Summary
Denna realtids RT-PCR som använder dsDNA interkalerande Dye är lämplig för att diagnostisera lyssavirus infektioner. Metoden börjar med RNA som utvinns ur rabies misstänkta före slakt eller post-mortem prover, med uppgifter Master Mix förberedelse, RNA tillägg, inställning av realtids maskin och korrekt tolkning av resultat.
Abstract
Molekylära analyser är snabba, känsliga och specifika, och har blivit centrala för diagnostisering av rabies. PCR-baserade analyser har använts i årtionden för att bekräfta rabiesdiagnosen, men har nyligen godkänts av OIE (World Organisation for Animal Health) som en primär metod för att upptäcka rabies infektion. RT-PCR-analyser i realtid ger realtidsdata och är slutna rörsystem som minimerar risken för kontaminering under installationen. DNA interkalerande fluorokromkonjugerat Real-Time RT-PCR-analyser kräver inte dyra sonder, minimera kostnaden per prov, och när primers är utformade i bevarade regioner, analyser som är specifika för virus släkten snarare än specifika för bara ett virus arter är möjliga. Här beskriver vi en pan-lyssavirus SYBR Real-Time RT-PCR-analys som detekterar lyssaviruses över lyssavirus släkte, inklusive de mest avvikande VIRUSEN Ikov, WCBV och llebv. I samband med dissociationskursanalys är denna analys känslig och specifik, med fördelen att upptäcka alla lyssavirus-arter. Analysen har antagits i många diagnostiska laboratorier med kvalitetssäkrade miljöer, vilket möjliggör robust, snabb, känslig diagnos av djur-och Human rabies fall.
Introduction
Diagnos av rabies med molekylära metoder godkändes av OIE i 20181, erkänner fördelarna med dessa tekniker för att bekräfta rabies fall, särskilt i situationer när proverna är suboptimala, eller för ante-mortem diagnos, eftersom det inte finns något krav på levande virus eller färska prover. PCR-analyser för lyssaviruses kräver omvänd Transkription (RT) innan PCR kan påbörjas eftersom genomet är RNA. RT-PCR-analyser som detekterar 3 ' proximala regionen av genomet anses vara de känsligaste, eftersom transkriptionella gradienter inträffar under lyssavirus-replikering. Vanliga RT-PCR-analyser kan delas i stort sett i två kategorier, slutpunkt (eller gel-baserad) och i realtid. Båda metoderna är känsliga och specifika. emellertid, realtids analysen har några ytterligare fördelar såsom att få resultat i "realtid" och utförs i ett helt slutet rörsystem, vilket minskar risken för operatörs förorening. Det finns två huvudsakliga metoder för att detektera lyssavirus-specifika amplikonerna som erhållits med hjälp av realtidsanalyser. Den första använder hydrolys sonder (t. ex. TaqMan sonder) som innehåller en fluorophore och en quencher. När sonden binder till målregionen under amplifiering, resulterar exonukleasaktiviteten i polymerasen i dissociation av fluorophore och quencher, vilket gör att den resulterande fluorescensen kan mätas. Den andra använder ett DNA-interkalating färgämne (fluorokrom såsom SYBR grön) som binder till dubbla strandsatta DNA under amplifiering. De bundna fluorokromer avger fluorescens som upptäcks vid varje cykel, vilket möjliggör detektering och kvantifiering av produkten i realtid. På grund av den icke-specifika karaktären av bindning till någon dsDNA, en dissociationskurva analys görs för att bekräfta specificiteten av reaktionen. Real tid RT-PCRS är snabba på grund av de små amplikon storlekar, vanligtvis mindre än 200 BP i längd; men att identifiera lämpliga regioner för att designa primers och sonder i bevarade regioner, kan vara utmanande, därför att ta bort kravet på en sond är en klar fördel.
Ett antal realtids RT-PCRS har utformats för att specifikt upptäcka enskilda stammar eller linjer av rabv2 och även för att upptäcka lyssaviruses i släktet3,4,5,6, 7,8,9. Alla analyser kommer att ha en gräns för detektion beroende på hur bevaras primer (och om nödvändigt, sonden) sekvenser är över släktet. Faktum är att framväxande eller nya virusstammar kan göra den mycket specifika sond-baserade analyser ineffektiva. Valet av realtidsdetektering (Dye kontra sond) kommer att bero på den avsedda applikationen. För ett laboratorium som utför övervakning på lokalt inköpta hjärn material och förväntar sig ett stort antal negativa prover, är användningen av de billigare interkalerande färgämne ett förnuftigt val. Den SYBR Green tillvägagångssätt skulle också vara optimalt när de utför scanning övervakning där närvaron av nya eller avvikande lyssaviruses skulle förbli oupptäckt av mer begränsade sond-baserade analyser.
