Summary
यह वास्तविक समय आरटी-पीसीआर dsDNA intercalating डाई का उपयोग lyssavirus संक्रमण का निदान करने के लिए उपयुक्त है। विधि रेबीज संदिग्ध पूर्व-मर्चन या पोस्टमार्टम नमूनों से निकाले गए आरएनए के साथ शुरू होता है, मास्टर मिश्रण तैयारी, आरएनए इसके अलावा, वास्तविक समय मशीन की स्थापना और परिणामों की सही व्याख्या का विवरण।
Abstract
आण्विक परख तेजी से कर रहे हैं, संवेदनशील और विशिष्ट, और रेबीज के निदान के लिए केंद्रीय बन गए हैं. पीसीआर आधारित परख का उपयोग रेबीज निदान की पुष्टि करने के लिए दशकों से किया गया है, लेकिन हाल ही में रेबीज संक्रमण का पता लगाने के लिए प्राथमिक विधि के रूप में ओआईई (विश्व संगठन फॉर एनिमल हेल्थ) द्वारा स्वीकार किया गया है। वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख वास्तविक समय डेटा प्रदान करते हैं, और बंद कर रहे हैं ट्यूब सिस्टम, सेटअप के दौरान संदूषण के जोखिम को कम से कम. डीएनए intercalating फ्लोरोक्रोम वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख महंगी जांच की आवश्यकता नहीं है, प्रति नमूना लागत को कम करने, और जब प्राइमर संरक्षित क्षेत्रों में डिजाइन किए हैं, assays कि वायरस वंश भर में विशिष्ट हैं बजाय सिर्फ एक वायरस के लिए विशिष्ट प्रजातियों संभव हैं. यहाँ हम एक पैन-lysavirus SYBR वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख है कि Lyssavirus जीनस भर में lyssaviruses का पता लगाता है का वर्णन, सबसे अलग वायरस IKOV, WCBV और LLEBV सहित. वियोजन वक्र विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में, इस परख संवेदनशील और विशिष्ट है, सभी lyssavirus प्रजातियों का पता लगाने के लाभ के साथ. परख गुणवत्ता आश्वासन वातावरण के साथ कई नैदानिक प्रयोगशालाओं में अपनाया गया है, मजबूत सक्षम, तेजी से, पशु और मानव रेबीज मामलों के संवेदनशील निदान.
Introduction
आणविक पद्धतियों का उपयोग कर रेबीज का निदान 20181में OIE द्वारा स्वीकार किया गया था , रेबीज मामलों की पुष्टि में इन तकनीकों के लाभों को पहचानने, विशेष रूप से स्थितियों में जब नमूने उप इष्टतम हैं, या पूर्व-मर्चन निदान के लिए, के रूप में वहाँ लाइव वायरस या ताजा नमूने के लिए कोई आवश्यकता नहीं है. lyssaviruses के लिए पीसीआर assays एक रिवर्स प्रतिलेखन की आवश्यकता (आरटी) से पहले पीसीआर शुरू कर सकते हैं के रूप में जीनोम आरएनए है. आरटी-पीसीआर परख कि जीनोम के 3' समीपस्थ क्षेत्र का पता लगाने सबसे संवेदनशील माना जाता है, के रूप में ट्रांसक्रिप्शनल gradients lysavirus प्रतिकृति के दौरान होते हैं. आम तौर पर इस्तेमाल किया आरटी-पीसीआर assays मोटे तौर पर दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है, अंत बिंदु (या जेल आधारित) और वास्तविक समय. दोनों दृष्टिकोण संवेदनशील और विशिष्ट होते हैं; हालांकि, वास्तविक समय परख 'वास्तविक समय' में परिणाम प्राप्त करने और एक पूरी तरह से बंद ट्यूब प्रणाली में प्रदर्शन किया जा रहा है, जिससे ऑपरेटर संदूषण के लिए क्षमता को कम करने के रूप में कुछ अतिरिक्त लाभ है. वास्तविक समय परख का उपयोग कर प्राप्त lyssavirus-विशिष्ट amplicons का पता लगाने के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण हैं. पहले hydrolysis जांच का इस्तेमाल करता है (जैसे TakMan जांच के रूप में) कि एक फ्लोरोफोर और एक कतार होते हैं. जब जांच प्रवर्धन के दौरान लक्ष्य क्षेत्र के लिए बांधता है, बहुलक के exonuclease गतिविधि fluorophore और क्वेन्चर के विघटन में परिणाम, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट मापा जा करने के लिए सक्षम करने. दूसरा एक डीएनए intercalating डाई का इस्तेमाल करता है (इस तरह के SYBR ग्रीन के रूप में fluorochrome) कि प्रवर्धन के दौरान फंसे डीएनए डबल करने के लिए बांध. बाध्य फ्लोरोक्रोम्स फ्लोरोक्रोम्स का उत्सर्जन करते हैं जो प्रत्येक चक्र में पाया जाता है, जिससे उत्पाद का वास्तविक समय का पता लगाने और परिमाणीकरण की अनुमति मिल जाती है। किसी भी dsDNA के लिए बाध्यकारी की गैर-विशिष्ट प्रकृति के कारण, प्रतिक्रिया की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए एक वियोजन वक्र विश्लेषण किया जाता है। वास्तविक समय आरटी-पीसीआर छोटे amplicon आकार के कारण तेजी से कर रहे हैं, आम तौर पर लंबाई में कम से कम 200 बीपी; हालांकि, संरक्षित क्षेत्रों में प्राइमर और जांच डिजाइन करने के लिए उपयुक्त क्षेत्रों की पहचान करना चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है, इसलिए जांच की आवश्यकता को दूर करना एक विशिष्ट लाभ है।
वास्तविक समय आरटी-पीसीआर की एक संख्या विशेष रूप से व्यक्तिगत उपभेदों या RABV2 के वंश का पता लगाने के लिए और भी जीनस3,4,5,6भर में lysaviruses का पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया है, 7,8,9. सभी परख कैसे प्राइमर संरक्षित पर निर्भर का पता लगाने की एक सीमा होगी (और यदि आवश्यक हो, जांच) दृश्यों जीनस भर में हैं. वास्तव में, उभरते या उपन्यास वायरस उपभेदों अत्यधिक विशिष्ट जांच आधारित परख अप्रभावी प्रदान कर सकते हैं. वास्तविक समय का पता लगाने (डीई बनाम जांच) की पसंद का इरादा आवेदन पर निर्भर करेगा. स्थानीय रूप से sourced मस्तिष्क सामग्री पर निगरानी का आयोजन एक प्रयोगशाला के लिए और नकारात्मक नमूनों की उच्च संख्या की उम्मीद, सस्ता intercalating डाई का उपयोग एक समझदार विकल्प है. SYBR ग्रीन दृष्टिकोण भी इष्टतम होगा जब स्कैनिंग निगरानी का आयोजन जहां उपन्यास या भिन्न lysaviruses की उपस्थिति अधिक प्रतिबंधित जांच आधारित परख द्वारा पता नहीं चल रहेगा.
