Summary
Denne real-time RT-PCR ved hjælp af dsDNA interkalerende farvestof er egnet til at diagnosticere lyssavirus infektioner. Metoden begynder med RNA ekstraheret fra rabies mistanke ante-mortem eller post mortem prøver, detaljer Master Mix forberedelse, RNA tilføjelse, opsætning af realtid maskine og korrekt fortolkning af resultater.
Abstract
Molekylære assays er hurtige, følsomme og specifikke, og er blevet centrale for diagnosticering af rabies. PCR-baserede assays er blevet udnyttet i årtier til at bekræfte rabies diagnosticering, men er først for nylig blevet accepteret af OIE (Verdensorganisationen for Dyresundhed) som en primær metode til påvisning af rabies infektion. Real-time RT-PCR assays leverer realtidsdata og er lukkede rørsystemer, hvilket minimerer risikoen for kontaminering under opsætningen. DNA interkalating vha real-time RT-PCR assays kræver ikke dyre sonder, minimering af omkostningerne pr prøve, og når primere er designet i bevaret regioner, analyser, der er specifikke på tværs af virus slænger snarere end specifikke for blot én virus arter er mulige. Her beskriver vi en pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay, der registrerer Lyssavira på tværs af lyssavirus slægten, herunder de mest divergerende vira ikov, WCBV og llebv. I forbindelse med analysen af dissociations kurven er denne analyse følsom og specifik med den fordel at detektere alle lyssavirus arter. Analysen er blevet vedtaget i mange diagnostiske laboratorier med kvalitetssikrede miljøer, muliggør robust, hurtig, følsom diagnose af dyr og menneskelige rabiestilfælde.
Introduction
Diagnosticering af rabies ved hjælp af molekylære metoder blev godkendt af OIE i 20181, idet det anerkendte fordelene ved disse teknikker i forbindelse med bekræftelse af rabiestilfælde, især i situationer, hvor prøverne er suboptimale, eller til ante-mortem-diagnosticering da der ikke er noget krav om levende virus eller friske prøver. PCR-assays for Lyssavira kræver en omvendt transkription (RT), før PCR kan påbegyndes, da genomet er RNA. RT-PCR assays, der detekterer 3 ' proksimale region af genomet betragtes som den mest følsomme, som transkriptionelle gradienter forekomme under lyssavirus replikation. Almindeligt anvendte RT-PCR assays kan opdeles bredt i to kategorier, end-point (eller gel-baserede) og realtid. Begge tilgange er følsomme og specifikke; realtids analysen har imidlertid nogle ekstra fordele, såsom opnåelse af resultater i realtid og udføres i et helt lukket rørsystem, hvorved potentialet for operatør kontaminering mindskes. Der er to vigtigste tilgange til at opdage lyssavirus-specifikke amplikoner opnået ved hjælp af real-time assays. Den første bruger hydrolyse sonder (såsom taqman sonder), som indeholder en fluoroforet og en QUENCHER. Når sonden binder sig til målområdet under amplificeringen, resulterer polymerasens exonucleaseaktivitet i dissociation af fluoroforet og QUENCHER, hvilket gør det muligt at måle den resulterende fluorescens. Den anden bruger et DNA-interkalerende farvestof (fluorchrom som SYBR Green), der binder sig til dobbeltstrenget DNA under forstærkning. De bundne fluorchromes udsender fluorescens, som detekteres ved hver cyklus, hvilket gør det muligt at registrere og kvantificere produktet i realtid. På grund af den ikke-specifikke karakter af binding til nogen dsDNA, foretages en dissociation kurve analyse for at bekræfte specificiteten af reaktionen. Real-time rt-pcrs er hurtige på grund af de små amplikonen størrelser, typisk mindre end 200 BP i længden; men at identificere egnede regioner til at designe primere og sonder i bevaret regioner, kan vise sig udfordrende, derfor fjerne kravet om en sonde er en klar fordel.
En række realtids-rt-pcrs er designet til specifikt at afsløre individuelle stammer eller nedstamningens af rabv2 og også til at detektere Lyssavira på tværs af slægten3,4,5,6, 7,8,9. Alle assays vil have en detektionsgrænse afhængig af hvordan bevaret primer (og om nødvendigt sonde) sekvenser er på tværs af slægten. Faktisk kan nye eller nye virusstammer gøre de meget specifikke sonde-baserede assays ineffektive. Valget af realtids detektering (Dye vs. Probe) vil afhænge af den tilsigtede anvendelse. For et laboratorium, der fører tilsyn med lokalt fremskaffede hjerne materialer og forventer et stort antal negative prøver, er brugen af det billigere interkalerende farvestof et fornuftigt valg. Den SYBR grønne tilgang ville også være optimal, når der udføres scanning overvågning, hvor tilstedeværelsen af nye eller divergerende Lyssavira ville forblive uopdaget af mere begrænsede sonde-baserede assays.
