [رلّيس وف] ال [ليسّوروس] في العينة, ولكن يُمْرّب بين الليسافيروس نوع يستعمل ال [ت]مغير ممكن، لا سيما لأن مختلف السلالات الفرعية RABV امتدت نطاق Tمالقيم التي لوحظت (الجدول 6). ونادراً ما تُلاحظ قطع التضخيم غير المحددة مع هذا التسيب؛ ومع ذلك، هناك حاجة إلى معلمات محددة لتعريف نتيجة إيجابية مقابل نتيجة سلبية غير محددة. تم تطبيق SD لوحظ في جميع الفيروسات lyssaviruses (0.531) على أدنى (77.34 - LBVa) وأعلى (79.67 - IKOV) لاحظ Tمقيم لتعيين نطاق 76.8 درجة مئوية - 80.2 درجة مئوية للنطاقات المحددة الإيجابية. لذلك، Tماعتبرت قيم خارج هذا مدى [نون-سبسفيك] ولذلك نتيجة سلبيّة. في بعض الأحيان لوحظ قمم متعددة لعينة. إذا كانت الذروة المهيمنة في T الصحيحم(لكل تكرار) ثم تعتبر العينة إيجابية. السبب الأكثر شيوعا ً هو ملاحظة ذروة غير محددة يرجع إلى التمهيدي ديمرز، وقد تم تحسين فحص للحد من الدمامل التمهيدي. التمهيدي الخافتات عادة ما يؤدي إلى amplicon أصغر من ذلك من التسلسل المستهدف، وبالتالي سيكون Tمأقل من المنتج المحدد.
تم تشغيل 10 أضعاف التخفيف التسلسلي من ثلاثة lyssavirus عينة الدماغ الإيجابية RNAs المستخرجة باستخدام TRIzol، في نفس الوقت وتآمر (الشكل2). وتفاوتت حدود الكشف عن الفيروسات اللايسا الثلاثة، ولكن لم يتجاوز أي منها Ct 36. وتراوحت قيم معامل R2 للفيروسات المرسومة في الشكل 2 بين 0.9637 و0.996. لجميع الفيروسات التي تمتحليلها (الجدول 6) لم يتجاوز النطاق هذا، وعلاوة على ذلك، كان 7 من 29 lyssavirus R2 > 0.99 (البيانات غير مبينة). مع الأخذ في الاعتبار أن إعداد سلسلة التخفيف هو من إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي، والخطية التي لوحظت يوفر دليلا على أن الاختبار قوي. وأخيراً، تم التحقيق في الكشف عن جميع أنواع فيروس ليسا (ولا سيما فيروسات الفيلوغروب الثالث الأكثر تنوعاً) باستخدام لوحة من RNAs تغطي جميع المجموعات الثلاثة في جنس فيروس ليسا. تم استخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من الفئران الأصلية أو المصابة تجريبياً، مادة الدماغ، باستخدام البروتوكولات الموضحة أعلاه. وتؤكد النتائج أن التمهيديات تضخيم جميع أنواع فيروس ليسا، بما في ذلك التباينة فيلوجروب الثالث lyssaviruses IKOV، WBCV و LLEBV (الجدول6 والشكل 3). تم فحص لوحة متنوعة من الفيروسات الروماتيزمية غير الليسافيروس، التي تم جمعها وتحليلها في الأصل antigenically16، ومؤخرا وراثيا17 وتم الكشف عن عدم وجود تفاعل عبر، مما يدل على أن التمهيديات محددة ل أعضاء جنس Lyssavirus فقط (البيانات غير المعروضة). وقد تم إدراج اختبار عموم lyssavirus في الوقت الحقيقي في EURL (مختبر المراجع الاتحاد الأوروبي) خطط الكفاءة بين المختبرات منذ عام 2013، مما يدل على توافق 100٪ مع الاختبارات الجزيئية الأخرى مثل اختبار اللايسمان pan-lyssavirus و فحص RT-PCR التقليدية بالإضافة إلى FAT (اختبار الأجسام المضادة الفلورسنت).