जीनस लिसावायरस के सभी सदस्य रोग रेबीज का कारण बनते हैं, जो लक्षण दिखाई देने के बाद घातक होता है। मानव और पशु रेबीज के अधिकांश मामले रेबीज वायरस (आरएबीवी) के कारण होते हैं, जिसके लिए प्रमुख जलाशय घरेलू कुत्ता10है . चमगादड़ lyssaviruses के लिए महत्वपूर्ण मेजबान जलाशय हैं और सभी लेकिन दो lyssavirus प्रजातियों विशेषता चमगादड़ में सीधे पहचान की गई है - Ikoma lyssavirus (IKOV) और मोकोला वायरस (MOKV) - और इन दोनों में से, IKOV एक बल्ले मेजबान जलाशय है अनुमान लगाया गया है 11. 16 मान्यता प्राप्त lyssavirus प्रजातियों12के अलावा , वहाँ दो lyssaviruses है कि हाल ही में वर्णित किया गया है: ताइवान बैट lysavirus (TWBLV)13 और Kotalahti बल्ले lysavirus (KBLV)14. Lyssaviruses आनुवंशिक रूप से तीन phylgroups में विभाजित किया जा सकता है, lysaviruses के बहुमत के साथ, RABV सहित, phylogroup I से संबंधित. हालांकि, सबसे अलग lyssaviruses phylogroup III के हैं और RABV या phylogroup मैं वायरस दृश्यों को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन आरटी पीसीआर द्वारा पता लगाया जा करने की संभावना नहीं है।
यहाँ वर्णित परख वास्तविक समय प्राइमर जोड़ी JW12-N165, पहली बार 20053में वर्णित का इस्तेमाल करता है. प्राइमर को पैन-lysavirus होने के लिए डिजाइन किया गया था, हालांकि मूल आवेदन lysavirus प्रजातियों में अंतर करने के लिए जांच के साथ एक TakMan परख के रूप में किया गया था। बाद में पुष्टि है कि प्राइमर जोड़ी विशिष्टता में पैन-lysavirus था WCBV15सहित उपलब्ध सभी lyssavirus प्रजातियों पर एक 2 कदम SYBR वास्तविक समय परख का उपयोग प्राप्त किया गया था. प्राइमर जोड़ी यहाँ एक एक कदम आरटी-पीसीआर वास्तविक समय परख एक intercalating फ्लोरोक्रोम का उपयोग में वर्णित है, सभी 16 मान्यता प्राप्त lyssavirus प्रजातियों से प्रतिनिधियों का उपयोग मान्य. यह एक कदम वास्तविक समय परख एक तेजी से, संवेदनशील, lysavirus विशेष परख है और दर्शाता है कि प्राइमर की मजबूती भी अत्यधिक भिन्न lysavirus प्रजातियों की पहचान करने के लिए सेट.
Protocol
प्राकृतिक संक्रमण के बाद APHA में प्राप्त नैदानिक सामग्री से नमूने, या लाइसेंस के तहत ब्रिटेन के गृह कार्यालय के नियमों के तहत APHA नैतिकता और सांख्यिकीय समिति द्वारा मूल्यांकन प्रोटोकॉल का उपयोग कर चूहों inoculating द्वारा प्राप्त 70/
1. आरएनए की मात्रा एक माइक्रो मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की सेटिंग्स आरएनए के लिए सेट कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
- मशीन को प्रारंभ करने और एक आधार रेखा निर्धारित करने के लिए आणविक ग्रेड पानी के 1-2 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें।
- आरएनए मात्रा का आकलन करने के लिए प्रत्येक परीक्षण आरएनए नमूने के 1-2 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें।
- रीडिंग और दस्तावेज़ सहेजें.
- यदि आवश्यक हो, तो आरएनए को 1 डिग्री/
नोट: आरएनए बर्फ पर रखा जाना चाहिए (या एक शांत ब्लॉक में) हर समय. यदि आरएनए एक स्तंभ, या मनका आधारित विधि का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है आरएनए आमतौर पर कम से कम 1 g/ इस स्थिति में आरएनए साफ का उपयोग करें.
2. अंतिम बिंदु संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए आरएनए फैलाव श्रृंखला की तैयारी
-
आरएनए के एक 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ.
- तनुता श्रृंखला के साथ लेबल ट्यूब (उदा., 10-1, 10-2, आदि) और आरएनए विवरण.
- प्रत्येक ट्यूब के लिए आणविक ग्रेड पानी के 45 डिग्री एल जोड़ें.
- आरएनए के 5 डिग्री एल जोड़ें (पहले 1 डिग्री/
- उपयुक्त कीटाणुनाशक में पिपेट टिप का निपटान करें और एक ताजा टिप के साथ बदलें।
- 10-1 से 5 डिग्री सेल्सियस लें और 10-2 ट्यूब में जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
- शेष कमजोर पड़ने के साथ 2.1.3-2.1.5 दोहराएँ.
नोट: आरएनए बर्फ पर रखा जाना चाहिए (या एक शांत ब्लॉक में) हर समय.
3. वास्तविक समय आरटी पीसीआर प्रतिक्रियाओं की तैयारी
- एक स्प्रेडशीट का उपयोग करना, परीक्षण के नमूने और नियंत्रण के नमूने की संख्या के अनुसार प्लेट लेआउट की योजना, दोनों lyssavirus और जेड-actin assays के लिए.