Alle medlemmer af slægten lyssavirus forårsager sygdommen rabies, som er dødelig, når symptomerne vises. Langt de fleste mennesker og dyr rabiestilfælde skyldes rabiesvirus (RABV), den dominerende reservoir, som er den indenlandske hund10. Flagermus er vigtige vært reservoirer for Lyssavira og alle, men to lyssavirus arter karakteriseret er blevet identificeret direkte i flagermus — Ikoma lyssavirus (IKOV) og Mokola virus (MOKV) — og af disse to, IKOV er blevet spekuleret til at have en bat vært reservoir 11. ud over de 16 anerkendte lyssavirus arter12, der er to Lyssavira, der for nylig er blevet beskrevet: Taiwan bat lyssavirus (twblv)13 og kotalahti bat lyssavirus (kblv)14. Lyssavira kan være genetisk opdelt i tre phylogroups, med de fleste Lyssavira, herunder RABV, tilhører phylogroup I. Men, de mest divergerende Lyssavira tilhører phylogroup III og er usandsynligt, at blive opdaget af RT-PCRs designet til at målrette RABV eller phylogroup I virus sekvenser.
Analysen beskrevet her udnytter real-time primer pair JW12-N165, først beskrevet i 20053. Primere var designet til at være pan-lyssavirus, omend den oprindelige ansøgning var som en TaqMan assay med sonder til at differentiere lyssavirus arter. Efterfølgende bekræftelse af, at primer pair var pan-lyssavirus i specificitet blev opnået ved hjælp af en 2-trins SYBR real-time assay på alle lyssavirus arter til rådighed, herunder WCBV15. Primer pair er beskrevet her i en en-trins RT-PCR real-time assay udnytte en grafit fluorochrome, valideret ved hjælp af repræsentanter fra alle 16 anerkendte lyssavirus arter. Denne et-trins real-time assay er en hurtig, følsom, lyssavirus-specifik analyse og viser, at robustheden af primer sæt til at identificere selv meget divergerende lyssavirus arter.
Protocol
Prøver fra diagnostisk materiale modtaget på APHA efter naturlig infektion eller fremstillet ved inokulerende mus ved hjælp af protokoller, som er vurderet af APHA ' etiske og statistiske udvalg i henhold til UK Home Office Regulations under licens 70/7394.
1. kvantificering af RNA ved hjælp af et Mikrovolumen-Spektrofotometer
- Sørg for, at spektrofotometrets indstillinger er indstillet til RNA.
- Brug 1-2 μL Molekylær vand til at initialisere maskinen og indstille en baseline.
- Brug 1-2 μL af hver test-RNA-prøve til at vurdere RNA-mængden.
- Gem aflæsninger og dokumenter.
- Om nødvendigt justeres RNA til 1 μg/μL.
Bemærk: RNA skal på alle tidspunkter holdes på is (eller i en kølig blok). Hvis RNA opnås ved hjælp af en kolonne eller perle baseret metode, er RNA sædvanligvis mindre end 1 μg/μL. I denne situation bruge RNA pæn.
2. klargøring af RNA-Fortyndingsserier til bestemmelse af slutpunkts følsomhed
-
Lav en 10-fold seriel fortynding af RNA.
- Etiket rørene med fortyndings serien (f. eks. 10-1, 10-2osv.) og RNA-detaljerne.
- Tilsæt 45 μL molekyl kvalitet vand til hvert rør.
- Tilsæt 5 μL RNA (tidligere fortyndet til 1 μg/μL) og bland godt.
- Kassér pipettespidsen i et passende desinfektionsmiddel, og Udskift den med en ny spids.
- Tag 5 μL fra 10-1 og tilsæt til 10-2 rør og bland godt.
- Gentag 2.1.3-2.1.5 med de resterende fortyndinger.
Bemærk: RNA skal på alle tidspunkter holdes på is (eller i en kølig blok).
3. forberedelse af real tids-RT-PCR-reaktioner
- Ved hjælp af et regneark skal du planlægge pladens layout i henhold til antallet af testprøver og kontrolprøver for både lyssavirus-og ß-actin-assays.
Bemærk: Hvis 4 prøver skal testes i duplikat med en positiv og negativ kontrol, dette svarer til 10 reaktioner for begge assays. - I et "Clean Room" eller et område, der er adskilt fra RNA-skabelonen, skal du tørre overfladerne ned med et passende desinfektionsmiddel før brug eller forberede en PCR-arbejdsstation (hvis du bruger). For at forberede arbejdsstationen skal du tørre kabinettets overflade af med en passende desinficering og anbringe de nødvendige elementer i arbejdsstationen og lukke dørene. Tænd for UV-lampen i 10 minutter
- Fjern regenter og primere fra fryseren og tø (reagenser anført i tabel 1 og primere i tabel 2).
Bemærk: Enzym blandingen opbevares i glycerol, så den kræver ikke optøning og skal holdes på is (eller i en kølig blok) på alle tidspunkter. Alle andre reagenser kan optøet ved stuetemperatur. - Når optøet, bland reagenserne og centrifuge kort for at indsamle væske.