الشكل 1: تخفيف تسلسلي 10 أضعاف من CVS التحكم الإيجابي RNA، تشغيل على اختبار PAN-lyssavirus RT-PCR، تصور على أنها مؤامرة تضخيم (A)، ومنحنى التفكك (B)، وتشغيلها على ß-actin RT-PCR كما تصور كما مؤامرة التضخيم (C)، و منحنى التفكك (D). NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. مقارنة التحكم CVS RNA تشغيل على كل من عموم lyssavirus RT-PCR الاختبار (الأزرق) وß-actin RT-PCR الاختبار (الأحمر) مما يدل على الفرق في منحنيات التفكك (E) - انظر الجدول 5 للاطلاع على القيم المتوسطة; وأخيرا منحنيات التفكك لLBVa (الأزرق) وIKOV (الأحمر) مما يدل على مجموعة من القيم Tم لوحظ ت عبر جنس Lyssavirus (F ). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف لثلاثة أنواع من فيروس الليسا: RABV (RV108) وDUVV (RV131) وARAV (RV3379). R2 = 0.996 و 0.9962 و 0.9637 على التوالي. وصلت نقاط البيانات عند 10-7 (0.0001 نانوغرام/ميكرولتر) إلى حد الكشف (حيث تم الحصول على قيمة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بيانات التخفيف التسلسلي التمثيلية 10 أضعاف من جميع أنحاء جنس فيروس Lyssa (انظر الأساطير الفردية للهوية فيروس ليسا والجدول 6 للاطلاع على النتائج المجدولة بالمقارنة مع الفيروسات الليسافية الأخرى). لوحات A، C، E، G مخططات التضخيم و B، D، F، H منحنيات التفكك لA، C، E، وG على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| كاشف | μL / رد فعل |
| الدرجة الجزيئية المياه | 7.55 |
| 2X العالمي RT PCR مزيج رد الفعل | 10 سنوات |
| التمهيدي إلى الأمام [20 درجة مئوية] | 0.6 |
| التمهيدي عكس [20 درجة مئوية] | 0.6 |
| مزيج إنزيم RT | 0.25 |
| المجموع لكل رد فعل | 19 سنة |
الجدول 1: الكواشف الرئيسية لمزيج RT-PCR في الوقت الحقيقي.
| مقايسه | اسم التمهيدي | دور التمهيدي | تسلسل 5'-3' | المنصب1 |
| فيروس ليسا | JW12 | RT-PCR | ATG TAA CAC CYC TAC AAT G | 53-73 |
| N165 | Pcr | GCA GGG TAY TTR TAC TCA TA TA | 165-146 | |
| ß-actin | ß-actin intronic | Pcr | CGA TGA AGA TCA AGA TCA TTG | 1051-1072 |
| ß-actin عكس | RT-PCR | AAG CAT TTG CGG TGG AC | 1204-1188 | |
| وترد مواضع التمهيدي فيما يتعلق بتسلسل فيروس باستور (M13215) وتسلسل الجينات الماوس ß-actin (NM_007393) | ||||
الجدول 2: تفاصيل التمهيدي RT-PCR في الوقت الحقيقي.
| المرحله | دورات | درجه الحراره | الوقت | جمع البيانات |
| النسخ العكسي | 1 | 50 درجة مئوية | 10 دقائق | |
| تعطيل RT/ الإزالة الأولية | 1 | 95 درجة مئوية | 5 دقائق | |
| التضخيم | 40 | 95 درجة مئوية | 10 s | |
| 60 درجة مئوية | 30 s | نقطة النهاية | ||
| تحليل منحنى التفكك | 1 | 9 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| 55 درجة مئوية | 1 دقيقة | |||
| 55 - 95 درجة مئوية | 10 s | جميع النقاط |
الجدول 3: ظروف ركوب الدراجات في الوقت الحقيقي لـ RT-PCR.
