Summary
dsDNA 인터칼레이팅 염료를 사용하는 이러한 실시간 RT-PCR은 리사바이러스 감염을 진단하는 데 적합합니다. 이 방법은 광견병에서 추출한 RNA로 시작하여 영양분 또는 사후 샘플로 의심되는 데, 마스터 믹스 준비, RNA 추가, 실시간 기계 설정 및 결과의 정확한 해석을 자세히 설명합니다.
Abstract
분자 는 신속하고 민감하며 구체적이며 광견병 진단의 중심이되었습니다. PCR 기지를 둔 분석실험은 광견병 진단을 확인하기 위하여 십년간 동안 이용되었습니다 그러나 광견병 감염을 검출하는 1 차적인 방법으로 OIE (동물 건강을 위한 세계 기구)에 의해 최근에 받아들여졌습니다. 실시간 RT-PCR 분석은 실시간 데이터를 제공하고 폐쇄 튜브 시스템으로 설정 중 오염 위험을 최소화합니다. DNA 인터칼로크롬 실시간 RT-PCR 어설슬은 고가의 프로브를 필요로 하지 않으며, 샘플당 비용을 최소화하며, 프라이머가 보존된 지역에서 설계될 때, 바이러스 계보 전반에 걸쳐 특이적인 어설보액은 단지 하나의 바이러스에 특이적이다. 종은 가능하다. 여기서 우리는 가장 발산되는 바이러스 IKOV, WCBV 및 LLEBV를 포함하여 Lyssavirus 속에 걸쳐 lyssavirus를 검출하는 범-리사바이러스 SYBR 실시간 RT-PCR 분석에 대해 설명합니다. 해리 곡선 분석과 함께,이 분석은 모든 lyssavirus 종을 검출의 장점과 함께, 민감하고 구체적이다. 이 분석실험은 품질이 보장되는 환경을 갖춘 많은 진단 실험실에서 채택되어 동물 및 인간 광견병 사례에 대한 강력하고 신속하고 민감한 진단을 가능하게 합니다.
Introduction
분자 방법론을 이용한 광견병의 진단은 2018년OIE에 의해 받아들여졌으며, 특히 샘플이 최적이 아닌 경우, 또는 영양 평가를 위해 광견병 사례를 확인하는 데 있어서 이러한 기술의 장점을 인식하고, 라이브 바이러스 또는 신선한 샘플에 대한 요구 사항이 없기 때문에. lyssaviruses를 위한 PCR 분석은 게놈이 RNA인 때 PCR가 개시될 수 있기 전에 역전사 (RT)를 요구합니다. 게놈의 3' 근위 영역을 검출하는 RT-PCR 분석은 전사 그라데이션이 lyssavirus 복제 도중 생기기 때문에, 가장 과민한 여겨짐으로 여겨됩니다. 일반적으로 사용되는 RT-PCR 검사는 종점(또는 겔 기반) 및 실시간의 두 가지 범주로 광범위하게 나눌 수 있습니다. 두 방법 모두 민감하고 구체적입니다. 그러나 실시간 분석기는 '실시간' 결과를 얻고 완전히 폐쇄된 튜브 시스템에서 수행되는 등의 몇 가지 추가적인 이점을 가지므로 작업자 오염 가능성을 줄입니다. 실시간 검법을 사용하여 얻은 lyssavirus 특이적 앰플리곤을 검출하는 두 가지 주요 접근법이 있습니다. 첫 번째는 형광포와 쿠싱을 포함하는 가수 분해 프로브 (예 : TaqMan 프로브)를 사용합니다. 프로브가 증폭 중에 표적 영역에 결합하면 중합효소의 외핵활성이 형광포및 쿠싱의 해리를 초래하여 생성된 형광을 측정할 수 있게 됩니다. 두 번째는 증폭 도중 이중 좌초된 DNA에 묶는 DNA intercalating 염료 (SYBR 녹색과 같은 형광질)를 이용합니다. 결합된 형광은 각 주기에서 검출되는 형광을 방출하여 제품의 실시간 검출 및 정량화를 허용합니다. 임의의 dsDNA에 결합하는 비특이적 특성으로 인해, 해리 곡선 분석은 반응의 특이성을 확인하기 위해 착수된다. 실시간 RT-PCR은 작은 앰플리톤 크기로 인해 빠르며, 일반적으로 길이가 200bp 미만입니다. 그러나 보존된 지역에서 프라이머와 프로브를 설계하기에 적합한 영역을 식별하는 것은 어려운 일이므로 프로브에 대한 요구 사항을 제거하는 것이 뚜렷한 이점입니다.
실시간 RT-PCR의 숫자는 특히 RABV2의 개별 균주 또는 혈통을 검출하고 또한 속 3,4,5,6에 걸쳐 lyssaviruses를 검출하기 위해 설계되었습니다. 7,8,9. 모든 검정은 프라이머(및 필요한 경우 프로브) 서열이 속을 가로질러 보존되는 방식에 따라 검출의 한계를 가질 것이다. 실제로, 신흥 또는 새로운 바이러스 긴장은 고도로 특정 프로브 기지를 둔 측정고를 비효과적이게 렌더링할 수 있습니다. 실시간 검출(염료 대 프로브)의 선택은 의도된 용도에 따라 달라집니다. 현지에서 공급되는 뇌 물질에 대한 감시를 수행하고 많은 수의 음의 시료를 기대하는 실험실의 경우, 더 저렴한 인터컬링 염료를 사용하는 것이 현명한 선택입니다. SYBR 녹색 접근법은 또한 새로운 또는 발산 리사 바이러스의 존재가 더 제한된 프로브 기반 검정에 의해 발견되지 않은 상태로 남아있을 것입니다 스캐닝 감시를 수행 할 때 최적 일 것입니다.