Bemærk: Du må ikke vortex enzymet mix, bare centrifuge kort. - Forbered separate Master blandinger til lyssavirus og ß-actin. For hver reaktion tilsættes 7,55 μL molekyl kvalitet vand, 10 μL 2x Universal SYBR Green Reaction mix, 0,6 μL fremad primer, 0,6 μL omvendt primer, 0,25 μL iTaq RT-enzym blanding.
- Brug et regneark til at beregne korrekte diskenheder for at undgå fejl i manuel beregning. Sørg for nok Master-Mix er parat til at kompensere for pipetteringsfejl. Hvis der er behov for 10 reaktioner (Se NOTE i 3,1), skal du tilberede 12 reaktioner
- Forbered Master-mix på is (eller i en kølig blok) og forblive på isen, indtil de placeres i realtid maskine.
- Bland de forberedte Master blandinger, centrifuge kort, og lad 19 μL løbe ud i de relevante huller i Strip rørene eller en 96 brønd plade, der er kompatibel med den realtids maskine, der er i brug.
Bemærk: Minimere produktionen af bobler i brøndene, mens pipettering. - I et separat rum eller i et UV-kabinet, der er fremstillet som beskrevet i 3,2, tilsættes omhyggeligt 1 μL af RNA, der tidligere er justeret til 1 μg/μL (Se trin 1,5) under overfladen af den relevante Master-Mix brønd og blandes forsigtigt. Kassér pipettespidsen i desinfektionsmidlet direkte efter brug (under overfladen).
- Tilføj kontrolelementerne efter testprøverne, med den positive kontrol tilføjet næste og ingen skabelon kontrol (NTC-Molekylær kvalitet vand) tilføjet sidste. Mængden af RNA, der anvendes, kan ændres afhængigt af prøve typen og den anvendte RNA-ekstraktion. Det anvendte beløb skal valideres for at sikre, at reaktionen optimeres.
- Tætningsplade med Strip låg eller sealer, der sørger for at sikre, at alle lågene er forsvarligt lukket og etiketteres tilstrækkeligt til at orientere prøverne. Mærk kanten af pladen/Strip rørene.
- Drej prøverne ned ved hjælp af en centrifuge for at samle al væsken i bunden af brøndene.
- Overfør pladen til real-time PCR-maskinen, Åbn døren og Placer den i holderen for at sikre, at prøvernes placering/retning er korrekt i henhold til pladens layout.
Bemærk: Hvis der anvendes rørstrimler, så sørg for, at holderen er på plads. - Åbn real-time PCR Machine program og vælg muligheden for SYBR real-time eksperiment med dissociation kurve. Programmer realtids-PCR-maskinen ved hjælp af de termiske cykelforhold, der er angivet i tabel 3, herunder dataindsamlings stederne.
- Vælg Sybr som det fluorescerende farvestof, og vælg Ukendt som eksempel type, og Indsæt et navn i boksen korrekt eksempel navn.
Bemærk: Skelne mellem replikater og også mellem lyssavirus og ß-actin brønde. - Vælg en filplacering for at gemme de eksperimentelle data, Sørg for, at lampen vil blive slukket i slutningen af kørslen, og start derefter kørslen.
Bemærk: Da det første trin er et RT-stadie, indsamles der ingen data i denne periode, og hvis lampen derfor kræver en opvarmningstid, kan dette ske i RT-fasen. Real-time maskine og software vil vise forstærknings kurver i realtid, mens smelte kurven vil blive genereret i slutningen af cyklussen.
4. data analyse
-
Når kørslen er fuldført, skal du udføre dataanalysen på følgende måde.
- Analysér først forstærknings plot resultaterne af testprøverne sammen med kontrolprøverne. Positive prøver viser eksponentielle ramper, normalt efterfulgt af plateau og en Ct værdi. Negative prøver viser flade forstærknings parceller uden Ct -værdier (figur 1a). Ct -værdien beregnes automatisk af softwaren, selv om dette skal kontrolleres og manuelt ændres, hvis det er nødvendigt.
- For det andet, analysere dissociation kurve resultater af testprøverne sammen med kontrolprøverne. En positiv prøve vil have en smeltetemperatur (Tm) 77 – 80 °c og overlappe den positive kontrol figur 1b).
- Opnå det overordnede diagnose resultat ved at sikre, at kontrollerne er gyldige. Brug tabel 4 til at fortolke resultaterne i forhold til den interne ß-actin-kontrol. Hvis de positive kontrolprøver er negative, og/eller de negative prøver er positive, skal der ses bort fra kørslen.
- Registrer de Ct -og tm -værdier, der er opnået for kontrol-RNA i et ' kontrolkort ' for at muliggøre tendensanalyse og hjælpe med at identificere driver i analyse følsomheden.