| نتيجة الاختبار | التحكم الداخلي في الأكتين | النتيجة الإجمالية |
| السلبيه | عدد التعليقات1 | غير صالح. تكرار الاستخراج والقول بـ2 |
| السلبيه | ايجابيه | النتيجة السلبية المبلغ عنها |
| ايجابيه | ايجابيه | النتيجة الإيجابية المبلغ عنها |
| ايجابيه | عدد التعليقات1 | تكرار الاستخراج والقول 3 |
| 1 استخدام السيطرة الخارجية غير المتجانسة سيكون مفيدا ً أثناء الاستخراج المتكرر. | ||
| 2 إذا تم الحصول على نتيجة سلبية ثانية للتحكم الداخلي، سيتم الإبلاغ عن العينة على أنها غير قابلة للاختبار من خلال هذا الفحص. | ||
| 3 إذا تم الحصول على نتيجة سلبية ثانية للرقابة الداخلية، جنبا إلى جنب مع نتيجة اختبار إيجابية داء الكلب الثانوي | ||
| وينبغي إجراء اختبار التشخيص لتأكيد هذه النتيجة. | ||
الجدول 4: موجز النتائج والنتائج الإجمالية لمعدل فيروس الليسا في الوقت الحقيقي RT-PCR. يتم تعيين السلبية إلى عينة مع عدم وجود قيمةT C (تضخيم) وليس درجة حرارة ذوبان (تفكك)، أو درجة حرارة تذوب الذي هو خارج نطاق Tم للفيروسات lyssa إيجابية (76.8 درجة مئوية - 80.2 درجة مئوية). يتم تعيين إيجابية إلى عينة مع قيمةT C (تضخيم) ودرجة حرارة ذوبان (تفكك) الذي هو داخل نطاقM T للفيروسات lyssaviruses إيجابية.
| [ليسّووسفيس] إنقبا | ß-actin التساي | |||
| Ct | Tm | Ct | Tm | |
| يعني | 20.66 | 78.92 | 27.5 | 85.26 |
| Sd | 0.63 | 0.16 | 13 على كل شيء | 0.35 |
| LCL (95%) | 19.39 | 78.59 | 25.23 | 84.56 |
| UCL (95%) | 21.93 | 79.25 | 29.76 | 85.96 |
الجدول 5: التحليل البيني للتحكم الإيجابي في نظام CVS عبر 12 تشغيلًا مستقلًا بما في ذلك عوامل تشغيل متعددة.
| مجموعة فيلوجروب | الانواع | معرف الفيروس | النسب | حد الكشف | Tm |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV50 | الولايات المتحدة الخفافيش | 10-5 | 79.5 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV51 | الولايات المتحدة فوكس | 10-7 | 77.6 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV108 | شيلي الخفافيش | 10-7 | 78.63 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV313 | الثعلب الأوروبي | 10-9 | 78.53 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV437 | الراكدوغ الأوروبي | 10-7 | 78.09 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV1237 | الغزلان الأوروبية | 10-8 | 78.76 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV334 | اللقاح الصيني | 10-8 | 79.03 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV102 | أفريقيا 2 | 10-7 | 78.58 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV995 | أفريقيا 3(أ) | 10-8 | 79.66 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV410 | أفريقيا 3(ب) | 10-7 | 79.03 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV2324 | أفريقيا 4 | 10-7 | 79.17 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | RV2417 | سري لانكا الكلب | 10-9 | 78.71 |
| أولا | فى نهاية الـ4 لـ | CVS-11 | 10-7 | 79.17 | |
| أولا | EBLV-1 | RV20 | ألمانيا | 10-6 | 79.05 |
| أولا | EBLV-2 | RV1787 | بريطانيا | 10-7 | 78.76 |
| أولا | BBLV | RV2507 | ألمانيا | 10-9 | 78.71 |
| أولا | فى الانماع | RV634 | 10-8 | 78.25 | |
| أولا | DUVV | RV131 | 10-5 | 79.03 | |
| أولا | GBLV | RV3269 | 10-7 | 79.15 | |
| أولا | فى الانمازى | RV3379 | 10-7 | 79.46 | |
| أولا | KHUV | RV3380 | 10-7 | 78.97 | |
| أولا | محمد الدوسري | RV3381 | 10-7 | 78.59 | |
| أولا | فى الانمازى | RV3382 | 10-3 | 78.59 | |
| الثاني | LBVa | RV767 | 10-5 | 77.34 | |
| الثاني | LBVd | RV3383 | 10-7 | 78.59 | |
| الثاني | موكف | RV4 | 10-3 | 78.81 | |
| الثالث | IKOV | RV2508 | 10-5 | 79.67 | |
| الثالث | LLEBV | RV3208 | 10-4 | 79.15 | |
| الثالث | WCBV | RV3384 | 10-3 | 79 |
الجدول 6: موجز لخصوصية وحساسية وT لفيروسات الليسا التمثيلية في جميع المجموعات الثلاثة. وكان متوسط Tم عبر lyssaviruses 78.81 (SD 0.531).