리사바이러스 속의 모든 구성원은 증상이 나타나면 치명적인 질병 광견병을 일으킨다. 인간과 동물 광견병의 대다수는 광견병 바이러스(RABV)에 기인하며, 이는국내 개(10)가 지배적인 저수지이다. 박쥐는 lyssaviruses에 대한 중요한 호스트 저수지이며 특징을 가진 두 개의 lyssavirus 종을 제외한 모든 박쥐에서 직접 확인되었습니다 - 이코마 리사 바이러스 (IKOV) 및 모콜라 바이러스 (MOKV) - 그리고 이 두 가지의, IKOV는 박쥐 호스트 저수지를 가지고 추측되고있다 11. 16 인식 된 리사 바이러스 종(12)이외에, 최근에 설명 된 두 개의 lyssavirus가 있습니다 : 대만 박쥐 리사 바이러스 (TWBLV)13 및 코탈라티 박쥐 리사 바이러스 (KBLV)14. 리사바이러스는 유전적으로 3개의 필로그룹으로 나눌 수 있고, RABV를 포함한 대부분의 라이사바이러스는 필로그룹 I에 속한다. 그러나, 가장 발산되는 리사바이러스는 phylogroup III에 속하며 RABV 또는 필로그룹 I 바이러스 서열을 표적으로 하도록 설계된 RT-PCRs에 의해 검출될 가능성이 낮다.
여기서 설명된 분석은 2005년3에처음 기재된 실시간 프라이머 쌍 JW12-N165를 이용한다. 프라이머는 원래 응용 프로그램이 lyssavirus 종을 분화하기 위해 프로브를 가진 TaqMan 분석기로 이었기는 하지만 범-리사바이러스로 설계되었다. 프라이머 쌍이 특이성에서 팬-리사바이러스였다는 후속 확인은 WCBV15를포함하여 이용 가능한 모든 리사바이러스 종에 대한 2단계 SYBR 실시간 분석상을 이용하여 달성되었다. 프라이머 쌍은 상호 칼레이트 형광로화를 이용한 1단계 RT-PCR 실시간 분석, 모든 16개의 인식된 lyssavirus 종의 대표자를 사용하여 검증된 여기에서 설명된다. 이러한 1단계 실시간 분석은 신속하고 민감하며, 용사바이러스 특이적 분석이며, 프라이머 세트의 견고성이 매우 다양한 리사바이러스 종을 식별하도록 설정된 것을 보여준다.
Protocol
자연 감염 후 APHA에서 받은 진단 물질에서 샘플, 또는 라이센스 70/7394에 따라 영국 홈 오피스 규정에 따라 APHA 윤리 및 통계위원회에 의해 평가 된 프로토콜을 사용하여 마우스를 접종하여 얻은.
1. 마이크로 체적 분광광도계를 사용하여 RNA의 정량화
- 분광광도계의 설정이 RNA로 설정되어 있는지 확인합니다.
- 1-2 μL의 분자 등급의 물을 사용하여 기계를 초기화하고 기준선을 설정합니다.
- RNA 수량을 평가하기 위해 각 시험 RNA 샘플의 1-2 μL을 사용하십시오.
- 판독값과 문서를 저장합니다.
- 필요한 경우 RNA를 1 μg/μL로 조정합니다.
참고: RNA는 항상 얼음 (또는 시원한 블록)에 보관해야합니다. RNA가 컬럼, 또는 비드 계 방법을 사용하여 수득되는 경우 RNA는 일반적으로 1 μg/μL 미만이다. 이 상황에서는 RNA를 깔끔하게 사용한다.
2. RNA 희석 시리즈의 준비는 종점 감도를 결정합니다
-
RNA의 10 배 직렬 희석을 합니다.
- 희석 계열(예를 들어, 10-1, 10-2 등)과 RNA 세부 사항을 가진 라벨 튜브.
- 각 튜브에 45 μL의 분자 등급의 물을 추가합니다.
- RNA 5 μL(이전에 1 μg/μL로 희석)을 넣고 잘 섞으세요.
- 적절한 소독제로 파이펫 팁을 폐기하고 새 팁으로 교체하십시오.
- 10-1에서 5 μL을 가지고 10-2 튜브에 추가하고 잘 섞는다.
- 나머지 희석과 함께 2.1.3-2.1.5를 반복합니다.
참고: RNA는 항상 얼음 (또는 시원한 블록)에 보관해야합니다.
3. 실시간 RT-PCR 반응 준비
- 스프레드시트를 사용하여, 실험 샘플의 수에 따라 플레이트 레이아웃을 계획하고, 리사바이러스 및 ß-actin 검법실험모두에 대해.