नोट: यदि 4 नमूने एक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ डुप्लिकेट में परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, यह दोनों assays के लिए 10 प्रतिक्रियाओं के बराबर है. - आरएनए टेम्पलेट से अलग 'क्लीन रूम' या क्षेत्र में, पीसीआर कार्यकेंद्र (यदि उपयोग करते हुए) का उपयोग करने या तैयार करने से पहले एक उपयुक्त कीटाणुनाशक के साथ सतहों को साफ करें। कार्य केंद्र तैयार करने के लिए, एक उचित कीटाणुरहित के साथ कैबिनेट सतह पोंछें और कार्य केंद्र में आवश्यक वस्तुओं को रखें और दरवाजे बंद करें। 10 मिनट के लिए यूवी प्रकाश पर स्विच
- फ्रीजर और thaw से रीजेंट्स और प्राइमर निकालें (तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिकर्ता और तालिका 2में प्राइमर )।
नोट: एंजाइम मिश्रण ग्लिसरोल में संग्रहीत किया जाता है तो thawing की आवश्यकता नहीं है और बर्फ पर रखा जाना चाहिए (या एक शांत ब्लॉक में) हर समय. अन्य सभी अभिकर्मकों कमरे के तापमान पर thawed किया जा सकता है. - एक बार thawed, अभिकर्मकों और अपकेंद्रित्र संक्षेप में मिश्रण करने के लिए तरल इकट्ठा.
नोट: एंजाइम मिश्रण भंवर मत करो, बस अपकेंद्रण संक्षेप में. - lyssavirus और जेड-actin के लिए अलग मास्टर घोला जा सकता है तैयार करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, आणविक ग्रेड पानी के 7.55 डिग्री सेल्सियस, 2x यूनिवर्सल SYBR हरी प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 डिग्री एल, आगे प्राइमर के 0.6 $L, रिवर्स प्राइमर के 0.6 $L, iTaQ आरटी एंजाइम मिश्रण के 0.25 डिग्री एल जोड़ें।
- मैन्युअल परिकलन में त्रुटियों से बचने के लिए सही वॉल्यूम की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट का उपयोग करें. सुनिश्चित करें कि पर्याप्त मास्टर मिश्रण pipeting त्रुटि के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए तैयार है. इसलिए यदि 10 अभिक्रियाओं की आवश्यकता है (नोट में देखें 3-1), तो 12 अभिक्रियाएँ तैयार करें
- बर्फ पर मास्टर मिश्रण तैयार (या एक शांत ब्लॉक में) और बर्फ पर रहते हैं जब तक वास्तविक समय मशीन में रखा.
- तैयार मास्टर-मिक्स मिक्स करें, अपकेंद्रण संक्षिप्त रूप से और पट्टी ट्यूबों के प्रासंगिक कुओं या उपयोग में वास्तविक समय मशीन के साथ संगत एक 96 अच्छी तरह से थाली में 19 डिग्री सेल्सियस वितरित करें।
नोट: पाइपिंग के दौरान कुओं में बुलबुले के उत्पादन को कम करें। - एक अलग कमरे में, या एक यूवी कैबिनेट में के रूप में 3.2 में वर्णित तैयार, ध्यान से जोड़ने 1 $L आरएनए के पहले से समायोजित करने के लिए समायोजित 1 g/$L (चरण 1.5 देखें) उचित मास्टर मिश्रण की सतह के नीचे अच्छी तरह से और धीरे से मिश्रण. उपयोग (पृष्ठ के नीचे) के बाद सीधे कीटाणुनाशक में पिपेट टिप को छोड़ें।
- परीक्षण के नमूने के बाद नियंत्रण जोड़ें, सकारात्मक नियंत्रण के साथ अगले जोड़ा और कोई टेम्पलेट नियंत्रण (NTC - आणविक ग्रेड पानी) पिछले जोड़ा. आरएनए की मात्रा का इस्तेमाल किया नमूना प्रकार के आधार पर बदला जा सकता है, और आरएनए निष्कर्षण इस्तेमाल किया. उपयोग की गई राशि को यह सुनिश्चित करने के लिए मान्य किया जाना चाहिए कि प्रतिक्रिया ऑप्टिमाइज़ की गई है।
- सभी ढक्कन ों को मजबूती से बंद कर दिया गया है और नमूनों को उन्मुख करने के लिए पर्याप्त लेबल सुनिश्चित करने के लिए पट्टी ढक्कन या सीलर का उपयोग करके सील प्लेट। प्लेट/पट्टी ट्यूबों के किनारे को लेबल करें।
- कुओं के तल पर सभी तरल इकट्ठा करने के लिए एक अपकेंद्रित्र का उपयोग कर के नमूने नीचे स्पिन।
- वास्तविक समय पीसीआर मशीन के लिए स्थानांतरण प्लेट, प्लेट लेआउट के अनुसार नमूनों की सही स्थान /
नोट: यदि ट्यूब स्ट्रिप्स का उपयोग किया जाता है, सुनिश्चित करें कि धारक जगह में है. - वास्तविक समय पीसीआर मशीन प्रोग्राम को खोलें और वियोजन वक्र के साथ SYBR वास्तविक समय प्रयोग के लिए विकल्प का चयन करें। डेटा संग्रह बिंदुओं सहित तालिका 3में निर्दिष्ट थर्मल साइकिल चालन शर्तों का उपयोग कर वास्तविक समय पीसीआर मशीन कार्यक्रम।
- फ्लोरोसेंट डाई के रूप में SYBR का चयन करें और नमूना प्रकार के रूप में अज्ञात का चयन करें और सही नमूना नाम बॉक्स में एक नाम डालें।
नोट: प्रतिकृति के बीच और भी lyssavirus और जेड-actin कुओं के बीच अंतर. - प्रयोगात्मक डेटा को सहेजने के लिए कोई फ़ाइल स्थान चुनें, सुनिश्चित करें कि लैंप रन के अंत में बंद हो जाएगा, फिर रन प्रारंभ करें.
नोट: के रूप में पहला कदम एक RT चरण है, कोई डेटा इस समय के दौरान एकत्र किया जाता है, इसलिए, यदि दीपक एक गर्म अप अवधि की आवश्यकता होती है यह RT चरण के दौरान हो सकता है. वास्तविक समय मशीन और सॉफ्टवेयर, वास्तविक समय में प्रवर्धन घटता प्रदर्शित करेगा, जबकि पिघलने वक्र चक्र के अंत में उत्पन्न किया जाएगा.
4. डेटा विश्लेषण
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रन पूरा हो जाने के बाद डेटा विश्लेषण निम्नानुसार करें।
- पहले नियंत्रण नमूनों के साथ परीक्षण के नमूने के प्रवर्धन साजिश परिणामों का विश्लेषण. सकारात्मक नमूने घातीय रैंप प्रदर्शित करते हैं, आमतौर पर पठार और एक सीटी मूल्य के बाद। ऋणात्मक नमूने फ्लैट प्रवर्धन भूखंडों को प्रदर्शित करते हैं जिनके साथ कोई सीत मान नहीं होते हैं (चित्र 1क) । सीटी मान स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की है, हालांकि यह जाँच की जानी चाहिए और मैन्युअल रूप से बदल यदि आवश्यक हो.