Discussion
ال [بن-ليسفيروس] [رل-ر] [ر]-[ر] وصف إنقوسة [أن-بوب], [أن-ستب] إنقوس اتّصال أيّ يكشف [ليسفيروسس] عبر كلّ ثلاثة [فولوغوغر]. وقد تم التحقق من صحة الفحص لتشخيص داء الكلب الحيواني والبشري على حد سواء، بما في ذلك أنسجة الدماغ بعد الوفاة (جذع الدماغ الأمثل)، وعينات ما قبل الوفاة مثل خزعة الجلد، اللعاب الذي تم جمعه بشكل تسلسلي، أو السائل الشوكي الدماغي (CSF). وقد تم تصميم المواد التمهيدية المستخدمة في هذا الفحص واستخدامها لأول مرة في اختبار قائم على التحقيق للتمييز بين RABV وEBLV-1 وEBLV-23، والتي استخدمت في العديد من مختبرات داء الكلب OIE وينفذ باستمرار في خطط الكفاءة EURL. في وقت لاحق تم تأكيد طبيعة 'pan-lyssavirus' من هذه المواد التمهيدية باستخدام 2 خطوة في الوقت الحقيقي --15. وقد استخدم الاختبار الموصوف هنا المواد التمهيدية لزيادة تحسين RT-PCR في اختبار SYBR خطوة واحدة مما يتيح نظام مغلق ووسريع. وعلاوة على ذلك، أكد التدريب في البلدان الموبوءة بداء الكلب باستخدام هذا الفحص ملاءمة التنفيذ في أي مختبر مع معدات الوقاية الشخصية الأساسية ونظم الجودة للحد من التلوث المتبادل وعينات التتبع، ومرافق لتخزين الكواشف وفي الوقت الحقيقي آلة مع الكشف عن SYBR. فحص قوي للغاية ولها علاقة 100٪ مع FAT، معحساسية محسنة للعينات المتحللة 3. واحدة من المزايا الرئيسية لصبغة الحمض النووي intercalating على أساس اختبار بالمقارنة مع التحقيق على أساس الاختبار هو التكلفة النسبية. وهناك فائدة إضافية هي أن التبيّد لا يستخدم سوى اثنين من المواد التمهيدية، وبالتالي فإن خطر فشل الكشف بسبب الاختلاف في التسلسل، والذي كان نقطة ضعف في الاختبارات المستندة إلى التحقيق التي سبق نشرها. في الواقع، يتم الكشف عن ممثلي جميع أنواع فيروس lyssa (وبصرف النظر عن TWBLV وKBLV) باستخدام هذا التحليل، وتحليل تسلسل TWBLV وKBLV عبر المواقع التمهيدية يكشف عن أي اختلاف كبير مما يوحي بقوة أنه سيتم الكشف عنها أيضا باستخدام هذه الطريقة. نطاق الحد من الكشف لوحظ عبر الفيروسات التي تم تحليلها، يمكن اعتبار أن يكون بسبب عاملين رئيسيين. الأول هو أن الحمض النووي الريبي كان معزولا عن مواد الدماغ السريرية، وبالتالي فإن كمية نسخ الجينوم في كل عينة غير مخففة ليست قابلة للمقارنة مباشرة. تم "تطبيع" الحمض النووي الريبي عن طريق تعديل إجمالي الحمض النووي الريبي إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر. ومع ذلك، فإن نسبة الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي داخل تلك العينة سوف تختلف. والثاني هو تنوع تسلسل فيروس الليسا، على الرغم من أن المواقع التمهيدية تقع في المناطق المحفوظة، لا تزال هناك مواقف من الاختلاف. لذلك، فإنه ليس من المستغرب أن غالبية الفيروسات lyssaمع حساسية أقل للاستطلاع هي الفيروسات phylogroup II و III. ويمثل تحليل منحنى التفكك معلمة أساسية، مما يقلل إلى أدنى حد من النتيجة الإيجابية الزائفة التي يمكن أن تحدث لولا ذلك بسبب تشكيل أجهزة التديم التمهيدية، أو تضخيم منطقة غير محددة في الجينوم المضيف. في الواقع، وهذا هو حدث نادر وتحليل منحنى التفكك يعادل تشغيل هلام أغاروز لتصور الحجم الصحيح التقليدية RT-PCR amplicons. تم توفير مجموعة من القيم TM المقبولة (77-80 درجة مئوية)، استنادا ً إلى البيانات التي تم جمعها في مختبرنا. ويوصى بشدة بأن تقوم فرادى المختبرات بتجميع البيانات الداخلية لضمان نقل النطاق وتعديله وفقا لذلك. إن تفسير النتائج من كل من قطع التضخيم والتفكك، إلى جانب الضوابط الإيجابية والسلبية ونتائج الأكتين، يمكّن من تحقيق نتائج تشخيصية قوية وقابلة للاستنساخ.