참고: 4개의 견본이 양성 및 음성 대조군으로 중복으로 시험되는 경우에, 이것은 둘 다 분석실험을 위한 10개의 반응에 동일시합니다. - RNA 템플릿과 분리된 '클린룸' 또는 영역에서 사용하기 전에 적절한 소독제로 표면을 닦아내거나 PCR 워크스테이션을 준비하십시오(사용하는 경우). 워크스테이션을 준비하려면 적절한 소독으로 캐비닛 표면을 닦고 필요한 품목을 워크스테이션에 넣고 문을 닫습니다. UV 광선을 10분 동안 켜다
- 냉동고에서 리젠트 및 프라이머를 제거하고 해동(표 1에 기재된 시약 및 표 2의프라이머).
참고: 효소 믹스는 글리세롤에 저장되므로 해동이 필요하지 않으며 항상 얼음 (또는 시원한 블록)에 보관해야합니다. 다른 모든 시약은 실온에서 해동될 수 있습니다. - 일단 해동되면 시약과 원심분리기를 잠시 섞어 액체를 수집합니다.
참고: 효소 믹스를 소용돌이하지 말고 잠시 원심 분리기를 하십시오. - 리사바이러스와 ß-액틴에 대해 별도의 마스터 믹스를 준비합니다. 각 반응에 대해 분자 등급 물 7.55 μL, 2x 유니버설 SYBR 녹색 반응 믹스 10 μL, 순방향 프라이머 0.6 μL, 역프라이머 0.6 μL, iTaq RT 효소 믹스 0.25 μL을 추가합니다.
- 스프레드시트를 사용하여 올바른 볼륨을 계산하여 수동 계산에서 오류를 방지합니다. 파이펫팅 오류를 보정할 수 있도록 충분한 마스터 믹스가 준비되어 있는지 확인합니다. 따라서 10개의 반응이 필요한 경우(3.1의 참고 참조), 12개의 반응을 준비하십시오.
- 얼음 (또는 차가운 블록)에 마스터 믹스를 준비하고 실시간 기계에 배치 될 때까지 얼음에 남아있습니다.
- 준비된 마스터 믹스, 원심분리기를 간략하게 혼합하고 19 μL을 스트립 튜브의 관련 웰또는 사용 중 실시간 기계와 호환되는 96 웰 플레이트에 분배합니다.
참고: 파이펫팅하는 동안 우물에서 기포 의 생산을 최소화합니다. - 별도의 방에서, 또는 3.2에 기재된 바와 같이 제조된 UV 캐비닛에서, 이전에 조정된 RNA의 1 μL을 조심스럽게 추가하여 1 μg/μL(1.5단계 참조)을 적절히 혼합하고 부드럽게 혼합한다. 피펫 팁을 사용 후 직접 소독제로 폐기하십시오(표면 아래).
- 테스트 샘플 후 컨트롤을 추가하고, 양성 대조군을 다음에 추가하고 템플릿 제어(NTC – 분자 등급물)를 마지막으로 추가합니다. 사용된 RNA의 양은 사용된 견본 모형 및 RNA 추출에 따라서 변경될 수 있습니다. 반응이 최적화되었는지 확인하기 위해 사용되는 양을 검증해야 합니다.
- 스트립 뚜껑이나 실러를 사용하여 모든 뚜껑이 단단히 닫혀 샘플의 방향을 충분히 라벨을 붙이기 위해 주의를 기울이는 씰 플레이트. 플레이트/스트립 튜브의 가장자리에 레이블을 지정합니다.
- 원심분리기를 사용하여 샘플을 스핀다운하여 우물 바닥에 있는 모든 액체를 수집합니다.
- 플레이트를 실시간 PCR 기계로 옮기고 도어를 열고 홀더에 놓아 플레이트 레이아웃에 따라 시료의 정확한 위치/방향을 보장합니다.
참고: 튜브 스트립을 사용하는 경우 홀더가 제자리에 있는지 확인하십시오. - 실시간 PCR 기계 프로그램을 열고 해리 곡선을 가진 SYBR 실시간 실험 옵션을 선택합니다. 데이터 수집 지점을 포함하여 표3에 지정된 열 순환 조건을 사용하여 실시간 PCR 기계를 프로그래밍합니다.
- 형광염료로 SYBR을 선택하고 표본 유형으로 알 수 없음을 선택하고 올바른 샘플 이름 상자에 이름을 삽입합니다.
참고: 복제와 리사바이러스와 ß-액틴 웰을 구분합니다. - 실험 데이터를 저장할 파일 위치를 선택하고 실행이 끝날 때 램프가 꺼지는지 확인하고 실행을 시작합니다.
참고: 첫 번째 단계는 RT 단계이므로 이 시간 동안 데이터가 수집되지 않으므로 램프에 예열 기간이 필요한 경우 RT 스테이지 중에 이러한 데이터가 발생할 수 있습니다. 실시간 기계 및 소프트웨어는 증폭 곡선을 실시간으로 표시하고 용융 곡선은 주기가 끝날 때 생성됩니다.
4. 데이터 분석
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실행이 완료되면 다음과 같이 데이터 분석을 수행합니다.
- 먼저 대조군 샘플과 함께 테스트 샘플의 증폭 플롯 결과를 분석합니다. 양수 샘플은 지수 경사로를 표시하며, 그 다음에는 고원과 Ct 값이 뒤따릅니다. 음수 샘플은 Ct 값이 없는 평면 증폭 플롯을 표시합니다(그림1A). Ct 값은 소프트웨어에 의해 자동으로 계산되지만 필요한 경우 이를 확인하고 수동으로 변경해야 합니다.