Alla medlemmar i släktet lyssavirus orsakar sjukdomen rabies, vilket är dödligt när symtomen uppträder. De allra flesta av människor och djur rabies fall beror på rabiesvirus (RABV), den dominerande reservoar som är den inhemska hunden10. Fladdermöss är viktiga värd reservoarer för lyssaviruses och alla utom två lyssavirus arter kännetecknas har identifierats direkt i fladdermöss-Ikoma lyssavirus (IKOV) och Mokola virus (MOKV)-och av dessa två har IKOV spekulerats för att ha en bat värd reservoar 11. Förutom de 16 erkända lyssavirus-arterna12finns det två lyssaviruses som nyligen har beskrivits: Taiwan bat lyssavirus (twblv)13 och kotalahti bat lyssavirus (kblv)14. Lyssaviruses kan vara genetiskt uppdelad i tre phylogroups, med majoriteten av lyssaviruses, inklusive RABV, som tillhör phylogroup I. Men de mest avvikande lyssaviruses tillhör phylogroup III och är osannolikt att upptäckas av RT-PCRs avsedda att rikta RABV eller phylogroup I virus sekvenser.
Analysen beskrivs här utnyttjar realtid primer par JW12-N165, som först beskrivs i 20053. Primers utformades för att vara Pan-lyssavirus även om den ursprungliga ansökan var som en TaqMan analys med sonder för att skilja lyssavirus arter. Efterföljande bekräftelse på att primerparet var Pan-lyssavirus i specificitet uppnåddes med hjälp av en 2-stegs SYBR realtidsanalys på alla lyssavirus arter tillgängliga inklusive WCBV15. Primer-paret beskrivs här i en One-Step RT-PCR realtidsanalys som utnyttjar en interkalerande fluorochrome, validerade med representanter från alla 16 erkända lyssavirus arter. Den här realtids analysen i ett steg är en snabb, känslig, lyssavirus-specifik analys och visar att primerens robusthet är inställd på att identifiera även mycket avvikande lyssavirus-arter.
Protocol
Prover från diagnostiskt material som mottagits vid APHA efter en naturlig infektion, eller erhållits genom att vaccinera möss med hjälp av protokoll som bedömts av APHA etik och statistisk kommitté enligt brittiska hem kontorets förordningar enligt licens 70/7394.
1. kvantifiering av RNA med hjälp av en Mikrovolyms spektrofotometer
- Se till att inställningarna för spektrofotometern är inställda på RNA.
- Använd 1-2 μL vatten av molekylär kvalitet för att initiera maskinen och ställa in en baslinje.
- Använd 1-2 μL av varje test-RNA-prov för att bedöma RNA-kvantiteten.
- Spara avläsningar och dokument.
- Justera RNA till 1 μg/μL om det behövs.
Anmärkning: RNA måste hållas på is (eller i ett svalt block) hela tiden. Om RNA erhålls med hjälp av en kolonn eller pärlbaserad metod är RNA vanligtvis mindre än 1 μg/μL. I denna situation använda RNA snyggt.
2. beredning av RNA-utspädningsserie för bestämning av änd punkts känslighet
-
Gör en 10-faldig seriell utspädning av RNA.
- Etikett rör med utspädnings serien (t. ex. 10-1, 10-2osv.) och RNA-detaljerna.
- Tillsätt 45 μL vatten av molekylär kvalitet till varje tub.
- Tillsätt 5 μL av RNA (tidigare utspätt till 1 μg/μL) och blanda väl.
- Kassera pipettspetsen i lämpligt desinfektionsmedel och Ersätt med en ny spets.
- Ta 5 μL från 10-1 och tillsätt till 10-2 tub och blanda väl.
- Upprepa 2.1.3-2.1.5 med resterande utspädningar.
Anmärkning: RNA måste hållas på is (eller i ett svalt block) hela tiden.
3. beredning av real tids RT-PCR-reaktioner
- Använd ett kalkylblad för att planera plattlayouten enligt antalet prov prov och kontrollprover, för både lyssavirus-och ß-Actin-analyserna.
Anmärkning: Om 4 prover ska testas i två exemplar med en positiv och negativ kontroll, detta motsvarar 10 reaktioner för båda analyserna. - I ett "rent rum" eller område skilt från RNA-mallen torkar du ner ytorna med ett lämpligt desinfektionsmedel innan du använder eller förbereder en PCR-arbetsstation (om du använder den). För att förbereda arbetsstationen, torka av skåpet ytan med en lämplig desinficera och placera de objekt som krävs i arbetsstationen och stänga dörrarna. Slå på UV-lampan i 10 minuter
- Ta bort regenter och primers från frysen och Tina (reagenser som anges i tabell 1 och primers i tabell 2).