Representative Results
I følge ovennævnte protokol blev følsomheden af Pan-lyssavirus RT-PCR påvist på en fortyndings serie af kontrolstandard virus (CVS) (Figur 1) og en række andre Lyssavira (Figur 2OgFigur 3). SYBR Green I Dye blev udnyttet som en universel en-trins RT-PCR, hvor cDNA-syntese og PCR amplifikation udføres i et enkelt rør. Da amplificeringen af det specifikke mål opstår, er mere farvestof bundet, hvilket resulterer i realtids forhøjede niveauer af fluorescens. Alle farvestof interkalating real-time assays skal fortolkes i to faser: forstærkning og dissociation. Forstærknings fasen er identisk med enhver realtids forstærkning (Figur 1A). Der er en lineær "tidlig fase" i de tidlige cyklusser, hvor DNA-amplifikation ikke kan beregnes på grund af utilstrækkeligt signal i forhold til baggrunden. Længden af dette er direkte relateret til mængden af Target i prøven. Efterfølgende er der en eksponentiel fase, hvor fordoblingen af DNA-molekyler opdages og registreres. Endelig er plateaufasen nået (bortset fra de stærkt fortyndede prøver, som ikke kan nå denne fase inden udgangen af programmet). I denne fase, intensiteten af fluorescens niveauer ud, på grund af konsumption af reagenser. De forstærknings parceller, der er observeret ved hjælp af en 10-fold seriel fortynding af CV'ERNE, er konforme til de forventede observationsområder (Figur 1AC), hvor lyssavirus-analysen udviste en højere følsomhed end ß-actin-analysen. Dissociations kurven blev beregnet efter forstærkning, hvor dsDNA blev dissocieret til ssDNA ved en trinvis temperaturstigning og fluorescensen, der overvåges som funktion af temperatur (Figur 1B, D-F). Den tærskel temperatur, hvor den specifikke amplikonen dissocierer til ssdna, forårsagede en frigivelse af fluorescens, som blev målt af termocycler softwaren (TM). Denne dissociations fase gav data om amplikonen-størrelsen, hvilket gjorde det muligt for brugeren at fortolke resultatet i forhold til en positiv kontrol, hvilket resulterede i en ubetydelig sandsynlighed for falsk positive resultater. Den TMobserveret for CVS ved brug af Pan-lyssavirus-analysen (Figur 1B) og ß-actin-assay (Figur 1D) er særskilte, og hjalp brugeren til at bekræfte den korrekte analyse analysen ved at notere TMopnåetFigur 1E). Desuden er CTog TMværdier mellem kørsler og operatorer blev vurderet og vist at være reproducerbare (Tabel 5). Den tærskel, der anvendes til at beregne CTværdien blev beregnet automatisk af softwaren og afhængig af mange faktorer, herunder reaktionsblandingen eller det anvendte instrument. Over de 12 uafhængige kørsler den gennemsnitlige CT20,66 (SD 0,63) til lyssavirus-analysen og 27,5 (SD 1,13) til ß-actin-analysen. I modsætning til den observerede variation i TMværdier var markant lavere på grund af manglende eksterne påvirkninger af denne måling. For eksempel, den gennemsnitlige TMfor CVS lyssavirus-analysen var 78,92 (SD 0,16) (Tabel 5) sammenlignet med middelværdien af alle Lyssavira 78,81 °C (SD 0,531) (Tabel 6OgFigur 1F). Denne mangel på variation i TMpå tværs af Lyssavirusslægten er fordelagtig, da det samme kontrol-RNA kan anvendes uanset lyssavirus i prøven, men differentierer mellem lyssavirusarterne ved hjælp af TMikke er muligt, især fordi forskellige RABV sub-lineages strakte rækken af TMobserverede værdier (Tabel 6). Ikke-specifikke amplifikationsområder observeres sjældent med denne analyse; der kræves dog specifikke parametre for at definere et positivt resultat vs. et ikke-specifikt negativt resultat. SD observeret på tværs af alle Lyssavira (0,531) blev påført den laveste (77,34-LBVa) og højeste (79,67-IKOV) observeret TMværdier til at indstille en rækkevidde 76,8 °C-80,2 °C for positive specifikke bånd. Derfor, TMværdier uden for dette interval blev betragtet som ikke-specifikke og derfor et negativt resultat. Lejlighedsvis observeres flere toppe for en prøve. Hvis den dominerende peak er på den korrekte TM(for hver replikat) betragtes prøven som positiv. Den mest almindeligt årsag en ikke-specifik peak observeres skyldes primer-dimers, analysen er blevet optimeret til at minimere primer dimers. Primer-dimere resulterer typisk i en amplikonen, der er mindre end målsekvensen, og vil derfor have en TMlavere end det specifikke produkt.