- 둘째, 대조군 샘플과 함께 테스트 샘플의 해리 곡선 결과를 분석합니다. 양수 샘플은 용융 온도(Tm) 77 – 80°C를 가지며, 양극 대조군 도 1B와중첩될 것이다.
- 컨트롤이 유효한지 확인하여 전체 진단 결과를 가져옵니다. 표 4를 사용하여 내부 ß-액틴 제어와 관련하여 결과를 해석합니다. 양수 대조군 샘플이 음수이거나 음수 샘플이 양수인 경우 실행을 무시해야 합니다.
- 대조군 RNA에 대해 얻어진 Ct 및 Tm 값을 '대조군 카드'에 기록하여 추세 분석을 가능하게 하고 분석 감도에서 드리프트를 식별하는 데 도움을 줍니다.
Representative Results
상기서에 기술된 프로토콜에 이어, 범용리사바이러스 RT-PCR의 감도는 제어 표준 바이러스(CVS)의 희석 계열에서 입증되었다(그림 1) 및 기타 리사 바이러스 ()그림 2및그림 3). SYBR Green I 염료는 cDNA 합성 및 PCR 증폭이 단일 튜브에서 수행되는 범용 원스텝 RT-PCR로 활용되었습니다. 특정 대상의 증폭이 발생하면 더 많은 염료가 결합되어 실시간으로 형광 수준이 증가합니다. 모든 염료 간 실시간 해석은 증폭 및 해리의 두 단계로 해석되어야 합니다. 증폭 단계는 실시간 증폭과 동일합니다(그림 1A). 배경과 관련하여 부족한 신호로 인해 DNA 증폭을 계산할 수 없는 초기 주기 동안 선형 '초기 단계'가 있습니다. 이 길이는 샘플의 대상 양과 직접 관련이 있습니다. 그 후, DNA 분자의 두 배가 검출되고 기록되는 지수 단계가 있습니다. 마지막으로, 고원 상에 도달 (떨어져 프로그램의 종료 전에이 단계에 도달하지 않을 수 있습니다 고희석 샘플에서). 이 단계에서는 시약의 고갈로 인해 형광 의 강도가 나뉩습니다. CVS의 10배 직렬 희석을 사용하여 관찰된 증폭 플롯은 예상 플롯(그림 1AC) 여기서 여기서 리사바이러스 분석법은 ß-액틴 분석법보다 더 높은 민감도를 보였다. 해리 곡선은 증폭 후 계산되었으며, 여기서 dsDNA는 온도의 점진적 증가와 온도의 함수로서 모니터링된 형광에 의해 ssDNA로 해리되었다(그림 1B, D-F). 특정 앰플리콘이 ssDNA로 해리되는 임계 온도는 열순환기 소프트웨어 (T)에 의해 측정 된 형광의 방출을 일으켰습니다.M). 이 해리 단계는 앰플리콘 크기에 대한 데이터를 제공하여 사용자가 긍정적인 대조군과 비교하여 결과를 해석할 수 있게 하여 거짓 긍정 결과의 가능성을 무시할 수 있습니다. 더 TM범용리사바이러스 분석()그림 1B) 및 ß-액틴 분석 (그림 1D)는 구별되며, 사용자가 T를 지적하여 올바른 분석 분석을 확인하는 데 도움을 주었다.M(그림 1E). 또한, CT및 TM실행과 연산자 간의 값을 평가하고 재현 가능한 것으로 나타났습니다(표 5). C를 계산하는 데 사용되는 임계값T값은 소프트웨어에 의해 자동으로 계산되었으며 사용되는 반응 믹스 또는 계측기를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 12개의 독립적인 실행 에서 평균 CT20.66(SD 0.63)을 용사바이러스 분석법에 대해, 27.5(SD 1.13)에 대해 ß-액틴 분석하였다. 대조적으로 T에서 관찰된 변형M이 측정에 대한 외부 영향이 없기 때문에 값이 현저히 낮았습니다. 예를 들어, 평균 TMCVS 용리 바이러스 분석의 경우 78.92 (SD 0.16) (표 5), 모든 리사바이러스의 평균과 비교했을 때 78.81 °C (SD 0.531) (표 6및그림 1F). T의 변화의 이 부족M가로 질러 Lyssavirus동일한 대조군 RNA가 시료에서 리사바이러스에 관계없이 사용될 수 있는 것과 같이, 그러나 T를 사용하여 lyssavirus 종 사이 분화하는 것이 유리하다M다른 RABV 서브 리니지T의 범위에 걸쳐 있기 때문에 특히 불가능M관찰된 값(표 6). 비특이적 증폭 플롯은 이 분석으로 거의 관찰되지 않습니다. 그러나 양수 결과와 비특이적 음수 결과를 정의하는 특정 매개변수가 필요합니다. 모든 라이사바이러스(0.531)에서 관찰된 SD는 가장 낮은(77.34- LBVa) 및 가장 높은(79.67- IKOV)에 적용되었다.M양수 특정 대역에 대해 76.8°C - 80.2°C 범위를 설정하는 값입니다. 따라서 TM이 범위를 벗어난 값은 비특이적이므로 음수 결과로 간주되었습니다. 때때로 샘플에 대해 여러 개의 피크가 관찰됩니다. 지배적 인 피크가 올바른 T에있는 경우M(각 복제에 대해) 샘플은 양수로 간주됩니다. 비특이적 피크가 관찰되는 가장 일반적인 이유는 프라이머-디머에 기인하며, 분석제는 프라이머 이완기를 최소화하도록 최적화되었다. 프라이머 이완제는 일반적으로 대상 시퀀스의 암플리폰보다 작아지므로 T가M특정 제품보다 낮습니다.