- दूसरा, नियंत्रण नमूनों के साथ परीक्षण के नमूने के वियोजन वक्र परिणामों का विश्लेषण. एक धनात्मक नमूने का गलन का ताप (टच) 77 - 80 डिग्री सेल्सियस होगा तथा धनात्मक नियंत्रण चित्र 1खके साथ अतिव्यापन होगा।
- नियंत्रण मान्य हैं यह सुनिश्चित करके समग्र नैदानिक परिणाम प्राप्त करें। आंतरिक-अभिक्रिया नियंत्रण के संबंध में परिणामों की व्याख्या करने के लिए सारणी 4 का उपयोग की जाए। यदि सकारात्मक नियंत्रण नमूने नकारात्मक हैं और/या नकारात्मक नमूने सकारात्मक हैं, तो रन की उपेक्षा की जानी चाहिए।
- प्रवृत्ति विश्लेषण को सक्षम करने और परख संवेदनशीलता में drifts की पहचान करने में मदद करने के लिए एक 'नियंत्रण कार्ड' में नियंत्रण आरएनए के लिए प्राप्त सीटी और टीएम मूल्यों को रिकॉर्ड करें।
Representative Results
प्रोटोकॉल के बाद ऊपर का वर्णन, पैन-lysavirus RT-PCR की संवेदनशीलता नियंत्रण मानक वायरस (सीवीएस) की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला पर प्रदर्शन किया गया था (चित्र 1) और अन्य lyssaviruses की एक श्रृंखला (चित्र 2औरचित्र 3). SYBR ग्रीन मैं डाई एक सार्वभौमिक एक कदम आरटी-पीसीआर, जहां cDNA संश्लेषण और पीसीआर प्रवर्धन एक एकल ट्यूब में किया जाता है के रूप में उपयोग किया गया था. के रूप में विशिष्ट लक्ष्य के प्रवर्धन होता है, और अधिक डाई बाध्य है, फ्लोरोसेंट के वास्तविक समय में वृद्धि के स्तर में जिसके परिणामस्वरूप. सभी डाई intercalating वास्तविक समय परख दो चरणों में व्याख्या की जानी चाहिए: प्रवर्धन और वियोजन. प्रवर्धन चरण किसी भी वास्तविक समय प्रवर्धन के समान है (चित्र 1A). प्रारंभिक चक्र ों के दौरान एक रेखीय 'प्रारंभिक चरण' है जहां पृष्ठभूमि के संबंध में अपर्याप्त संकेत के कारण डीएनए प्रवर्धन की गणना नहीं की जा सकती है। इस की लंबाई सीधे नमूना में लक्ष्य की मात्रा से संबंधित है. बाद में, वहाँ एक घातीय चरण जहां डीएनए अणुओं के दोहरीकरण का पता लगाया है और दर्ज की गई है. अंत में, पठार चरण तक पहुँच गया है (अत्यधिक पतला नमूने जो कार्यक्रम के अंत से पहले इस चरण तक नहीं पहुँच सकता है के अलावा). इस चरण में, अभिकर्मकों की थकावट के कारण फ्लोरोसेंट के स्तर की तीव्रता। प्रवर्धन भूखंडों CVS के एक 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग कर मनाया, उम्मीद भूखंडों के अनुरूप (चित्र 1Aसी) जहां lyssavirus परख एक उच्च संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया जेड-actin परख से. वियोजन वक्र प्रवर्धन के बाद गणना की गई थी, जहां dsDNA तापमान में वृद्धि वृद्धि और तापमान के एक समारोह के रूप में निगरानी फ्लोरोसेंट द्वारा sdna में अलग किया गया था (चित्र 1B, डी-एफ). दहलीज तापमान जिस पर विशिष्ट amplicon ssDNA में अलग हो जाता है, फ्लोरोसेंट की एक रिहाई का कारण बना, जो थर्मोसाइकिलर सॉफ्टवेयर द्वारा मापा गया था (टीएम). इस वियोजन चरण amplicon आकार पर डेटा प्रदान की, उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में परिणाम की व्याख्या, झूठी सकारात्मक परिणाम की एक नगण्य संभावना में जिसके परिणामस्वरूप. द टीएमपैन-lysavirus परख का उपयोग कर CVS के लिए मनाया (चित्र 1B) और ]-एक्टिन परख (चित्र 1D) अलग हैं, और टी टिप्पण द्वारा सही परख विश्लेषण की पुष्टि करने के लिए उपयोगकर्ता सहायता प्राप्तएमप्राप्त (चित्र 1E). इसके अलावा, सीटीऔर टीएमरन और ऑपरेटरों के बीच मूल्यों का मूल्यांकन किया गया था और reproduible होना दिखाया गया (तालिका 5). C की गणना करने के लिए उपयोग की जाने वाली थ्रेशोल्डटीमूल्य सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से गणना की और प्रतिक्रिया मिश्रण या इस्तेमाल साधन सहित कई कारकों पर निर्भर था. 12 से अधिक स्वतंत्र रन मतलब सीटीथा 20.66 (एसडी 0.63) lyssavirus परख के लिए और 27.5 (एसडी 1.13) के लिए $-actin परख. इसके विपरीत टी में देखा परिवर्तनएममान स्पष्ट रूप से कम था, इस माप पर बाहरी प्रभावों की कमी के कारण. उदाहरण के लिए, माध्य Tएमसीवीएस lysavirus परख के लिए 78.92 (एसडी 0.16) (तालिका 5), जब सभी lyssaviruses 78.81 डिग्री सेल्सियस (एसडी 0.531) ( के मतलब की तुलना मेंतालिका 6औरचित्र 1F). टी में भिन्नता की यह कमीएमके पार Lyssavirusजीनस फायदेमंद है के रूप में एक ही नियंत्रण आरएनए नमूना में lyssavirus की परवाह किए बिना इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि टी का उपयोग lysavirus प्रजातियों के बीच differentiatingएमसंभव नहीं है, विशेष रूप से क्योंकि विभिन्न RABV उप-रेखाओं टी की सीमा फैलेएममनाया मूल्यों (तालिका 6). गैर-विशिष्ट प्रवर्धन भूखंडों शायद ही कभी इस परख के साथ मनाया जाता है; हालाँकि, एक गैर-विशिष्ट नकारात्मक परिणाम बनाम एक सकारात्मक परिणाम निर्धारित करने के लिए विशिष्ट पैरामीटर की आवश्यकता है। सभी lyssaviruses भर में मनाया एसडी (0.531) सबसे कम करने के लिए लागू किया गया था (77.34 - LBVa) और उच्चतम (79.67 - IKOV) मनाया टीएममान एक सीमा निर्धारित करने के लिए 76.8 डिग्री सेल्सियस - सकारात्मक विशिष्ट बैंड के लिए 80.2 डिग्री सेल्सियस। इसलिए, टीएमइस श्रेणी के बाहर के मानों को गैर-विशिष्ट माना गया था और इसलिए एक नकारात्मक परिणाम माना गया था. कभी कभी कई चोटियों एक नमूना के लिए मनाया जाता है. यदि प्रमुख शिखर पर सही टी हैएम(प्रत्येक प्रतिकृति के लिए) तो नमूना सकारात्मक माना जाता है. सबसे आम कारण एक गैर विशिष्ट चोटी देखा जाता है प्राइमर-डिमर्स के कारण है, परख प्राइमर dimers को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है. प्राइमर dimers आम तौर पर लक्ष्य अनुक्रम की तुलना में छोटे एक amplicon में परिणाम है, इसलिए एक टी होगाएमविशिष्ट उत्पाद से कम.