En 10-fold seriel fortynding af tre lyssavirus positive hjernen prøve RNAs ekstraheret ved hjælp af TRIzol, blev kørt parallelt og plottet (figur 2). Detektionsgrænsen for de tre Lyssavira varierede, men ingen overskredet Ct 36. R2 -koefficient værdierne for de vira, som er afbildet i figur 2 , varierede fra 0,9637 og 0,996. For alle analyserede vira (tabel 6) var intervallet ikke overstige dette, desuden 7 af de 29 lyssavirus havde R2 > 0,99 (data ikke vist). Under hensyntagen til, at forberedelsen af fortyndings serien er fra totale RNA-ekstraktioner, giver lineariteten evidens for, at analysen er robust. Endelig blev påvisning af alle lyssavirus arter (især de mest forskelligartede phylogroup III-vira) undersøgt ved hjælp af et panel af RNAs, der spænder over alle tre fylogrupper i lyssavirusslægten . RNA udvundet fra enten originale, eller eksperimentelt inficerede mus, hjernemateriale, blev udnyttet ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet ovenfor. Resultaterne bekræfter, at primere forstærker alle lyssavirus arter, herunder de divergerende phylogroup III Lyssavira IKOV, WBCV og LLEBV (tabel 6 og figur 3). Et mangfoldigt panel af ikke-lyssavirus rhabdovira, oprindeligt indsamlet og analyseret antigenisk16, og for nylig genetisk17 blev screenet og ingen-Cross reaktivitet blev påvist, hvilket indikerer, at primere er specifikke for kun medlemmer af slægten lyssavirus (data ikke vist). Realtids analysen af Pan-lyssavirus er blevet inkluderet i de tværgående præstationsordninger for EURL (EU reference laboratorium) siden 2013, hvilket viser 100% overensstemmelse med andre molekylære assays såsom pan-lyssavirus TaqMan-assay og konventionelle RT-PCR-assay ud over fedt (fluorescerende antistof test).
Figur 1:10-fold seriel fortynding af CVS positive Control RNA, køre på Pan-lyssavirus RT-PCR assay, visualiseret som forstærknings plot (A), og dissociation kurve (B), og køre på ß-actin RT-PCR assay visualiseret som forstærknings plot (C), og dissociations kurven (D). NTC = ingen skabelon kontrol. Sammenligningen af CVS Control RNA kører på både pan-lyssavirus RT-PCR-analysen (blå) og ß-actin RT-PCR-analysen (rød), som viser forskellen i dissociations kurver (E) — Se tabel 5 for gennemsnitsværdier; og endelig dissociation kurver for LBVa (blå) og IKOV (rød) viser intervallet af Tm værdier observeret på tværs af lyssavirus slægt (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:10-fold serielle fortyndinger til tre lyssavirus arter: RABV (RV108), DUVV (RV131) og ARAV (RV3379). R2 = henholdsvis 0,996, 0,9962 og 0,9637. Data punkter ved 10-7 (0,0001 ng/μl) nåede detektionsgrænsen (hvor en værdi blev opnået). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative 10-fold serielle fortyndings data fra tværs af lyssavirus slægten (Se individuelle legender for lyssavirus identitet og tabel 6 for tabulerede resultater i forhold til andre Lyssavira). Paneler a, c, e, G amplifikation plots og B, D, F, H dissociation kurver for henholdsvis A, c, e og g. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | μL/reaktion |
| Molekyle kvalitet vand | 7,55 |
| 2x Universal RT PCR-reaktionsblanding | 10 |
| Primer fremad [20 μM] | 0,6 |
| Primer omvendt [20 μM] | 0,6 |
| RT-enzym blanding | 0,25 |
| I alt pr. reaktion | 19 |
Tabel 1: pan-lyssavirus real-time RT-PCR Master Mix reagenser.
| Analyse | Primer-navn | Primer-rolle | Sekvens 5 '-3 ' | Position1 |
| Lyssavirus | JW12 | RT-PCR | ATG TAA CAC CYC TAC AAT G | 53-73 |
| N165 | Pcr | GCA GGG TAY TTR TAC TCA TA | 165-146 | |
| ß-actin | ß-actin intronic | Pcr | CGA TGA AGA TCA AGA TCA TTG | 1051-1072 |
| ß-actin omvendt | RT-PCR | AAG KAT TTG CGG TGG AC | 1204-1188 | |
| Primer positioner er givet i forhold til Pasteur virus sekvens (M13215) og mus ß-actin gen sekvens (NM_007393) | ||||
Tabel 2: pan-lyssavirus real-time RT-PCR primer detaljer.
| Fase | Cykler | Temperatur | Tid | Data indsamling |
| Omvendt transskription | 1 | 50 °C | 10 min | |
| RT inaktivering/Initial denaturering | 1 | 95 °C | 5 min | |
| Forstærkning | 40 | 95 °C | 10 s | |
| 60 °C | 30 s | slutpunkt | ||
| Analyse af dissociations kurve | 1 | 9 °C | 1 min | |
| 55 °C | 1 min | |||
| 55-95 °C | 10 s | alle punkter |
Tabel 3: pan-lyssavirus real-time RT-PCR-cykelforhold.