TRIzol을 사용하여 추출된 3개의 lyssavirus 양성 뇌 샘플 RNA의 10배 직렬 희석을 병렬로 실행하고 플롯하였다(도 2). 3개의 lyssaviruses에 대한 검출의 한계는 다양했지만, 아무도 Ct 36을 초과하지 않았다. 그림 2에서 플롯된 바이러스에 대한 R2 계수 값은 0.9637 및 0.996범위입니다. 분석된 모든바이러스에 대해(표 6) 범위가 이를 초과하지 않았고, 또한, 29개의 리사바이러스 중 7개에는 R2>0.99(데이터가 도시되지 않음)가 있었다. 희석 계열의 제조가 총 RNA 추출로부터 의한 것이라는 점을 고려하여, 관찰된 선형성은 분석이 견고하다는 증거를 제공한다. 마지막으로, 모든 리사바이러스 종(특히 가장 다양한 필로그룹 III 바이러스)의 검출은 Lyssavirus 속의 모든 3개의 필로그룹에 걸친 RNA의 패널을 사용하여 조사되었다. RNA는 본래 또는 실험적으로 감염된 마우스, 뇌 물질로부터 추출하였고, 전술한 프로토콜을 이용하여 활용하였다. 상기 결과는 프라이머가 발산하는 필로자바이러스 IKOV, WBCV 및 LLEBV를 포함하는 모든 용리바이러스 종을 증폭시키는 것을 확인하였다(표6 및 도3). 비-리사바이러스 rhabdoviruses의 다양한 패널은, 원래 항원적으로16을 수집하고 분석하였고, 최근에는 유전적으로17개가 스크리닝되었고, 노크로스 반응성이 검출되었고, 이는 프라이머가 특이적임을 나타낸다. Lyssavirus 속의 구성원만(데이터가 표시되지 않음). 범리사바이러스 실시간 분석기는 2013년부터 EURL(EU 기준 실험실) 간 숙련도 체계에 포함되었으며, 범리사바이러스 TaqMan 분석및 와 같은 다른 분자 분석과 100% 일치를 입증하고 있습니다. FAT (형광 항체 테스트) 이외에 기존의 RT-PCR 분석.
도 1: CVS 양성 대조군 RNA의 10배 직렬 희석, 범용 리사바이러스 RT-PCR 분석법에서 실행, 증폭 플롯(A) 및 해리 곡선(B)으로 시각화하고, 증폭 플롯(C)으로 시각화된 ß-액틴 RT-PCR 분석법에서 실행되고, 해리 곡선 (D). NTC = 템플릿 컨트롤이 없습니다. CVS 대조군 RNA의 비교는 범-리사바이러스 RT-PCR 분석법(파란색)과 상해 곡선(E)의 차이를 보여주는 ß-actin RT-PCR 분석법(빨간색)에서 모두 실행된다―평균값에 대한 표 5를 참조; 그리고 마지막으로 LBVa(파랑) 및 IKOV(적색)에 대한 해리 곡선은 리사바이러스 속(F)에서 관찰된 Tm 값의 범위를 시상한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 3개의 lyssavirus 종에 대한 10배 직렬 희석: RABV (RV108), DUVV (RV131) 및 ARAV (RV3379). R2 = 0.996, 0.9962 및 0.9637. 10-7(0.0001 ng/μL)의 데이터 포인트가 검출 한계에 도달했습니다(값을 얻은 위치). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Lyssavirus 속을 가로지르는 대표적인 10배 직렬 희석 데이터(다른 lyssaviruses와 비교하여 표화된 결과에 대한 lyssavirus ID 및 표 6에 대한 개별 범례 참조). 패널 A, C, E, G 증폭 플롯 및 B, D, F, H 해리 곡선 A, C, E 및 G각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | μL/반응 |
| 분자 등급의 물 | 7.55 |
| 2x 범용 RT PCR 반응 믹스 | 10개 |
| 프라이머 포워드 [20 μM] | 0.6 |
| 프라이머 리버스 [20 μM] | 0.6 |
| RT 효소 믹스 | 0.25 |
| 반응당 총 | 19세 |
표 1: 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR 마스터 믹스 시약.
| 시험 | 프라이머 이름 | 프라이머 역할 | 시퀀스 5'-3' | 위치1 |
| 리사 바이러스 | JW12 | RT-PCR | ATG 타아 CAC CYC TAC AAT G | 53-73 |
| N165 | Pcr | GCA GGG 테이 TTR TAC TCA TA | 165-146 | |
| ß-액틴 | ß-액틴 인트로닉 | Pcr | CGA TGA 아가 TCA AGA TCA TTG | 1051-1072 |
| ß-액틴 역 | RT-PCR | AAG CAT TTG CGG TGG AC | 1204-1188 | |
| 프라이머 위치는 파스퇴르 바이러스 서열(M13215) 및 마우스 ß-액틴 유전자 서열(NM_007393)과 관련하여 주어진다. | ||||
표 2: 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR 프라이머 세부 정보.