एक 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने के तीन lysavirus सकारात्मक मस्तिष्क नमूना TRIzol का उपयोग कर निकाले आरएनए, समानांतर में चला रहे थे और साजिश रची (चित्र 2) . तीन lyssaviruses के लिए पता लगाने की सीमा विविध, लेकिन कोई भी सीटी 36 से अधिक हो गया. चित्र 2 में प्लॉट किए गए वायरस के लिए R 2 गुणांक मान 0.9637 और 0.996 से लेकर। सभी वायरस ों का विश्लेषण करने के लिए (तालिका 6) श्रेणी इस से अधिक नहीं था, इसके अलावा, 29 lyssavirus में से 7 आर2 और 0.99 था (डेटा नहीं दिखाया गया). ध्यान में रखते हुए कि कमजोर पड़ने श्रृंखला की तैयारी कुल आरएनए extractions से है, रैखिकता मनाया सबूत है कि परख मजबूत है प्रदान करता है. अंत में, सभी lysavirus प्रजातियों का पता लगाने (विशेष रूप से सबसे विविध phylogroup III वायरस) Lysavirus जीनस में सभी तीन phylogroups फैले RNAs के एक पैनल का उपयोग कर जांच की थी. आरएनए या तो मूल से निकाले, या प्रयोगात्मक संक्रमित चूहों, मस्तिष्क सामग्री, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर उपयोग किया गया था. परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि प्राइमर सभी lysavirus प्रजातियों को बढ़ाना, जिसमें भिन्न-भिन्न फाइलोग्रुप III lyssaviruses IKOV, WBCV और LLEBV (तालिका6 और चित्र 3) शामिल हैं। गैर-lysavirus rabdoviruses के एक विविध पैनल, मूल रूप से एकत्र और प्रतिजनन का विश्लेषण16, और अधिक हाल ही में आनुवंशिक रूप से17 जांच की गई और कोई पार प्रतिक्रिया का पता चला था, यह दर्शाता है कि प्राइमर के लिए विशिष्ट हैं केवल Lyssavirus जीनस के सदस्य (डेटा नहीं दिखाया गया है)। पैन-lysavirus वास्तविक समय परख EURL में शामिल किया गया है (ईयू संदर्भ प्रयोगशाला) अंतर प्रयोगशाला प्रवीणता योजनाओं के बाद से 2013, इस तरह के पैन-lysavirus TakMan परख और के रूप में अन्य आणविक परख के साथ 100% सामंजस्य का प्रदर्शन FAT (Fluorescent एंटीबॉडी परीक्षण) के अलावा पारंपरिक आरटी-पीसीआर परख।
चित्र 1: सीवीएस सकारात्मक नियंत्रण आरएनए के 10 गुना सीरियल तनुकरण, पैन-lysavirus आरटी-पीसीआर परख पर चलाने के लिए, प्रवर्धन साजिश (ए) के रूप में कल्पना की, और वियोजन वक्र (बी), और पर चलाने के लिए --actin RT-PCR परख प्रवर्धन साजिश के रूप में कल्पना की (सी), और वियोजन वक्र (डी)। NTC - कोई टेम्पलेट नियंत्रण। सीवीएस नियंत्रण आरएनए की तुलना दोनों पैन-lysavirus RT-PCR परख (नीला) और जेड-एक्टिन आरटी-पीसीआर परख (लाल) वियोजन वक्रों में अंतर का प्रदर्शन (ई) - देखें तालिका 5 मतलब मूल्यों के लिए; और अंत में LBVa (नीले) और IKOV (लाल) के लिए वियोजन घटता Lysavirus जीनस भर में मनाया टीएम मूल्यों की सीमा का प्रदर्शन (एफ) . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: तीन lysavirus प्रजातियों के लिए 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने: RABV (RV108), DUVV (RV131) और ARAV (RV3379). R2 $ 0.996, 0.9962 और 0.9637 क्रमशः. 10-7 (0.0001 एनजी/जेडएल) पर डेटा बिंदु पता लगाने की सीमा तक पहुँच गया (जहां एक मूल्य प्राप्त किया गया था). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: Lyssavirus जीनस भर से प्रतिनिधि 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने डेटा (lysavirus पहचान और तालिका 6 के लिए अन्य lyssaviruses की तुलना में सारणीबद्ध परिणामों के लिए अलग-अलग किंवदंतियों देखें).। पैनल ए, सी, ई, जी प्रवर्धन भूखंडों और बी, डी, एफ, एच वियोजन घटता क्रमशः ए, सी, ई, और जी के लिए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| अभिकर्मक | $L/प्रतिक्रिया |
| आण्विक ग्रेड पानी | 7.55 |
| 2x यूनिवर्सल आरटी पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण | 10 |
| प्राइमर फॉरवर्ड [20]M] | 0.6 |
| प्राइमर रिवर्स [20 ]M] | 0.6 |
| आरटी एंजाइम मिश्रण | 0.25 |
| प्रति प्रतिक्रिया कुल | 19 |
तालिका 1: पैन-lysavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर मास्टर मिश्रण अभिकर्मकों।
| परख | प्राइमर नाम | प्राइमर भूमिका | अनुक्रम 5'-3' | स्थिति1 |
| लिसावायरस | JW12 | आरटी-पीसीआर | ATG TAA सीएसी CYC टीएसी AAT जी | 53-73 |
| एन165 | पीसीआर | जीसीए जीजीजी TAY TTR टीएसी टीसीए टीए | 165-146 | |
| जेड-एक्टिन | जेड-एक्टिन इन्ट्रोनिक | पीसीआर | CGA TGA AGA TCA AGA TCA टीटीजी | 1051-1072 |
| जेड-एक्टिन रिवर्स | आरटी-पीसीआर | एजी कैट टीटीजी सीजीजी टीजीजी एसी | 1204-1188 | |
| प्राइमर पदों पाश्चर वायरस अनुक्रम (M13215) और माउस के संबंध में दिया जाता है --actin जीन अनुक्रम (NM $007393) | ||||
तालिका 2: पैन-lysavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर प्राइमर विवरण।
| मंच | चक्र | तापमान | समय | डेटा संग्रह |
| रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन | 1 | 50 डिग्री सेल्सियस | 10 मिनट | |