| Test resultat | Intern ß-actin-kontrol | Samlet resultat |
| Negative | Negative1 | Ugyldig. Gentagen ekstraktion og analyse2 |
| Negative | Positive | Negativt resultat rapporteret |
| Positive | Positive | Positivt resultat rapporteret |
| Positive | Negative1 | Gentagen ekstraktion og analyse3 |
| 1 Brug af heterologe ekstern kontrol ville være gavnlig under gentagen ekstraktion. | ||
| 2 Hvis der opnås et andet negativt resultat for den interne kontrol, vil prøven blive indberettet som uholdbar ved denne analyse. | ||
| 3 Hvis der opnås et andet negativt resultat for den interne kontrol, sammen med et positivt test resultat, er en sekundær rabies | ||
| der bør foretages en diagnostisk test for at bekræfte dette resultat. | ||
Tabel 4: Resumé af resultater og samlede resultater for pan-lyssavirus real-time RT-PCR. Negativ er angivet til en prøve uden Ct -værdi (forstærkning) og ingen smeltetemperatur (dissociation) eller en smeltetemperatur, som er udenfor tm -intervallet for positive lyssavira (76,8 °c-80,2 °c). Positiv er udpeget til en prøve med en Ct -værdi (forstærkning) og en smeltetemperatur (dissociation), som er inde i tm -intervallet for positive Lyssavira.
| Lyssavirus-analyse | ß-actin-analyse | |||
| Ct | Tm | Ct | Tm | |
| Mener | 20,66 | 78,92 | 27,5 | 85,26 |
| Sd | 0,63 | 0,16 | 1,13 | 0,35 |
| LCL (95%) | 19,39 | 78,59 | 25,23 | 84,56 |
| UCL (95%) | 21,93 | 79,25 | 29,76 | 85,96 |
Tabel 5: Inter-Run analyse af CVS positiv kontrol på tværs af 12 uafhængige kørsler, herunder flere operatører.
| Phylogroup | Arter | Virus-ID | Lineage | Detektionsgrænse | Tm |
| I | RABV | RV50 | US bat | 10-5 | 79,5 |
| I | RABV | RV51 | US Fox | 10-7 | 77,6 |
| I | RABV | RV108 | Chile bat | 10-7 | 78,63 |
| I | RABV | RV313 | Europæisk ræv | 10-9 | 78,53 |
| I | RABV | RV437 | European RacDog | 10-7 | 78,09 |
| I | RABV | RV1237 | Europæiske hjorte | 10-8 | 78,76 |
| I | RABV | RV334 | Kinesisk vaccine | 10-8 | 79,03 |
| I | RABV | RV102 | Afrika 2 | 10-7 | 78,58 |
| I | RABV | RV995 | Afrika 3a | 10-8 | 79,66 |
| I | RABV | RV410 | Africa 3b | 10-7 | 79,03 |
| I | RABV | RV2324 | Afrika 4 | 10-7 | 79,17 |
| I | RABV | RV2417 | Sri Lanka hund | 10-9 | 78,71 |
| I | RABV | CVS-11 | 10-7 | 79,17 | |
| I | EBLV-1 | RV20 | Tyskland | 10-6 | 79,05 |
| I | EBLV-2 | RV1787 | Uk | 10-7 | 78,76 |
| I | BBLV | RV2507 | Tyskland | 10-9 | 78,71 |
| I | ABLV | RV634 | 10-8 | 78,25 | |
| I | DUVV | RV131 | 10-5 | 79,03 | |
| I | GBLV | RV3269 | 10-7 | 79,15 | |
| I | ARAV | RV3379 | 10-7 | 79,46 | |
| I | KHUV | RV3380 | 10-7 | 78,97 | |
| I | SHIBV | RV3381 | 10-7 | 78,59 | |
| I | IRKV | RV3382 | 10-3 | 78,59 | |
| Ii | LBVa | RV767 | 10-5 | 77,34 | |
| Ii | LBVd | RV3383 | 10-7 | 78,59 | |
| Ii | MOKV | RV4 | 10-3 | 78,81 | |
| Iii | IKOV | RV2508 | 10-5 | 79,67 | |
| Iii | LLEBV | RV3208 | 10-4 | 79,15 | |
| Iii | WCBV | RV3384 | 10-3 | 79 |
Tabel 6: Resumé af Pan-lyssavirus real-time RT-PCR specificitet, følsomhed og Tm for repræsentative Lyssavira på tværs af alle tre phylogroups. Den gennemsnitlige Tm på tværs af Lyssavira var 78,81 (SD 0,531).