| 단계 | 사이클 | 온도 | 시간 | 데이터 수집 |
| 역전사 | 1개 | 50 °C | 약 10분 | |
| RT 불활성화/초기 변성 | 1개 | 95 °C | 약 5분 | |
| 증폭 | 40 | 95 °C | 10s | |
| 60 °C | 30s | 끝점 | ||
| 해리 곡선 해석 | 1개 | 9 °C | 1분 | |
| 55 °C | 1분 | |||
| 55 - 95 °C | 10s | 모든 점 |
표 3: 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR 사이클링 조건.
| 테스트 결과 | 내부 ß-액틴 제어 | 전체 결과 |
| 부정적인 | 음수1 | 올바르지 않음. 반복 추출 및 분석2 |
| 부정적인 | 긍정적인 | 부정적인 결과가 보고되었습니다. |
| 긍정적인 | 긍정적인 | 긍정적인 결과가 보고되었습니다. |
| 긍정적인 | 음수1 | 반복 추출 및 분석3 |
| 1개 이종 외부 제어의 사용은 반복 추출 하는 동안 도움이 될 것 이다. | ||
| 2개 내부 대조군을 위해 두 번째 음의 결과를 얻은 경우, 샘플은 이 분석실험에 의해 시험할 수 없는 것으로 보고될 것이다. | ||
| 3개 내부 통제에 대해 두 번째 부정적인 결과가 얻어지면 양성 테스트 결과와 함께 이차 광견병이 발생합니다. | ||
| 이 결과를 확인하기 위해 진단 테스트를 수행해야 합니다. | ||
표 4: 범리사바이러스 실시간 RT-PCR에 대한 결과 및 전반적인 결과 요약. 음수는 Ct 값(증폭) 및 용융 온도(해리) 또는 양성 용해 바이러스(76.8°C- 80.2°C)에 대한 Tm 범위를 벗어난 용융 온도가 없는 시료에 지정됩니다. 양성은 양성 용해바이러스에 대한 Tm 범위 의 내부에 있는 Ct 값(증폭) 및 용융 온도(해리)를 가진 시료에 지정된다.
| 리사바이러스 분석 | ß-액틴 분석 | |||
| 코네티컷 | Tm | 코네티컷 | Tm | |
| 의미 | 20.66 | 78.92 | 27.5 | 85.26 |
| Sd | 0.63 | 0.16 | 1.13 | 0.35 |
| LCL (95%) | 19.39 | 78.59 | 25.23 | 84.56 |
| UCL (95%) | 21.93 | 79.25 | 29.76 | 85.96 |
표 5: 여러 연산자등 12개의 독립 실행에서 CVS 포지티브 컨트롤의 상호 실행 분석.
| 필로그룹 | 종 | 바이러스 ID | 계보 | 감지 한계 | Tm |
| Ⅰ | RABV | RV50 | 미국 박쥐 | 10-5 | 79.5 |
| Ⅰ | RABV | RV51 | 미국 폭스 | 10-7 | 77.6 |
| Ⅰ | RABV | RV108 | 칠레 박쥐 | 10-7 | 78.63 |
| Ⅰ | RABV | RV313 | 유럽 여우 | 10-9 | 78.53 |
| Ⅰ | RABV | RV437 | 유럽 락독 | 10-7 | 78.09 |
| Ⅰ | RABV | RV1237 | 유럽 사슴 | 10-8 | 78.76 |
| Ⅰ | RABV | RV334 | 중국 백신 | 10-8 | 79.03 |
| Ⅰ | RABV | RV102 | 아프리카 2 | 10-7 | 78.58 |
| Ⅰ | RABV | RV995 | 아프리카 3a | 10-8 | 79.66 |
| Ⅰ | RABV | RV410 | 아프리카 3b | 10-7 | 79.03 |
| Ⅰ | RABV | RV2324 | 아프리카 4 | 10-7 | 79.17 |
| Ⅰ | RABV | RV2417 | 스리랑카 개 | 10-9 | 78.71 |
| Ⅰ | RABV | CVS-11 | 10-7 | 79.17 | |
| Ⅰ | EBLV-1 | RV20 | 독일 | 10-6 | 79.05 |
| Ⅰ | EBLV-2 | RV1787 | 영국 | 10-7 | 78.76 |
| Ⅰ | BBLV | RV2507 | 독일 | 10-9 | 78.71 |
| Ⅰ | ABLV | RV634 | 10-8 | 78.25 | |
| Ⅰ | 듀브 ()에 듀브 ()에 ( | RV131 | 10-5 | 79.03 | |
| Ⅰ | GBLV | RV3269 | 10-7 | 79.15 | |
| Ⅰ | 아라브 (주) | RV3379 | 10-7 | 79.46 | |
| Ⅰ | KHUV (주) | RV3380 | 10-7 | 78.97 | |
| Ⅰ | 시브브 (주)(주)(주 | RV3381 | 10-7 | 78.59 | |
| Ⅰ | IRKV | RV3382 | 10-3 | 78.59 | |
| Ii | LBVa | RV767 | 10-5 | 77.34 | |
| Ii | LBVd | RV3383 | 10-7 | 78.59 | |
| Ii | 목크 (목)는 | RV4 | 10-3 | 78.81 | |
| Iii | IKOV | RV2508 | 10-5 | 79.67 | |
| Iii | LLEBV | RV3208 | 10-4 | 79.15 | |
| Iii | WCBV | RV3384 | 10-3 | 79세 |
표 6: 3개의 필로군에 걸쳐 대표적인 리사바이러스에 대한 범리사바이러스 실시간 RT-PCR 특이성, 민감도 및 Tm의 요약. 리사바이러스에 걸친 평균 Tm은 78.81(SD 0.531)이었다.