| आरटी निष्क्रियता | 1 | 95 डिग्री सेल्सियस | 5 मिनट | |
| प्रवर्धन | 40 | 95 डिग्री सेल्सियस | 10 एस | |
| 60 डिग्री सेल्सियस | 30 एस | अंत्य बिंदु | ||
| वियोजन वक्र विश्लेषण | 1 | 9 डिग्री सेल्सियस | 1 मिनट | |
| 55 डिग्री सेल्सियस | 1 मिनट | |||
| 55 - 95 डिग्री सेल्सियस | 10 एस | सभी बिंदु |
तालिका 3: पैन-lysavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति।
| परीक्षण परिणाम | आंतरिक जेड-एक्टिन नियंत्रण | कुल मिलाकर परिणाम |
| नकारात्मक | नकारात्मक1 | अमान्य. दोहराएँ निष्कर्षण और परख2 |
| नकारात्मक | सकारात्मक | नकारात्मक परिणाम रिपोर्ट किया गया |
| सकारात्मक | सकारात्मक | सकारात्मक परिणाम की सूचना दी |
| सकारात्मक | नकारात्मक1 | दोहराएँ निष्कर्षण और परख3 |
| 1 दोहराने निष्कर्षण के दौरान विषम बाह्य नियंत्रण का उपयोग फायदेमंद होगा। | ||
| २ आंतरिक नियंत्रण के लिए एक दूसरा नकारात्मक परिणाम प्राप्त किया जाता है, तो नमूना इस परख द्वारा untestable के रूप में रिपोर्ट किया जाएगा. | ||
| 3 यदि आंतरिक नियंत्रण के लिए एक दूसरा नकारात्मक परिणाम प्राप्त किया जाता है, तो एक सकारात्मक परीक्षण परिणाम के साथ एक माध्यमिक रेबीज | ||
| इस परिणाम की पुष्टि करने के लिए नैदानिक परीक्षण किया जाना चाहिए। | ||
तालिका 4: परिणामों का सारांश और पैन-lysavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर के लिए समग्र परिणाम। नकारात्मक कोई सीटी मूल्य (एम्पलेशन) और कोई पिघल तापमान (वियोजन), या एक पिघल तापमान जो सकारात्मक lyssaviruses के लिए टीएम रेंज के बाहर है के साथ एक नमूना करने के लिए नामित किया गया है (76.8 डिग्री सेल्सियस - 80.2 डिग्री सेल्सियस). सकारात्मक एक सीटी मूल्य के साथ एक नमूना करने के लिए नामित किया गया है (एम्पलेशन) और एक पिघल तापमान (वियोजन) जो सकारात्मक lyssaviruses के लिए टीएम रेंज के अंदर है.
| Lyssavirus परख | जेड-एक्टिन आमापन | |||
| सीटी | Tm | सीटी | Tm | |
| मतलब | 20.66 | 78.92 | 27.5 | 85.26 |
| एसडी | 0.63 | 0.16 | 1.13 | 0.35 |
| एलसीएल (95%) | 19.39 | 78.59 | 25.23 | 84.56 |
| यूसीएल (95%) | 21.93 | 79.25 | 29.76 | 85.96 |
तालिका 5: कई ऑपरेटरों सहित 12 स्वतंत्र रन भर में सीवीएस सकारात्मक नियंत्रण के अंतर रन विश्लेषण.
| फाइलोग्रुप | प्रजातियां | वायरस आईडी | वंश | पता लगाने की सीमा | Tm |
| मैं | RABV | आर.वी. 50 | अमेरिकी बल्लेबाजी | 10-5 | 79.5 |
| मैं | RABV | आर.वी. 51 | अमेरिका फॉक्स | 10-7 | 77.6 |
| मैं | RABV | आर.वी.108 | चिली बल्ले | 10-7 | 78.63 |
| मैं | RABV | RV313 | यूरोपीय फॉक्स | 10-9 | 78.53 |
| मैं | RABV | आर.वी. 437 | यूरोपीय RacDog | 10-7 | 78.09 |
| मैं | RABV | RV1237 | यूरोपीय हिरण | 10-8 | 78.76 |
| मैं | RABV | RV334 | चीनी टीका | 10-8 | 79.03 |
| मैं | RABV | आर.वी. 102 | अफ्रीका 2 | 10-7 | 78.58 |
| मैं | RABV | RV995 | अफ्रीका 3a | 10-8 | 79.66 |
| मैं | RABV | आर.वी. 410 | अफ्रीका 3b | 10-7 | 79.03 |
| मैं | RABV | RV2324 | अफ्रीका 4 | 10-7 | 79.17 |
| मैं | RABV | RV2417 | श्रीलंका कुत्ता | 10-9 | 78.71 |
| मैं | RABV | सीवीएस-11 | 10-7 | 79.17 | |
| मैं | ईबीएलवी-1 | आर.वी. 20 | जर्मनी | 10-6 | 79.05 |
| मैं | ईबीएलवी-2 | RV1787 | ब्रिटेन | 10-7 | 78.76 |
| मैं | बीबीएलवी | RV2507 | जर्मनी | 10-9 | 78.71 |
| मैं | एबीएलवी | RV634 | 10-8 | 78.25 | |
| मैं | डी.वी.वी. | RV131 | 10-5 | 79.03 | |
| मैं | जीबीएलवी | RV3269 | 10-7 | 79.15 | |
| मैं | ARAV | RV3379 | 10-7 | 79.46 | |
| मैं | KHUV | RV3380 | 10-7 | 78.97 | |
| मैं | SHIBV | RV3381 | 10-7 | 78.59 | |
| मैं | आईआरकेवी | RV3382 | 10-3 | 78.59 | |
| द्वितीय | एलबीवीए | RV767 | 10-5 | 77.34 | |
| द्वितीय | एलबीवीडी | RV3383 | 10-7 | 78.59 | |
| द्वितीय | MOKV | आर.वी. 4 | 10-3 | 78.81 | |
| Iii | IKOV | RV2508 | 10-5 | 79.67 | |
| Iii | एलईबीवी | RV3208 | 10-4 | 79.15 | |
| Iii | डब्ल्यूसीबीवी | RV3384 | 10-3 | 79 |
तालिका 6: सभी तीन phylogroups भर में प्रतिनिधि lyssaviruses के लिए पैन-lysavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर विशिष्टता, संवेदनशीलता और टीमीटर का सारांश। lyssaviruses भर में मतलब टीमीटर 78.81 (एसडी 0.531) था।
Discussion