Anmärkning: Enzym blandningen lagras i glycerol så kräver inte upptinning och måste hållas på is (eller i ett svalt block) hela tiden. Alla andra reagenser kan Tinas i rumstemperatur. - När tinat, blanda reagenser och centrifugera kort för att samla in vätska.
Anmärkning: Blanda inte ihop enzym mixen, bara Centrifugera kort. - Förbered separata mastermixar för lyssavirus och ß-Actin. För varje reaktion, tillsätt 7,55 μL av vatten av molekylär kvalitet, 10 μL 2x universell SYBR grön reaktionsblandning, 0,6 μL framåtriktad primer, 0,6 μL omvänd primer, 0,25 μL iTaq RT-Enzymblandning.
- Använd ett kalkylblad för att beräkna rätt volymer för att undvika fel vid manuell beräkning. Se till att tillräckligt med Master-Mix är beredd att kompensera för pipettering fel. Om 10 reaktioner krävs (se anmärkning 3,1), Förbered därför 12 reaktioner
- Förbered Master-Mix på is (eller i en sval block) och stanna kvar på isen tills placeras i realtid maskinen.
- Blanda de preparerade Master-mixarna, Centrifugera kort och fördela 19 μL i de relevanta brunnarna i band rören eller en 96-borrmaskin som är kompatibel med realtids maskinen i bruk.
Anmärkning: Minimera produktionen av bubblor i brunnarna medan pipettering. - I ett separat rum, eller i ett UV-skåp berett enligt beskrivningen i 3,2, tillsätt försiktigt 1 μL av det RNA som tidigare justerats till 1 μg/μL (se steg 1,5) under ytan av lämplig Master-Mix väl och blanda försiktigt. Kassera pipettspetsen i desinfektionsmedlet direkt efter användning (under ytan).
- Lägg till kontrollerna efter testproverna, med den positiva kontrollen tillagd nästa och ingen mall kontroll (NTC-molekylär grade vatten) lagt till sist. Mängden RNA som används kan ändras beroende på prov typ, och RNA-extraktion används. Det belopp som används måste valideras för att säkerställa att reaktionen optimeras.
- Tätnings plåt med hjälp av band lock eller sealer noga med att se till att alla lock är ordentligt stängda och märkta tillräckligt för att orientera proverna. Märk kanten på plattan/band rören.
- Snurra proverna med en centrifug för att samla upp all vätska i botten av brunnarna.
- Överförings plattan till realtids PCR-maskinen, öppna dörren och placera i hållaren för att säkerställa korrekt placering/orientering av proverna enligt plattlayouten.
Anmärkning: Om rör remsor används, se till att hållaren är på plats. - Öppna realtids PCR-maskinprogrammet och välj alternativet för SYBR realtids experiment med dissociationskurva. Program mera realtids PCR-maskinen med de termiska cyklings förhållanden som anges i tabell 3, inklusive datainsamlings punkterna.
- Välj SYBR som fluorescerande färgämne och välj Okänt som exempel typ och sätt in ett namn i rutan för rätt exempel namn.
Anmärkning: Skilj mellan replikat och även mellan lyssavirus och ß-Actin Wells. - Välj en fil plats för att spara experimentella data, se till att lampan stängs av i slutet av körningen och starta sedan körningen.
Anmärkning: Eftersom det första steget är ett RT-steg samlas inga data in under denna tid, därför, om lampan kräver en uppvärmningsperiod kan detta inträffa under RT-stadiet. Realtids maskinen och programvaran kommer att Visa förstärknings kurvor i realtid, medan smält kurvan kommer att genereras i slutet av cykeln.
4. analys av data
-
När körningen har slutförts utför dataanalysen enligt följande.
- Först analysera resultaten av amplifiering av proverna tillsammans med kontrollproverna. Positiva prover visar exponentiella ramper, vanligen följt av platå och ett Ct -värde. Negativa prover visar plana amplifieringtomter utan Ct -värden (figur 1a). Ct -värdet beräknas automatiskt av programvaran, även om detta bör kontrolleras och manuellt ändras om det behövs.
- För det andra, analysera dissociation kurvan resultaten av provet proverna tillsammans med kontrollproverna. Ett positivt prov kommer att ha en smälttemperatur (Tm) 77 – 80 ° c och överlappa med den positiva kontroll siffran 1b).
- Få det övergripande diagnostiska resultatet genom att se till att kontrollerna är giltiga. Använd tabell 4 för att tolka resultaten i förhållande till den interna ß-Actin-kontrollen. Om de positiva kontrollproverna är negativa och/eller de negativa proven är positiva, bör körningen inte beaktas.
- Registrera de Ct -och tm -värden som erhålls för kontroll RNA i ett "kontrollkort" för att möjliggöra trendanalys och hjälpa till att identifiera drivor i analysens känslighet.