Discussion
Pan-lyssavirus realtid RT-PCR assay beskrevet er en lukket-tube, One-Step assay, der registrerer Lyssavira på tværs af alle tre phylogroups. Analysen er blevet valideret for både dyre-og human rabies diagnose, herunder post mortem-hjernevæv (optimalt hjernestammen), og ante-mortem-prøver såsom hudbiopsi, serielt indsamlede spyt eller cerebral spinalvæske (CSF). Primere anvendt i denne analyse blev først designet og udnyttet til en sonde-baseret analyse til at skelne mellem RABV, EBLV-1 og EBLV-23, som er blevet anvendt i mange OIE rabies laboratorier og udfører konsekvent i eurl præstationsordninger. Efterfølgende er "Pan-lyssavirus"-karakteren af disse primere blevet bekræftet ved hjælp af en 2-trins real-time assay15. Den analyse, der er beskrevet her, har udnyttet primere til yderligere at optimere RT-PCR i en et-trins SYBR-analyse, der muliggør et lukket rør, hurtigt system. Desuden har uddannelse i rabies-endemiske lande, der anvender denne analyse, bekræftet egnethed til at gennemføre i ethvert laboratorium med grundlæggende PV-og kvalitetssystemer for at reducere krydskontaminering og spor prøver, faciliteter til opbevaring af reagenserne og en realtids maskine med SYBR detektion. Analysen er ekstremt robust og har 100% korrelation med fedt, med forbedret følsomhed for nedbrudte prøver3. En af de vigtigste fordele for en DNA-interkalerende farvestofbaseret assay i forhold til en sonde baseret analyse er de relative omkostninger. En yderligere fordel er, at analysen kun udnytter to primere, derfor er der mindre risiko for mislykket detektion på grund af sekvens divergens, som har været en svaghed i tidligere offentliggjorte sonde-baserede assays. Faktisk er repræsentanter for alle lyssavirus arter (bortset fra TWBLV og KBLV) detekteret ved hjælp af denne analyse, og Sekvensanalyse af TWBLV og KBLV på tværs af primer sites afslører ingen signifikant divergens tyder på, at de også vil blive opdaget ved hjælp af denne metode. Rækken af detektionsgrænse observeret på tværs af de analyserede vira, kan anses for at være på grund af to hovedfaktorer. Den første er, at RNA blev isoleret fra klinisk hjernemateriale, derfor er mængden af genom kopier i hver ufortyndet prøve ikke direkte sammenlignelig. RNA blev ' normaliseret ' ved at justere det totale RNA til 1 μg/μL; andelen af virusgenom RNA i prøven vil dog variere. Den anden er mangfoldigheden af lyssavirus sekvenser, på trods af primer sites er placeret i bevaret regioner, der forbliver positioner af variation. Derfor er det ikke overraskende, at størstedelen af Lyssavira med lavere følsomhed for analysen er phylogroup II og III vira. Analysen af dissociations kurven er en væsentlig parameter, der minimerer et falsk positivt resultat, som ellers kunne opstå på grund af dannelsen af primer-dimere eller forstærkning af en ikke-specifik region i værts genomet. I virkeligheden er dette en sjælden begivenhed, og dissociations kurven analyse svarer til at køre en agrose gel til at visualisere korrekt størrelse konventionelle RT-PCR amplicons. Rækken af acceptable Tm -værdier er blevet tilvejebragt (77-80 °c) baseret på de data, der er indsamlet i vores laboratorium. Det anbefales kraftigt, at de enkelte laboratorier samler in-House data for at sikre, at sortimentet kan overføres og ændres i overensstemmelse hermed. Fortolkningen af resultaterne fra både forstærknings-og dissociations plottet sammen med de positive og negative kontroller og ß-actin-resultaterne muliggør robuste og reproducerbare diagnostiske resultater.
Uden for rammerne af denne protokol er RNA udvinding metode, der anvendes til opnåelse af høj kvalitet RNA. Alle RNA analyseret i denne protokol blev udarbejdet ved hjælp af TRIzol; Men, der er mange egnede guanidium-baserede ekstraktioner RNA ekstraktions protokoller tilgængelige, herunder kolonne og perle-baserede ekstraktions kits. Håndtering af lyssavirus positive (eller formodede positive) prøver skal være inden for de licenserede bioindeslutnings faciliteter, der er godkendt i landet. Det totale RNA-ekstraherede stof er imidlertid ikke-infektiøs og håndteres derfor i laboratorier med lav indeslutning. Afhængigt af den anvendte ekstraktionsmetode skal kravet om kvantificering og fortynding af RNA vurderes. For phenol-baserede ekstraktioner, herunder TRIzol, er dette trin påkrævet og forhindrer hæmning af analysen i at forurere gDNA; dog kræver kolonne-og perle baserede ekstraktioner (især dem med en DNA-udtynding) ikke fortynding før testning.
I hele protokollen er det vigtigt, at pleje og flid bruges til at forhindre krydskontaminering og nøjagtig tilsætning af prøve til de korrekte brønde. Et regneark med reagens beregninger og plade layout kan downloades som en supplerende fil. God laboratoriepraksis, herunder rene arbejdsflader, regelmæssige ændringer af handsker, brug af barriere spidser og forskellige rum/UV-kabinetter for at adskille hvert trin vil minimere risikoen for kontaminering. For at sikre, at testen klarer sig med de forventede parametre, skal der inkluderes positive og negative kontroller, og alle testprøver køres i to eksemplarer (eller tre eksemplarer).