पैन-lysavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख वर्णित एक बंद ट्यूब, एक कदम परख जो सभी तीन phylogroups भर में lysaviruses का पता लगाता है. परख दोनों पशु और मानव रेबीज निदान के लिए मान्य किया गया है, पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक सहित (ऑप्टिमली brainstem), और इस तरह की त्वचा बायोप्सी के रूप में पूर्व-मर्तबा नमूने, क्रमिक रूप से एकत्र लार, या मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ (सीएसएफ). इस परख में उपयोग किए गए प्राइमर को पहले आरएबीवी, ईबीएलवी-1 और ईबीएलवी-23के बीच अंतर करने के लिए जांच-आधारित परख के लिए डिजाइन और उपयोग किया गया था, जिसका उपयोग कई ओआईई रेबीज प्रयोगशालाओं में किया गया है और EURL प्रवीणता योजनाओं में लगातार प्रदर्शन करता है। बाद में इन प्राइमर के 'पैन-lysavirus' प्रकृति एक 2 कदम वास्तविक समय परख15का उपयोग कर की पुष्टि की गई है. यहाँ वर्णित परख आगे एक बंद ट्यूब, तेजी से प्रणाली को सक्षम करने के लिए एक एक कदम SYBR परख में आरटी-पीसीआर अनुकूलन करने के लिए प्राइमर का उपयोग किया गया है। इसके अलावा, रेबीज स्थानिकमारी वाले देशों में प्रशिक्षण इस परख का उपयोग कर पार संदूषण को कम करने और नमूने का पता लगाने के लिए बुनियादी PPE और गुणवत्ता प्रणालियों के साथ किसी भी प्रयोगशाला में लागू करने के लिए उपयुक्तता की पुष्टि की है, अभिकर्मकों और एक वास्तविक समय स्टोर करने के लिए सुविधाओं SYBR का पता लगाने के साथ मशीन. परख अत्यंत मजबूत है और वसा के साथ 100% संबंध है, विघटित नमूनों के लिए बेहतर संवेदनशीलता के साथ3. एक डीएनए intercalating डाई आधारित परख के लिए मुख्य लाभ में से एक एक जांच आधारित परख की तुलना में रिश्तेदार लागत है. एक अतिरिक्त लाभ यह है कि परख केवल दो प्राइमर का इस्तेमाल करता है, इसलिए अनुक्रम विचलन के कारण असफल पता लगाने का कम जोखिम होता है, जो पहले प्रकाशित जांच-आधारित परख में कमजोरी रही है। वास्तव में, सभी lysavirus प्रजातियों के प्रतिनिधियों (TWBLV और KBLV के अलावा) इस परख का उपयोग कर पता चला रहे हैं, और प्राइमर साइटों भर में TWBLV और KBLV के अनुक्रम विश्लेषण कोई महत्वपूर्ण विचलन दृढ़ता से सुझाव है कि वे भी सुझाव है कि वे भी का उपयोग कर का पता लगाया जाएगा पता चला है इस विधि. विश्लेषण वायरस भर में मनाया पता लगाने की सीमा की सीमा, दो मुख्य कारकों के कारण माना जा सकता है. पहला यह है कि आरएनए नैदानिक मस्तिष्क सामग्री से अलग किया गया था, इसलिए प्रत्येक undiluted नमूने में जीनोम प्रतियां की मात्रा सीधे तुलनीय नहीं है. आरएनए को कुल आरएनए को 1 ग्राम/जेडएल में समायोजित करके सामान्यीकृत किया गया था; हालांकि, उस नमूने के भीतर वायरल जीनोम आरएनए का अनुपात अलग-अलग होगा। दूसरा है lysavirus दृश्यों की विविधता, प्राइमर साइटों संरक्षित क्षेत्रों में स्थित होने के बावजूद, वहाँ भिन्नता की स्थिति बनी हुई है. इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि परख के लिए कम संवेदनशीलता के साथ lyssaviruses के बहुमत phylgroup द्वितीय और तृतीय वायरस हैं. वियोजन वक्र विश्लेषण एक आवश्यक पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करता है, एक झूठी सकारात्मक परिणाम है जो अन्यथा प्राइमर dimers के गठन के कारण हो सकता है, या मेजबान जीनोम में एक गैर विशिष्ट क्षेत्र के प्रवर्धन को कम. वास्तव में, यह एक दुर्लभ घटना है और वियोजन वक्र विश्लेषण सही ढंग से आकार पारंपरिक आरटी-पीसीआर amplicons कल्पना करने के लिए एक agarose जेल चलाने के लिए बराबर है। हमारी प्रयोगशाला में एकत्रित आंकड़ों के आधार पर स्वीकार्य टीएम मूल्यों की श्रेणी (77-80 डिग्री सेल्सियस) प्रदान की गई है। यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि अलग-अलग प्रयोगशालाओं में घर में डेटा collate सुनिश्चित करने के लिए सीमा transferrable है और तदनुसार संशोधन. प्रवर्धन और वियोजन दोनों भूखंडों से परिणामों की व्याख्या, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण और जेड-एक्टिन परिणामों के साथ, मजबूत और पुन: उत्पादनीय नैदानिक परिणामों को सक्षम बनाता है।
इस प्रोटोकॉल के दायरे के बाहर उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता आरएनए निष्कर्षण विधि है। सभी आरएनए इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण TRIzol का उपयोग कर तैयार किया गया था; हालांकि, कॉलम और मनका-आधारित निष्कर्षण किट सहित कई उपयुक्त ग्वानिडियम-आधारित निष्कर्षण आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। lyssavirus सकारात्मक (या संदिग्ध सकारात्मक) नमूनों की हैंडलिंग लाइसेंस प्राप्त biocontainment सुविधाओं के भीतर देश के भीतर मंजूरी दे दी होनी चाहिए. हालांकि, निकाले गए कुल आरएनए गैर संक्रामक है, इसलिए कम रोकथाम प्रयोगशालाओं के भीतर संभाला. उपयोग की जाने वाली निष्कर्षण विधि के आधार पर आरएनए की मात्रा निर्धारित करने और उसे कम करने की आवश्यकता का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी। फीनॉल-आधारित निष्कर्षणों के लिए, TRIzol सहित, इस कदम की आवश्यकता है और gDNA contaminating से परख के निषेध को रोकता है; हालांकि, स्तंभ और मनका आधारित extractions (विशेष रूप से एक डीएनए कमी चरण के साथ उन) परीक्षण से पहले कमजोर पड़ने की आवश्यकता नहीं है.