Representative Results
Enligt det protokoll som beskrivs ovan visades känsligheten hos Pan-lyssavirus RT-PCR på en spädningsserie av kontrollstandard viruset (CVS) (Figur 1) och en rad andra lyssaviruses (Figur 2OchFigur 3). SYBR Green I Dye utnyttjades som en universell One-Step RT-PCR, där cDNA-syntes och PCR amplifiering utförs i ett enda rör. Eftersom amplifiering av det specifika målet inträffar, mer färgämne är bunden, vilket resulterar i realtid ökade nivåer av fluorescens. Alla färg interkalating realtidsanalyser måste tolkas i två faser: amplifiering och dissociation. Amplifieringsfasen är identisk med någon realtids förstärkning (Figur 1A). Det finns en linjär "tidig fas" under de tidiga cyklerna där DNA-amplifiering inte kan beräknas på grund av otillräcklig signal i förhållande till bakgrunden. Längden på detta är direkt relaterat till mängden mål i provet. Därefter finns det en exponentiell fas där dubbleringen av DNA-molekyler upptäcks och registreras. Slutligen, platån fasen nås (bortsett från de mycket utspädda prover som inte kan nå denna fas före slutet av programmet). I denna fas, intensiteten av fluorescens nivåer ut, på grund av konsumtion av reagenser. De förstärknings områden som observeras med hjälp av en 10-faldig seriell utspädning av CVS, som konstaterats till de förväntade tomterna (Figur 1AC) där lyssavirus-analysen uppvisade en högre känslighet än ß-Actin-analysen. Dissociationskurvan beräknades efter amplifiering, där dsDNA separerades till ssDNA genom en stegvis ökning av temperaturen och fluorescensen övervakades som en funktion av temperaturen (Figur 1B, D-F). Den tröskel temperatur vid vilken den specifika amplikon separerar till ssDNA, orsakade en frisättning av fluorescens, som mättes med termocyklerprogramvaran (TM). Denna dissociationsfas tillhandahöll data om storleken på amplikon, vilket gjorde det möjligt för användaren att tolka resultatet i jämförelse med en positiv kontroll, vilket resulterade i en försumbar sannolikhet för falskt positiva resultat. Den TMobserveras för CVS med hjälp av Pan-lyssavirus-analysen (Figur 1B) och ß-Actin-analysen (Figur 1D) är distinkta, och hjälpt användaren att bekräfta den korrekta analys analysen genom att notera TMerhållasFigur 1E). Dessutom har CToch TMvärden mellan körningar och operatorer bedömdes och visade sig vara reproducerbara (Tabell 5). Det tröskelvärde som används för att beräkna CTvärdet beräknades automatiskt av programvaran och beror på många faktorer, inklusive reaktions mixen eller instrumentet som används. Över de 12 oberoende kör medelvärdet CT20,66 (SD 0,63) för lyssavirus-analysen och 27,5 (SD 1,13) för ß-Actin-analysen. I motsats till den variation som observerades i TMvärden var markant lägre, på grund av avsaknaden av yttre påverkan på denna mätning. T. ex. är medelvärdetMför CVS lyssavirus-analysen var 78,92 (SD 0,16) (Tabell 5), jämfört med medelvärdet för alla lyssaviruses 78,81 ° c (SD 0,531) (Tabell 6OchFigur 1F). Denna brist på variation i TMöver hela LyssavirusSläkte är fördelaktigt eftersom samma kontroll-RNA kan användas oberoende av lyssavirus i provet, men differentiera mellan lyssavirus arter med hjälp av TMinte är möjligt, särskilt eftersom olika RABV-Underlinjer sträckte sig över utbudet av TMobserverade värdena (Tabell 6). Icke-specifika amplifiering tomter observeras sällan med denna analys; dock krävs specifika parametrar för att definiera ett positivt resultat kontra ett icke-specifikt negativt resultat. SD som observerades i alla lyssaviruses (0,531) tillämpades på den lägsta (77,34-LBVa) och högsta (79,67-IKOV) observerade TMvärden för att ställa in ett intervall 76,8 ° c-80,2 ° c för positiva specifika band. Därför, TMvärden utanför detta intervall ansågs vara icke-specifika och därför ett negativt resultat. Ibland observeras flera toppar för ett prov. Om den dominerande toppen är på rättM(för varje replikat) betraktas provet som positivt. Den vanligaste orsaken till en icke-specifik topp observeras beror på primer-dimers, analysen har optimerats för att minimera primer dimers. Primer dimerer resultera vanligtvis i en amplikon mindre än den för målsekvensen, därför skulle ha en TMlägre än den specifika produkten.