Discussion
기재된 범용 리사바이러스 실시간 RT-PCR 분석은 3개의 필로그룹 모두에 걸쳐 용해바이러스를 검출하는 폐쇄관, 1단계 분석이다. 이 분석은 사후 뇌 조직(최적으로 뇌간) 및 피부 생검, 연속적으로 수집된 타액 또는 대뇌 척수액(CSF)과 같은 영양 모템 샘플을 포함하여 동물 및 인간 광견병 진단모두에 대해 검증되었습니다. 이 분석에서 활용된 프라이머는 많은 OIE 광견병 실험실에서 사용되어 왔으며 EURL 숙련도 계획에서일관되게 수행되어 RABV, EBLV-1 및 EBLV-2 3을 구별하기 위해 프로브 기반 분석에 먼저 설계및 활용되었습니다. 이어서 이들 프라이머의 '범리사바이러스' 성질은 2단계 실시간 분석(15)을이용하여 확인되었다. 여기서 설명된 분석서는 프라이머를 활용하여 폐쇄튜브, 신속한 시스템을 가능하게 하는 1단계 SYBR 분석에서 RT-PCR을 더욱 최적화했다. 또한, 이 분석기를 사용하여 광견병 발병 국에서 교육을 실시하여 교차 오염 및 추적 샘플을 줄이기 위한 기본 PPE 및 품질 시스템을 갖춘 모든 실험실에서 시약을 저장하는 시설 및 실시간 을 구현할 수 있는 적합성을 확인했습니다. SYBR 검출이 있는 기계. 이 분석은 매우 견고하며 FAT와 100% 상관관계가 있으며 분해된시료에 대한 민감도가 향상되었습니다 3. 프로브 기반 분석과 비교하여 DNA 간질 염료 기반 의 주요 장점 중 하나는 상대적인 비용입니다. 추가 적인 이점은 분석이 2개의 프라이머만 이용한다는 것입니다, 그러므로 이전에 간행된 탐사기 기지를 둔 분석에 있는 약점이었던 서열 발산 때문에 실패한 탐지의 더 적은 리스크가 있습니다. 실제로, 모든 lyssavirus 종의 대표자 (TWBLV및 KBLV 제외)는 이 분석을 사용하여 검출되고, 프라이머 사이트에 걸쳐 TWBLV와 KBLV의 서열 분석은 또한 사용을 사용하여 검출될 것이라는 점을 강하게 건의하는 중요한 발산을 제시하지 않습니다 이 메서드를 사용합니다. 분석된 바이러스에 걸쳐 관찰된 검출의 한계의 범위는, 두 가지 주요 요인에 기인하는 것으로 간주될 수 있다. 첫 번째는 RNA가 임상 뇌 물질로부터 분리되었기 때문에 각 원액 샘플에서 게놈 사본의 양은 직접적으로 비교할 수 없다는 것입니다. RNA는 총 RNA를 1 μg/μL로 조정하여 '정규화'되었습니다. 그러나, 그 견본 내의 바이러스성 게놈 RNA의 비율은 변화할 것입니다. 두 번째는 보존 된 지역에 있는 프라이머 사이트에도 불구하고, lyssavirus 서열의 다양성, 변화의 위치가 남아있다. 따라서, 분석에 대한 민감도가 낮은 대부분의 용염바이러스가 필로그룹 II 및 III 바이러스라는 것은 놀라운 일이 아니다. 해리 곡선 분석은 필수 파라미터를 나타내며, 그렇지 않으면 프라이머 이량체의 형성, 또는 숙주 게놈 내의 비특이적 영역의 증폭으로 인해 발생할 수 있는 거짓 양성 결과를 최소화한다. 실제로, 이것은 드물게 발생하며 해리 곡선 분석은 아가로즈 겔을 실행하여 기존의 RT-PCR 앰플리온을 올바르게 시각화하는 것과 같습니다. 허용 가능한 Tm 값의 범위는 실험실에서 수집된 데이터에 기초하여 (77-80 °C)로 제공되었습니다. 개별 실험실은 사내 데이터를 수집하여 범위를 양도할 수 있도록 하고 그에 따라 수정하는 것이 좋습니다. 증폭 및 해리 플롯의 결과를 양수 및 음수 제어 및 ß-액틴 결과와 함께 해석하면 강력하고 재현 가능한 진단 결과를 구현할 수 있습니다.