प्रोटोकॉल के दौरान, यह आवश्यक है कि देखभाल और परिश्रम को पार संदूषण और सही कुओं के लिए नमूने का सही इसके अलावा को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है. अभिकर्मक गणना और प्लेट लेआउट के साथ एक स्प्रेडशीट एक पूरक फ़ाइल के रूप में डाउनलोड के लिए उपलब्ध है. अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास, स्वच्छ काम सतहों सहित, दस्ताने के नियमित परिवर्तन, बाधा युक्तियाँ और विभिन्न कमरों / यह सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण अपेक्षित पैरामीटर के साथ प्रदर्शन कर रहा है, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए और सभी परीक्षण नमूने डुप्लिकेट (या trilicate) में चलाते हैं।
नियंत्रण का समावेश किसी भी पीसीआर की एक अनिवार्य विशेषता है, विशेष रूप से निदान के लिए। सकारात्मक नियंत्रण आरएनए CVS (चुनौती वायरस मानक) बैचों में संक्रमित माउस दिमाग से तैयार किया गया था और मान्य और बैचों के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए calibrated. नियंत्रण आरएनए को परिमाणित किया गया था और उसे 1 ग्राम/जेडएल तक पतला किया गया था जिसके लिए एक क्रमिक कमजोर पड़ने में कम से कम 10-4 (100 pg/$L के बराबर) में एक सकारात्मक परिणाम प्राप्त किया गया था, उद्देश्य के लिए उपयुक्त माना गया था। सकारात्मक नियंत्रण आरएनए को 10-1 एलिकोट्स में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। जब आवश्यक हो, एक alicot पतला किया गया था 1:100 पर एक काम कर स्टॉक प्रदान करने के लिए 1 ng/$L और पर संग्रहीत -80 डिग्री सेल्सियस में 5 डिग्री एल एकल उपयोग alicuots. पतला सकारात्मक नियंत्रण आरएनए कम स्तर सकारात्मक नमूने का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और यह सुनिश्चित करने के लिए कि परख की संवेदनशीलता में किसी भी कमी का पता चला था. Ct मानों की निगरानी करने और प्रवृत्तियों की पहचान करने के लिए प्रत्येक नियंत्रण के लिए एक 'नियंत्रण कार्ड' रखा गया था (तालिका 5)। तालिका 5 कई दिनों और ऑपरेटरों भर में CVS सकारात्मक नियंत्रण नमूना सीटी और टीएम मूल्यों के लिए अच्छा अंतर रन तुलनीयता का प्रदर्शन किया, आश्वासन है कि परख मजबूत और reproduible है प्रदान करते हैं. परिणाम है कि इन माप से विचलित जांच की जानी चाहिए और यदि आवश्यक हो तो दोहराया नमूने परीक्षण. आणविक ग्रेड पानी एक NTC के रूप में हर रन में शामिल किया गया था पुष्टि करने के लिए अभिकर्मकों lysavirus आरएनए के साथ संदूषण से मुक्त थे और एक नकारात्मक नमूना की पुष्टि करें. इसके अलावा, आरएनए निष्कर्षण प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए, एक अलग ट्यूब में परीक्षण के नमूनों के साथ-साथ जेड-एक्टिन का परीक्षण किया गया था। lyssavirus सकारात्मक नियंत्रण आरएनए भी जेड-actin सकारात्मक नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था. अन्य अंतर्जात जीन या विषमतापूर्ण आंतरिक नियंत्रण प्रणालियों का उपयोग किया जा सकता है। इन नियंत्रणों के उपयोग ने यह सुनिश्चित किया कि सभी चरणों का परीक्षण नमूनों के समान ही परिस्थितियों में विश्लेषण किया गया। कभी कभी, अगर नमूना अत्यधिक अपमानित किया गया था या पर्याप्त मेजबान आरएनए शामिल नहीं था (जैसे लार या सीएसएफ के रूप में), अंतर्जात जीन पीसीआर विफल कर सकते हैं. इस उदाहरण में, जहां lyssavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परिणाम सकारात्मक था, एक स्वतंत्र आरएनए निष्कर्षण पर पुष्टि - मूल परीक्षण पर या एक माध्यमिक परीक्षण द्वारा आरएनए निष्कर्षण के दौरान संदूषण से इनकार करने के लिए (या तो आणविक, जैसे पारंपरिक आरटी-पीसीआर) , या FAT. नैदानिक नमूने के विश्लेषण के दौरान तालिका 4 का उपयोग सही व्याख्या सुनिश्चित करता है।
रेबीज संक्रमण की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया आणविक परख के बावजूद, इस तरह के वसा या वायरस अलगाव के रूप में virology में lysavirus प्रजातियों और शास्त्रीय तकनीकों का निर्धारण करने के लिए Sanger अनुक्रमण का उपयोग कर जांच का पालन भी करने के लिए अनुमति देने के लिए किया जाना चाहिए आगे वायरस की विशेषता और OIE और डब्ल्यूएचओ के लिए सकारात्मक मामलों की अधिसूचना का समर्थन करते हैं.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों प्रयोगों को पूरा करने में सहायता के लिए मिस एम्मा वाइज और मिस मेगन गोल्डिंग शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए आर्थिक रूप से पर्यावरण, खाद्य और ग्रामीण मामलों के लिए ब्रिटेन विभाग (Defra), स्कॉटिश सरकार और वेल्श सरकार द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था [SV3500, और SE0431] और यूरोपीय वायरस पुरालेख वैश्विक (EVAg) परियोजना है कि है अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त नहीं 653316.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
| Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
| Centrifuge (mico) | Sigma | ||
| Finnpipettes (to dispense 0.5-1,000 µL) | Thermofisher | various | |
| iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
| MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
| MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
| Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
| Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
| Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
| Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
| Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
| Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
| Unless stated, alternative equipment can be used |
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