En 10-faldig seriell utspädning av tre lyssavirus positiva hjärn prov RNAs som extraherats med TRIzol, kördes parallellt och plottas (figur 2). Detektionsgränsen för de tre lyssaviruserna varierade, men ingen översteg Ct 36. Koefficienten R2 för de virus som plottas i figur 2 varierade mellan 0,9637 och 0,996. För alla virus som analyseras (tabell 6) översteg inte sortimentet detta, dessutom hade 7 av de 29 lyssavirus R2 > 0,99 (data visas inte). Med hänsyn till att beredningen av utspädnings serien är från totala RNA-extraktioner, ger Lineariteten observerats belägg för att analysen är robust. Slutligen, upptäckt av alla lyssavirus arter (särskilt de mest varierande phylogroup III virus) undersöktes med hjälp av en panel av RNAs spänner över alla tre phylogroups i lyssavirus släkte. RNA som utvinns ur antingen original, eller experimentellt infekterade möss, hjärn material, utnyttjades med hjälp av de protokoll som beskrivs ovan. Resultaten bekräftar att primers förstärker alla lyssavirus-arter, inklusive de olika phylogroup III lyssaviruses IKOV, WBCV och LLEBV (tabell 6 och figur 3). En mångsidig panel av icke-lyssavirus rhabdoviruses, ursprungligen samlas in och analyseras antigena16, och mer nyligen genetiskt17 screenades och ingen kors reaktivitet upptäcktes, vilket tyder på att primers är specifika för endast medlemmar i lyssavirus -släktet (data visas inte). Pan-lyssavirus realtidsanalys har inkluderats i EURL (EU referenslaboratorium) kompetens system mellan laboratorier sedan 2013, vilket visar 100% överensstämmelse med andra molekylära analyser såsom Pan-lyssavirus TaqMan-analysen och konventionell RT-PCR-analys utöver FETTET (fluorescerande antikroppstest).
Figur 1:10-faldig seriell utspädning av CVS positiv kontroll-RNA, som körs på Pan-lyssavirus RT-PCR-analysen, visualiseras som amplifieringsintrigen (a), och dissociationskurvan (B), och körs på ß-Actin RT-PCR-analysen visualiseras som amplifiering (C), och dissociation kurva (D). NTC = ingen mallkontroll. Jämförelse av CVS-styrrna som körs på både Pan-lyssavirus RT-PCR-analysen (blå) och ß-Actin RT-PCR-analysen (röd) som visar skillnaden i dissociationskurvor (E) – se tabell 5 för medelvärden. och slutligen dissociation kurvor för LBVa (blå) och IKOV (röd) visar intervallet av Tm värden observerade över lyssavirus släkte (F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:10-faldigt seriella utspädningar för tre lyssavirus arter: RABV (RV108), DUVV (RV131) och ARAV (RV3379). R2 = 0,996, 0,9962 respektive 0,9637. Data punkter vid 10-7 (0,0001 ng/μl) nådde detektionsgränsen (där ett värde erhölls). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativ 10-faldig serie utspädning data från hela lyssavirus släkte (se individuella legender för lyssavirus identitet och tabell 6 för tabellerade resultat i jämförelse med andra lyssaviruses). Panelerna a, c, e, g förstärkning tomter och B, D, F, H dissociation kurvor för a, c, e, och g respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | μL/reaktion |
| Vatten av molekylär kvalitet | 7,55 |
| 2x Universal RT PCR-reaktionsblandning | 10 |
| Primer framåt [20 μM] | 0,6 |
| Primer omvänd [20 μM] | 0,6 |
| RT-Enzymblandning | 0,25 |
| Totalt per reaktion | 19 |
Tabell 1: Pan-lyssavirus realtids RT-PCR Master Mix-reagens.
| Analys | Namn på primer | Primer roll | Sekvens 5 '-3 ' | Position1 |
| Lyssavirus | JW12 | RT-PCR | ATG TAA CAC CYC TAC AAT G | 53-73 |
| N165 | Pcr | GCA GGG TAY TTR TAC TCA TA | 165-146 | |
| ß-Actin | ß-Actin intronic | Pcr | CGA TGA AGA TCA AGA TCA TTG | 1051-1072 |
| ß-Actin omvänd | RT-PCR | AAG KATT TTG CGG TGG AC | 1204-1188 | |
| Primer-positioner ges i förhållande till Pasteur virus sekvens (M13215) och mus ß-Actin gensekvens (NM_007393) | ||||
Tabell 2: Pan-lyssavirus realtid RT-PCR primer Detaljer.
| Scenen | Cykler | Temperatur | Tid | Data insamling |
| Omvänd Transkription | 1 | 50 ° c | 10 min | |
| RT inaktivering/initial denaturering | 1 | 95 ° c | 5 min | |
| Förstärkning | 40 | 95 ° c | 10 s | |
| 60 ° c | 30 s | slutpunkt | ||
| Analys av dissociationskurva | 1 | 9 ° c | 1 min | |
| 55 ° c | 1 min | |||
| 55-95 ° c | 10 s | alla Poäng |
Tabell 3: Pan-lyssavirus realtids RT-PCR cykel förhållanden.