이 프로토콜의 범위를 벗어나는 것은 고품질 RNA를 얻기 위하여 이용된 RNA 추출 방법이다. 본 프로토콜에서 분석된 모든 RNA는 TRIzol을 사용하여 제조하였다; 그러나 컬럼 및 비드 기반 추출 키트를 포함하여 많은 적합한 구니듐 기반 추출 RNA 추출 프로토콜이 있습니다. lyssavirus 양성 (또는 의심되는 양성) 견본의 취급은 국가 내에서 승인된 면허생물 봉쇄 시설 안에 있어야 합니다. 그러나, 추출된 총 RNA는 비감염성, 그러므로 낮은 봉쇄 실험실 내처리됩니다. 사용된 추출 방법에 따라 RNA를 정량화하고 희석하는 요구 사항을 평가해야 합니다. TRIzol을 포함하는 페놀 계 추출의 경우, 이 단계가 요구되고 gDNA를 오염시키는 분석의 억제를 방지한다; 그러나, 컬럼 및 비드 기지를 둔 추출 (특히 DNA 고갈 단계를 가진 사람들은) 시험의 앞에 희석을 요구하지 않습니다.
프로토콜 전반에 걸쳐 교차 오염을 방지하고 올바른 웰에 시료를 정확하게 추가하는 데 주의와 근면이 필요합니다. 시약 계산 및 플레이트 레이아웃이 있는 스프레드시트를 추가 파일로 다운로드할 수 있습니다. 깨끗한 작업 표면, 장갑의 정기적 인 변화, 장벽 팁 및 각 단계를 분리하는 다른 객실 / UV 캐비닛을 포함한 좋은 실험실 실습은 오염의 가능성을 최소화합니다. 테스트가 예상 매개 변수로 수행되도록 하려면 양수 및 음수 컨트롤을 포함해야 하며 모든 테스트 샘플이 중복(또는 세 배)으로 실행되어야 합니다.
컨트롤의 포함은 모든 PCR의 필수 기능, 특히 진단에 대 한. 양성 대조군 RNA는 CVS(챌린지 바이러스 표준)에서 감염된 마우스 뇌를 일괄처리로 제조하고 배치 간의 일관성을 보장하기 위해 검증 및 보정하였다. 대조군 RNA를 정량화하고 1 μg/μL. RNA로 희석하였고, 이RNA는 적어도 10-4(100 pg/μL와 동일)까지 직렬 희석에서 양성 결과를 얻었으며 목적에 적합한 것으로 간주되었다. 양성 대조군 RNA를10-1 aliquots에서 -80°C에서 저장하였다. 필요한 경우, 1:100을 희석하여 1 ng/μL에서 작업 스톡을 제공하고 5 μL 일회용 aliquots에서 -80°C에서 보관하였다. 희석된 양성 대조군 RNA는 낮은 수준의 양성 샘플을 나타내고, 분석법의 민감도의 임의의 감소를 검출하기 위해 사용되었다. Ct 값을 모니터링하고 추세를 식별하기 위해 각 컨트롤에 대해 '제어 카드'를 보관하였다(표 5). 표 5는 여러 날 및 연산자에서 CVS 양성 대조군 샘플 Ct 및 Tm 값에 대한 양호한 실행 간 비교 가능성을 보여 주었으며, 분석이 견고하고 재현 가능한것이라는 확신을 제공합니다. 이러한 측정에서 벗어난 결과를 조사하고 필요한 경우 샘플을 반복테스트해야 합니다. 분자등급의 물은 NTC로서 모든 실행에 포함되어 시약이 리사바이러스 RNA로 오염되지 않음을 확인하고 음성 샘플을 확인하였다. 더욱이, RNA 추출 효능을 보장하기 위해, ß-액틴은 별도의 튜브에서 시험 샘플과 함께 시험하였다. 리사바이러스 양성 대조군 RNA는 또한 ß-액틴 양성 대조군을 위해 사용되었다. 다른 내인성 유전자 또는 이종 내부 제어 시스템이 활용될 수 있다. 이러한 컨트롤을 사용하면 테스트 샘플과 동일한 조건에서 모든 단계를 분석할 수 있습니다. 때때로, 샘플이 고도로 분해되었거나 충분한 숙주 RNA(예: 타액 또는 CSF)를 포함하지 않은 경우, 내인성 유전자 PCR이 실패할 수 있다. 이 경우, lyssavirus 실시간 RT-PCR 결과가 양성인 경우, 독립적인 RNA 추출에 대한 확인-원래 테스트 또는 이차 테스트(예: 기존 RT-PCR와 같은 분자)에 의한 RNA 추출 시 오염을 배제합니다. 또는 지방. 진단 샘플을 분석하는 동안 표 4를 사용하여 올바른 해석을 보장했습니다.
광견병 감염을 확인하는 데 사용되는 분자 분석법에 관계없이 Sanger 시퀀싱을 사용하여 지방 이나 바이러스 격리와 같은 바이러스학의 용해 종 및 고전 기술을 결정하는 후속 조사는 또한 수행되어야합니다. OIE 및 WHO에 대한 긍정적인 사례의 통지를 지원하고 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 실험을 완료하는 데 도움을 준 미스 엠마 와이즈와 미스 메건 골딩에게 감사를 표하고 자합니다. 이 프로토콜의 개발은 영국 환경, 식품 및 농촌 부 (Defra), 스코틀랜드 정부 및 웨일스 정부보조금 [SV3500 및 SE0431]과 유럽 바이러스 아카이브 글로벌 (EVAg) 프로젝트에 의해 재정적으로 지원되었습니다. 보조금 협정 No 653316에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
| Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
| Centrifuge (mico) | Sigma | ||
| Finnpipettes (to dispense 0.5-1,000 µL) | Thermofisher | various | |
| iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
| MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
| MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
| Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
| Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
| Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
| Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
| Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
| Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
| Unless stated, alternative equipment can be used |
References
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