خارج نطاق هذا البروتوكول هو طريقة استخراج RNA المستخدمة للحصول على الحمض النووي الريبي عالية الجودة. تم إعداد جميع الحمض النووي الريبي تحليلها في هذا البروتوكول باستخدام TRIzol; ومع ذلك، هناك العديد من البروتوكولات مناسبة استخراج الحمض النووي الريبي القائم على guanidium المتاحة، بما في ذلك العمود ومجموعات استخراج على أساس حبة. ويجب أن يكون التعامل مع عينات فيروس الليسا الإيجابية (أو المشتبه فيها إيجابية) داخل مرافق الاحتواء البيولوجي المرخص لها المعتمدة داخل البلد. ومع ذلك، فإن مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج غير معدي، وبالتالي يتم التعامل معه داخل مختبرات الاحتواء المنخفض. واعتمادا على طريقة الاستخراج المستخدمة، سيلزم تقييم شرط التحديد الكمي للRNA والتخفيف منه. وبالنسبة للاستخراج القائم على الفينول، بما في ذلك TRIzol، فإن هذه الخطوة مطلوبة وتمنع تثبيط الاختبار من تلويث الجدنا؛ ومع ذلك، فإن الاستخراج القائم على العمود والخرز (لا سيما تلك التي تعاني من مرحلة استنفاد الحمض النووي) لا تتطلب التخفيف قبل الاختبار.
وفي جميع أجزاء البروتوكول، من الضروري استخدام الرعاية والعناية لمنع التلوث المتبادل والإضافة الدقيقة للعينة إلى الآبار الصحيحة. يتوفر جدول بيانات مع حسابات الكاشف وتخطيط اللوحة للتنزيل كملف تكميلي. الممارسات المختبرية الجيدة، بما في ذلك أسطح العمل النظيفة، والتغيرات المنتظمة في القفازات، واستخدام نصائح الحاجز وغرف مختلفة / خزانات الأشعة فوق البنفسجية لفصل كل مرحلة سوف تقلل من فرصة التلوث. للتأكد من تنفيذ الاختبار مع المعلمات المتوقعة، يجب تضمين عناصر التحكم الإيجابية والسلبية وتشغيل كافة نماذج الاختبار في تكرار (أو ثلاثية).