| Test resultat | Intern ß-Actin-kontroll | Övergripande resultat |
| Negativa | Negativ1 | Ogiltig. Upprepad extraktion och analys2 |
| Negativa | Positiva | Negativt resultat rapporterat |
| Positiva | Positiva | Positivt resultat rapporterat |
| Positiva | Negativ1 | Upprepad extraktion och analys3 |
| 1 Användning av heterologa extern kontroll skulle vara fördelaktigt vid upprepad extraktion. | ||
| 2 Om ett andra negativt resultat erhålls för den interna kontrollen kommer provet att rapporteras som otestbart med denna analys. | ||
| 3 Om ett andra negativt resultat erhålls för den interna kontrollen, tillsammans med ett positivt testresultat, | ||
| diagnostiskt test bör göras för att bekräfta detta resultat. | ||
Tabell 4: Sammanfattning av utfall och övergripande resultat för Pan-lyssavirus Real-Time RT-PCR. Negativ är utsedd till ett prov utan Ct -värde (amplifiering) och ingen smälttemperatur (dissociation), eller en smälttemperatur som ligger utanför tm -området för positiva lyssaviruses (76,8 ° c-80,2 ° c). Positivt är utsett till ett prov med ett Ct -värde (amplifiering) och en smälttemperatur (dissociation) som är insidan av tm -sortimentet för positiva lyssaviruses.
| Lyssavirus-analys | ß-Actin-analysen | |||
| Ct | Tm | Ct | Tm | |
| Menar | 20,66 | 78,92 | 27,5 | 85,26 |
| Sd | 0,63 | 0,16 | 1,13 | 0,35 |
| LCL (95%) | 19,39 | 78,59 | 25,23 | 84,56 |
| UCL (95%) | 21,93 | 79,25 | 29,76 | 85,96 |
Tabell 5: Inter-Run analys av CVS positiv kontroll över 12 oberoende körningar inklusive flera operatörer.
| Phylogroup | Arter | Virus-ID | Lineage | Detektionsgräns | Tm |
| I | RABV | RV50 | OSS bat | 10-5 | 79,5 |
| I | RABV | RV51 | US Fox | 10-7 | 77,6 |
| I | RABV | RV108 | Chile bat | 10-7 | 78,63 |
| I | RABV | RV313 | Europeisk räv | 10-9 | 78,53 |
| I | RABV | RV437 | Europeiska RacDog | 10-7 | 78,09 |
| I | RABV | RV1237 | Europeiska hjortdjur | 10-8 | 78,76 |
| I | RABV | RV334 | Kinesiskt vaccin | 10-8 | 79,03 |
| I | RABV | RV102 | Africa 2 | 10-7 | 78,58 |
| I | RABV | RV995 | Africa 3a | 10-8 | 79,66 |
| I | RABV | RV410 | Africa 3b | 10-7 | 79,03 |
| I | RABV | RV2324 | Afrika 4 | 10-7 | 79,17 |
| I | RABV | RV2417 | Sri Lanka dog | 10-9 | 78,71 |
| I | RABV | CVS-11 | 10-7 | 79,17 | |
| I | EBLV-1 | RV20 | Tyskland | 10-6 | 79,05 |
| I | EBLV-2 | RV1787 | Storbritannien | 10-7 | 78,76 |
| I | BBLV | RV2507 | Tyskland | 10-9 | 78,71 |
| I | ABLV | RV634 | 10-8 | 78,25 | |
| I | DUVV | RV131 | 10-5 | 79,03 | |
| I | GBLV | RV3269 | 10-7 | 79,15 | |
| I | ARAV | RV3379 | 10-7 | 79,46 | |
| I | KHUV | RV3380 | 10-7 | 78,97 | |
| I | SHIBV | RV3381 | 10-7 | 78,59 | |
| I | IRKV | RV3382 | 10-3 | 78,59 | |
| Ii | LBVa | RV767 | 10-5 | 77,34 | |
| Ii | LBVd | RV3383 | 10-7 | 78,59 | |
| Ii | MOKV | RV4 | 10-3 | 78,81 | |
| Iii | IKOV | RV2508 | 10-5 | 79,67 | |
| Iii | LLEBV | RV3208 | 10-4 | 79,15 | |
| Iii | WCBV | RV3384 | 10-3 | 79 |
Tabell 6: Sammanfattning av Pan-lyssavirus realtid RT-PCR specificitet, känslighet och Tm för representativa lyssaviruses över alla tre phylogroups. Medelvärdet för Tm över lyssaviruses var 78,81 (SD 0,531).
