Summary
Dette Real-Time RT-PCR bruker dsDNA interkalering fargestoff er egnet til å diagnostisere lyssavirus infeksjoner. Metoden begynner med RNA Hentet fra rabies mistenkt ante-obduksjon eller etter obduksjon prøver, detaljering Master Mix forberedelse, RNA tillegg, oppsett av Real-Time maskin og riktig tolkning av resultatene.
Abstract
Molekylær analyser er raske, følsomme og spesifikke, og har blitt sentrale for diagnostisering rabies. PCR basert analyser ha blitt anvende for tiåret å anerkjenne rabiat diagnosis bortsett fra ha bare i den seneste tid blitt akseptert av det OIE (verden Organisation for dyr sunnhet) som primære metoden å merker rabiat infeksjon. RT-PCR-analyser i sanntid gir sanntidsdata og er lukkede rørsystemer som minimerer risikoen for forurensning under konfigureringen. DNA interkalering fluorokromkonjugert Real-Time RT-PCR analyser krever ikke dyre sonder, minimere kostnaden per prøve, og når primere er utformet i bevarte regioner, analyser som er spesifikke på tvers av virus slekter heller enn spesifikke for bare ett virus arter er mulig. Her beskriver vi en pan-lyssavirus SYBR Real-Time RT-PCR-analysen som oppdager lyssaviruses over lyssavirus slekten, inkludert de mest forskjellige virusene IKOV, WCBV og LLEBV. Inne forbindelsen med dissosiasjon kurven analyse, denne analysen er følsom og spesifikk, med det fordel av oppdager alle lyssavirus art. Analysen har blitt vedtatt i mange diagnostiske laboratorier med kvalitet sikrede miljøer, slik at robust, rask, følsom diagnose av dyr og menneskelige rabies tilfeller.
Introduction
Diagnostisering av rabies ved hjelp av molekylære metoder ble akseptert av OIE i 20181, erkjenner fordelene av disse teknikkene i å bekrefte rabies tilfeller, spesielt i situasjoner når prøvene er sub-optimale, eller for ante-obduksjon diagnose, idet det er nei behov for bo virus eller frisk eksemplar. PCR-analyser for lyssaviruses krever en omvendt transkripsjon (RT) før PCR kan starte som Genova er RNA. RT-PCR-analyser som oppdager 3 ' proksimale-regionen i Genova regnes som den mest følsomme, som transcriptional graderinger oppstår under lyssavirus replikering. Brukte RT-PCR-analyser kan deles grovt inn i to kategorier, endepunkt (eller gel-basert) og i sanntid. Begge tilnærminger er følsomme og spesifikke; men sann tids analysen har noen ekstra fordeler som å få resultater i "Real-Time" og blir utført i et helt lukket rørsystem, og dermed redusere potensialet for operatøren forurensning. Det er to viktigste tilnærminger for å oppdage lyssavirus-spesifikke amplicons innhentet ved hjelp av sanntids-analyser. Den første utnytter hydrolyse sonder (for eksempel TaqMan-sonder) som inneholder en fluoroforen og en tørste. Når sonden bindes til målområdet under forsterkning, resulterer den exonuclease aktiviteten i polymerase i dissosiasjon av fluoroforen og tørste, slik at den resulterende fluorescens måles. Den andre utnytter en DNA interkalering fargestoff (fluorokromkonjugert som SYBR Green) som binder seg til dobbelt strandet DNA under forsterkning. Den bundne fluorokromer avgir fluorescens som oppdages ved hver syklus, slik at sanntidsdeteksjon og kvantifisering av produktet. På grunn av det ikke-spesifikk art av innbindingen å alle dsDNA, en dissosiasjon kurven analyse er gjennomført å anerkjenne det spesifisitet av reaksjonen. Real-Time RT-PCRene er raske på grunn av små amplicon størrelser, vanligvis mindre enn 200 BP i lengde; men å identifisere egnede regioner for å designe primere og sonder i bevarte regioner, kan være utfordrende, derfor fjerner kravet til en sonde er en klar fordel.
En rekke Real-Time RT-PCRene har blitt designet for spesielt å oppdage individuelle stammer eller linjene av RABV2 og også å oppdage lyssaviruses over slekten3,4,5,6, 7,8,9. Alle analysene vil ha en grense på deteksjon avhengig av hvor bevart primer (og om nødvendig, sonden) sekvenser er over slekten. Faktisk, nye eller romanen virusstammer kan gjengi svært spesifikke sonde-baserte analyser ineffektiv. Valget av Real-Time deteksjon (fargestoff g. probe) vil avhenge av den tiltenkte anvendelse. For et laboratorium gjennomfører overvåking på lokalt hentet hjernen materiale og forventer høye antall negative prøver, bruk av billigere interkalering fargestoff er et fornuftig valg. Den SYBR Green tilnærmingen vil også være optimal når gjennomføre skanning overvåking der tilstedeværelsen av romanen eller avvikende lyssaviruses ville forbli uoppdaget av mer begrenset sonde-baserte analyser.