Inkludering af kontrol er et væsentligt element i enhver PCR, især for diagnostik. Positiv kontrol RNA blev fremstillet af CVS (Challenge virus standard) inficerede musehjerner i partier og valideret og kalibreret for at sikre konsistens mellem batcher. Kontrol-RNA blev kvantificeret og fortyndet til 1 μg/μL. RNA, for hvilket der blev opnået et positivt resultat i en seriel fortynding ned til mindst 10-4 (svarende til 100 PG/μl), blev anset for egnet til formålet. Den positive kontrol RNA blev opbevaret ved-80 °C i 10-1 aliquoter. Når det er nødvendigt, blev en alikvot fortyndet 1:100 til at forsyne en arbejds bestand med 1 ng/μL og opbevaret ved-80 °C i 5 μL engangs-aliquoter. Det fortyndede positive kontrol RNA blev brugt til at repræsentere positive prøver på lavt niveau og til at sikre, at enhver reduktion i analysens følsomhed blev påvist. Der blev holdt et» kontrolkort «for hver kontrol for at overvåge Ct -værdierne og identificere tendenserne (tabel 5). Tabel 5 viste god Inter-Run sammenlignelighed for CVS positive Control Sample Ct og tm værdier på tværs af flere dage og operatører, hvilket giver vished for, at analysen er robust og reproducerbar. Resultater, der afviger fra disse målinger, bør undersøges, og prøve prøverne gentages om nødvendigt. Molekylær kvalitet vand blev inkluderet i hver kørsel som en NTC at bekræfte reagenserne var fri for kontaminering med lyssavirus RNA og bekræfte en negativ prøve. For at sikre RNA-ekstraktions effekten blev ß-actin desuden testet sammen med testprøverne i et separat rør. Lyssavirus positive Control RNA blev også anvendt til ß-actin positive Control. Andre endogene gener eller heterologe interne kontrolsystemer kan udnyttes. Brugen af disse kontroller sikrede, at alle trin blev analyseret under de samme betingelser som testprøverne. Lejlighedsvis, hvis prøven var meget forringet eller ikke indeholder tilstrækkelig vært RNA (såsom spyt eller CSF), kan den endogene gen PCR mislykkes. I dette tilfælde, hvor lyssavirus real-time RT-PCR resultat var positiv, bekræftelse på en uafhængig RNA-ekstraktion-at udelukke kontaminering under RNA ekstraktion på den oprindelige test eller ved en sekundær test (enten molekyle, såsom konventionel RT-PCR) eller fedt. Anvendelse af tabel 4 under analyse af en diagnostisk prøve sikrede den korrekte fortolkning.
Uanset den molekylære analyse, der anvendes til at bekræfte rabies infektion, opfølgende undersøgelser ved hjælp af sanger sekventering at bestemme lyssavirus arter og klassiske teknikker i virologi såsom fedt eller virusisolation bør også foretages for at give mulighed for yderligere viruskarakterisering og støtteanmeldelsen af positive tilfælde til OIE og WHO.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Miss Emma Wise og Miss Megan Golding for at hjælpe med at færdiggøre eksperimenterne. Udviklingen af denne protokol blev finansielt støttet af det britiske ministerium for miljø, fødevarer og landdistrikter (defra), den skotske regering og den walisiske regering ved tilskud [SV3500 og SE0431] og af det europæiske virus Archive Global (EVAg) projekt, der har modtaget støtte fra eu's Horisont 2020-forsknings-og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale nr. 653316.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
| Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
| Centrifuge (mico) | Sigma | ||
| Finnpipettes (to dispense 0.5-1,000 µL) | Thermofisher | various | |
| iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
| MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
| MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
| Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
| Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
| Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
| Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
| Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
| Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
| Unless stated, alternative equipment can be used |
References
- OIE. OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).
- Panning, M., et al. Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).
- Wakeley, P. R., et al. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).
- Wang, L., et al. A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence. Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).
- Wadhwa, A., et al. A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258 (2017).
- Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. I. Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1484-1497 (2009).
- Hoffmann, B., et al. Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR "double check" strategy. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3970-3978 (2010).
- Faye, M., et al. Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus. Journal of Virological Methods. 243, 120-130 (2017).
- Dacheux, L., et al. Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- Marston, D. A., et al. Ikoma lyssavirus, highly divergent novel lyssavirus in an african civet. Emerging Infectious Diseases. 18 (4), 664-667 (2012).
- ICTV. Virus Taxonomy: 2018 Release: Email ratification October 2018 (MSL #33). , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hayman, D. T., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Calisher, C. H., et al. Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods. Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).
- Aznar-Lopez, C., et al. Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats. Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).