Discussion
Pan-lyssavirus Real-Time RT-PCR-analysen beskrivs är ett slutet rör, en-stegs analys som detekterar lyssaviruses över alla tre phylogroups. Analysen har validerats för både djur-och Human rabies diagnos, inklusive post-mortem hjärnvävnad (optimalt hjärnstammen), och ante-mortem prover såsom hudbiopsi, seriellt insamlade saliv, eller cerebral spinal Fluid (CSF). Primers utnyttjas i denna analys först utformades och utnyttjas för en sond-baserade analys för att skilja mellan RABV, EBLV-1 och EBLV-23, som har använts i många OIE rabies laboratorier och utför konsekvent i EURL kompetens system. Därefter "Pan-lyssavirus" arten av dessa primers har bekräftats med hjälp av en 2-stegs realtidsanalys15. Analysen som beskrivs här har utnyttjat primers att ytterligare optimera RT-PCR i ett steg SYBR-analys möjliggör en sluten slang, snabb system. Vidare, utbildning i rabies endemiska länder som använder denna analys har bekräftat lämplighet att genomföra i alla laboratorier med grundläggande personlig skyddsutrustning och kvalitetssystem för att minska korskontaminering och spår prov, anläggningar för att lagra reagenser och en realtid maskin med SYBR-detektering. Analysen är extremt robust och har 100% korrelation med FETTET, med förbättrad känslighet för nedbrutet prover3. En av de främsta fördelarna för en DNA interkalerande Dye baserad analys i jämförelse med en sond baserad analys är den relativa kostnaden. En ytterligare fördel är att analysen endast använder två primers, därför finns det mindre risk för misslyckad upptäckt på grund av sekvens divergens, vilket har varit en svaghet i tidigare publicerade sond-baserade analyser. Faktum är att representanter för alla lyssavirus arter (bortsett från TWBLV och KBLV) upptäcks med hjälp av denna analys, och sekvensanalys av TWBLV och KBLV över primer platser avslöjar inga betydande skillnader starkt tyder på att de kommer också att upptäckas med hjälp av Denna metod. Intervallet av detektionsgränsen observeras över de virus som analyseras, kan anses bero på två huvudsakliga faktorer. Den första är att RNA isolerades från kliniskt hjärn material, därför är mängden arvsmassa i varje outspädd prov inte direkt jämförbar. RNA var "normaliserade" genom att justera det totala RNA till 1 μg/μL; emellertid, andelen av viral arvsmassa RNA inom det urvalet kommer att variera. Den andra är mångfalden av lyssavirus sekvenser, trots att primer platser som ligger i bevarade regioner, finns det fortfarande positioner av variation. Därför är det inte förvånande att majoriteten av lyssaviruses med lägre känslighet för analysen är phylogroup II och III virus. Dissociationskurvan är en viktig parameter som minimerar ett falskt positivt resultat som annars kan uppstå på grund av bildandet av primer-dimerer eller förstärkning av en icke-specifik region i värdens arvsmassa. I verkligheten, detta är en sällsynt händelse och dissociation kurvan analys motsvarar att köra en aguppstod gel för att visualisera korrekt storlek konventionella RT-PCR amplicons. Utbudet av godtagbara Tm -värden har tillhandahållits (77-80 ° c), baserat på de data som samlats in i vårt laboratorium. Det rekommenderas starkt att enskilda laboratorier sammanställer in-House-data för att säkerställa att sortimentet kan överföras och ändras i enlighet med detta. Tolkningen av resultaten från både amplifiering och dissociation tomter, tillsammans med positiva och negativa kontroller och ß-Actin resultat, möjliggör robusta och reproducerbara diagnostiska resultat.
Utanför tillämpningsområdet för detta protokoll är RNA extraktionsmetod som används för att få hög kvalitet RNA. Alla RNA analyseras i detta protokoll var beredd med TRIzol; emellertid, det finns många lämpliga guanidium-baserade extraktioner RNA utvinning protokoll tillgängliga, inklusive kolumn och pärla-baserade extraktion kit. Hantering av lyssavirus positiva (eller misstänkta positiva) prover måste finnas inom licenserade anläggningar för bio inneslutning som godkänts inom landet. Det totala RNA som utvinns är dock icke-infektiöst och hanteras därför inom låg behållar laboratorier. Beroende på vilken extraktionsmetod som används skulle kravet att kvantifiera och späda RNA behöva bedömas. För fenolbaserade extraktioner, inklusive TRIzol, krävs detta steg och förhindrar hämning av analysen från att förorda gDNA. emellertid, kolonn och pärlbaserade extraktioner (särskilt de med en DNA-utarmning skede) inte kräver utspädning före provningen.
I hela protokollet är det viktigt att omsorg och aktsamhet används för att förhindra korskontaminering och korrekt tillsats av prov till rätt brunnar. Ett kalkylblad med reagensberäkningar och plattlayout kan hämtas som en kompletterande fil. God laboratoriesed, inklusive rena arbetsytor, regelbundna förändringar av handskar, användning av barriär spetsar och olika rum/UV-skåp för att separera varje steg kommer att minimera risken för kontaminering. För att säkerställa att testet utförs med förväntade parametrar, måste positiva och negativa kontroller inkluderas och alla testprover körs i två exemplar (eller tre exemplar).