إدراج الضوابط هو سمة أساسية من سمات أي PCR، وخاصة بالنسبة للتشخيص. تم إعداد الحمض النووي الريبي التحكم الإيجابي من CVS (معيار فيروس التحدي) العقول الماوس المصابة على دفعات والتحقق من صحتها ومعايرة لضمان الاتساق بين دفعات. تم تحديد الحمض النووي الريبي للتحكم كمياً وتم تخفيفه إلى 1 ميكروغرام/ميكرولتر. تم تخزين الحمض النووي الريبي التحكم الإيجابي في -80 درجة مئوية في 10-1 aliquots. وعند الاقتضاء، تم تخفيف العليكوت 1:100 لتوفير مخزون عامل عند 1 نانوغرام/ميكرولتر وتخزينه عند -80 درجة مئوية في 5 ميكروات من العليكوتات ذات الاستخدام الواحد. تم استخدام الحمض النووي الريبي للتحكم الإيجابي المخفف لتمثيل عينات إيجابية منخفضة المستوى، ولضمان الكشف عن أي انخفاض في حساسية الفحص. تم الاحتفاظ بـ "بطاقة تحكم" لكل عنصر تحكم لمراقبة قيمC t وتحديد الاتجاهات (الجدول5). ويبين الجدول 5 قابلية جيدة للمقارنة بين الدورات بالنسبة لعينات التحكم الإيجابية في نظام CVS Ct and Tm القيم عبر عدة أيام والمشغلين، مما يوفر الطمأنينة بأن التبيّد قوي وقابل للاستنساخ. وينبغي التحقيق في النتائج التي تحيد عن هذه القياسات وتكرار عينات الاختبار إذا لزم الأمر. تم تضمين المياه الصف الجزيئي في كل تشغيل كالمجلس الوطني الانتقالي للتأكد من الكواشف كانت خالية من التلوث مع الحمض النووي الريبي lyssavirus وتأكيد عينة سلبية. وعلاوة على ذلك، لضمان فعالية استخراج الحمض النووي الريبي، تم اختبار ß-actin جنبا إلى جنب مع عينات الاختبار في أنبوب منفصل. كما تم استخدام الحمض النووي الريبي للتحكم الإيجابي في lyssavirus للتحكم الإيجابي في الأكتين. ويمكن استخدام جينات محلية أخرى أو نظم تحكم داخلي غير متجانسة. تضمن استخدام عناصر التحكم هذه تحليل كافة الخطوات بنفس شروط نماذج الاختبار. في بعض الأحيان، إذا كانت العينة متدهورة للغاية أو لم تحتوي على ما يكفي من الحمض النووي الريبي المضيف (مثل اللعاب أو CSF)، يمكن أن تفشل PCR الجينات الذاتية. في هذه الحالة، حيث كانت نتيجة LYssavirus في الوقت الحقيقي RT-PCR إيجابية، تأكيد على استخراج الحمض النووي الريبي مستقلة - لاستبعاد التلوث أثناء استخراج الحمض النووي الريبي على الاختبار الأصلي أو عن طريق اختبار ثانوي (إما الجزيئية، مثل التقليدية RT-PCR) ، أو FAT. وقد كفل استخدام الجدول 4 أثناء تحليل عينة تشخيصية التفسير الصحيح.
بغض النظر عن الاختبار الجزيئي المستخدم لتأكيد عدوى داء الكلب، ينبغي أيضاً إجراء متابعة التحقيقات باستخدام تسلسل Sanger لتحديد أنواع فيروس ليسا والتقنيات الكلاسيكية في علم الفيروسات مثل FAT أو عزل الفيروس للسماح مزيد من توصيف الفيروس ودعم الإخطار بالحالات الإيجابية إلى منظمة الصحة العالمية ومنظمة الصحة العالمية.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن يشكرا الآنسة إيما وايز والآنسة ميغان غولدينغ على مساعدتهما في إنجاز التجارب. وقد تلقى تطوير هذا البروتوكول دعما ماليا من وزارة البيئة والأغذية والشؤون الريفية في المملكة المتحدة والحكومة الاسكتلندية والحكومة الويلزية من خلال المنح [SV3500 وSE0431] ومشروع "الأرشيف العالمي للفيروسات الأوروبية" (EVAg) الذي تلقى تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاقية المنح رقم 653316.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
| Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
| Centrifuge (mico) | Sigma | ||
| Finnpipettes (to dispense 0.5-1,000 µL) | Thermofisher | various | |
| iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
| MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
| MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
| Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
| Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
| Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
| Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
| Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
| Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
| Unless stated, alternative equipment can be used |
References
- OIE. OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).
- Panning, M., et al. Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).
- Wakeley, P. R., et al. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).
- Wang, L., et al. A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence. Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).
- Wadhwa, A., et al. A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258 (2017).
- Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. I. Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1484-1497 (2009).
- Hoffmann, B., et al. Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR "double check" strategy. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3970-3978 (2010).
- Faye, M., et al. Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus. Journal of Virological Methods. 243, 120-130 (2017).
- Dacheux, L., et al. Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- Marston, D. A., et al. Ikoma lyssavirus, highly divergent novel lyssavirus in an african civet. Emerging Infectious Diseases. 18 (4), 664-667 (2012).
- ICTV. Virus Taxonomy: 2018 Release: Email ratification October 2018 (MSL #33). , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hayman, D. T., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Calisher, C. H., et al. Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods. Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).
- Aznar-Lopez, C., et al. Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats. Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).