Införandet av kontroller är ett viktigt inslag i alla PCR, särskilt för diagnostik. Positiv kontroll RNA utarbetades från CVS (Challenge virus standard) infekterade mus hjärnor i omgångar och validerade och kalibrerade för att säkerställa överensstämmelse mellan partier. KONTROLLRNA kvantifierades och späddes till 1 μg/μL. RNA för vilket ett positivt resultat erhölls i en seriell utspädning ner till minst 10-4 (motsvarande 100 PG/μl) ansågs lämplig för ändamålet. Det positiva KONTROLLRNA lagrades vid-80 ° c i 10-1- portioner. Vid behov späddes en alikvot till 1:100 för att ge en arbets lager på 1 ng/μL och lagras vid-80 ° c i 5 μL engångsportioner. Det utspädda positiva kontroll-RNA användes för att representera lågnivå positiva prover och för att säkerställa att någon minskning av känsligheten hos analysen upptäcktes. Ett kontrollkort hölls för varje kontroll för att övervaka Ct -värdena och identifiera trender (tabell 5). Tabell 5 visade god Inter-Run jämförbarhet för CVS-positiva kontrollprov Ct och tm värden över flera dagar och operatörer, vilket ger en försäkran om att analysen är robust och reproducerbar. Resultat som avviker från dessa mätningar bör undersökas och prover upprepas vid behov. Vatten av molekylär kvalitet ingick i varje körning som en NTC för att bekräfta att reagenser var fria från kontaminering med lyssavirus RNA och bekräfta ett negativt prov. För att säkerställa RNA-extraktionseffekten testades ß-Actin tillsammans med testproverna i ett separat rör. Lyssavirus positiva KONTROLLRNA användes också för den positiva kontrollen ß-Actin. Andra endogena gener eller heterologa internkontrollsystem kan utnyttjas. Användningen av dessa kontroller säkerställde att alla steg analyserades under samma förhållanden som testproverna. Ibland, om provet var kraftigt försämrad eller inte innehöll tillräckligt värdrna (såsom saliv eller CSF), kan den endogena genen PCR misslyckas. I detta fall, där lyssavirus realtids RT-PCR-resultat var positivt, bekräftelse på en oberoende RNA-extraktion-för att utesluta kontaminering under RNA-extraktion på det ursprungliga provet eller genom ett sekundärt test (antingen molekylärt, t. ex. konventionell RT-PCR) , eller fett. Användning av tabell 4 vid analys av ett diagnostiskt prov säkerställde en korrekt tolkning.
Oberoende av den molekylära analys som används för att bekräfta rabiesinfektion, bör även uppföljningsundersökningar med hjälp av sanger-sekvensering för bestämning av lyssavirus-arten och klassisk teknik i virologi, såsom fett-eller virusisolering, göras för att möjliggöra ytterligare virus karakterisering och stödja anmälan av positiva fall till OIE och WHO.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Miss Emma Wise och Miss Megan Golding för hjälp med att slutföra experimenten. Utvecklingen av detta protokoll stöddes finansiellt av det brittiska departementet för miljö, livsmedel och landsbygdsfrågor (DEFRA), Skottlands regering och walesiska regeringen genom bidrag [SV3500, och SE0431] och av European virus Archive global (EVAg) projekt som har erhållit finansiering från Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram enligt bidragsöverenskommelsen nr 653316.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
| Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
| Centrifuge (mico) | Sigma | ||
| Finnpipettes (to dispense 0.5-1,000 µL) | Thermofisher | various | |
| iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
| MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
| MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
| Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
| Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
| Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
| Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
| Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
| Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
| Unless stated, alternative equipment can be used |
References
- OIE. OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).
- Panning, M., et al. Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).
- Wakeley, P. R., et al. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).
- Wang, L., et al. A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence. Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).
- Wadhwa, A., et al. A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258 (2017).
- Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. I. Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1484-1497 (2009).
- Hoffmann, B., et al. Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR "double check" strategy. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3970-3978 (2010).
- Faye, M., et al. Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus. Journal of Virological Methods. 243, 120-130 (2017).
- Dacheux, L., et al. Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- Marston, D. A., et al. Ikoma lyssavirus, highly divergent novel lyssavirus in an african civet. Emerging Infectious Diseases. 18 (4), 664-667 (2012).
- ICTV. Virus Taxonomy: 2018 Release: Email ratification October 2018 (MSL #33). , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hayman, D. T., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Calisher, C. H., et al. Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods. Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).
- Aznar-Lopez, C., et al. Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats. Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).