Alle medlemmer av slekten Lyssavirus forårsake sykdommen rabies, som er dødelig når symptomene vises. Det aller meste av Human og dyr rabiat sakene er på grunn av rabiat virus (RABV), det dominerende reservoar for hvilke er det hjemmemarked hunden10. Bat er viktig vert reservoarer for lyssaviruses og alle unntatt to lyssavirus arter preget har blitt identifisert direkte i ball-Ikoma lyssavirus (IKOV) og Mokola virus (MOKV)-og av disse to, har IKOV vært spekulert å ha en bat vert reservoar 11. i tillegg til de 16 anerkjente lyssavirus arter12, er det to lyssaviruses som nylig har blitt beskrevet: Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)13 og Kotalahti bat lyssavirus (KBLV)14. Lyssaviruses kan være genetisk delt inn i tre phylogroups, med flertallet av Lyssaviruses, inkludert RABV, tilhører phylogroup I. Imidlertid, de fleste avvikende lyssaviruses høre til phylogroup III og er usannsynlig å bli oppdaget av RT-PCRene beregnet på mål RABV eller phylogroup jeg virus sekvenser.
Analysen beskrevet her benytter sanntids primer pair JW12-N165, først beskrevet i 20053. Den primere ble designet for å være Pan-lyssavirus riktignok den opprinnelige søknaden var som en TaqMan analysen med sonder å differensiere lyssavirus arter. Påfølgende bekreftelse på at primer paret var Pan-lyssavirus i spesifisitet ble oppnådd utnytte en 2-trinns SYBR sanntids analysen på alle lyssavirus arter tilgjengelig, inkludert WCBV15. Primer paret er beskrevet her i en ett-trinns RT-PCR sanntids analysen utnytte en interkalering fluorokromkonjugert, validert ved hjelp av representanter fra alle 16 anerkjente lyssavirus arter. Dette ett-trinns sanntids analysen er en rask, følsom, lyssavirus-spesifikke analysen og viser at robusthet av primer satt til å identifisere selv svært avvikende lyssavirus arter.
Protocol
Prøver fra diagnostisk materiale mottatt ved APHA etter naturlig infeksjon, eller innhentet av vaksinere mus ved hjelp av protokoller vurdert av APHA etikk og statistisk komité under UK Home Office forskrifter under lisens 70/7394.
1. kvantifisering av RNA ved bruk av en Micro-Volume spektrofotometer
- Kontroller at innstillingene til spektrofotometer er satt til RNA.
- Bruk 1-2 μL av molekyl karakter vann for å initialisere maskinen og angi en Baseline.
- Bruk 1-2 μL av hver test RNA-prøve for å vurdere RNA-antallet.
- Lagre målingene og dokumentet.
- Juster om nødvendig RNA til 1 μg/μL.
Merk: RNA-en må holdes på is (eller i en kjølig blokk) til enhver tid. Hvis RNA oppnås ved hjelp av en kolonne, eller en perle BAS ert metode, er RNA vanligvis mindre enn 1 μg/μL. I denne situasjonen bruker RNA ryddig.
2. klargjøring av RNA fortynning-serien for å bestemme sluttpunkt følsomhet
-
Lag en seriell fortynning på 10 ganger med RNA-en.
- Etiketten rør med fortynning serien (f. eks, 10-1, 10-2, etc.) og RNA detaljer.
- Tilsett 45 μL av molekyl karakter vann til hvert rør.
- Tilsett 5 μL av RNA (tidligere fortynnet til 1 μg/μL) og bland godt.
- Kast dråpe spissen i egnet desinfeksjonsmiddel og Skift ut med et friskt tips.
- Ta 5 μL fra 10-1 og tilsett til 10-2 rør og bland godt.
- Gjenta 2.1.3-2.1.5 med de resterende fortynninger.
Merk: RNA-en må holdes på is (eller i en kjølig blokk) til enhver tid.
3. klargjøring av Real-Time RT-PCR reaksjoner
- Bruk et regneark til å planlegge plate oppsettet i henhold til antall testprøver og kontroll prøver, både for lyssavirus og ß utgangen analyser.
Merk: Hvis 4 prøver skal testes i duplikat med en positiv og negativ kontroll, tilsvarer dette 10 reaksjoner for begge analysene. - I et rent rom eller område adskilt fra RNA-malen, tørker du av overflatene med et egnet desinfeksjonsmiddel før du bruker eller klargjør en PCR-arbeidsstasjon (Hvis du bruker den). For å klargjøre arbeidsstasjonen, tørk av skap overflaten med en passende desinfisere og plasser elementene som kreves i arbeidsstasjonen og Lukk dørene. Slå på UV-lyset i 10 minutter
- Fjern Regents og primere fra fryseren og tine (reagenser oppført i tabell 1 og primere i tabell 2).
Merk: Enzymet Mix er lagret i glyserol så krever ikke tine og må holdes på isen (eller i en kjølig blokk) til enhver tid. Alle andre reagenser kan tint ved romtemperatur. - Når tint, bland reagensene og sentrifuger kort for å samle væske.
Merk: Ikke Vortex enzymet mix, bare sentrifuger kort. - Forbered separate Master mikser for lyssavirus og ß-utgangen. For hver reaksjon, tilsett 7,55 μL av molekyl karakter vann, 10 μL av 2x Universal SYBR grønn reaksjons miks, 0,6 μL av forover primer, 0,6 μL av omvendt primer, 0,25 μL av iTaq RT-enzym mix.
- Bruk et regneark til å beregne korrekte volumer for å unngå feil ved manuell beregning. Sikre nok Master-Mix er forberedt på å kompensere for pipettering feil. Hvis det er nødvendig med 10 reaksjoner (se NOTE i 3,1), klargjør du 12 reaksjoner
- Forbered Master-Mix på is (eller i en kjølig blokk) og forbli på isen til den plasseres i Real-Time maskinen.
- Bland de forberedte Master-mikser, sentrifuger kort og dispensere 19 μL i de relevante brønnene i strimmelen rør eller en 96 brønn plate kompatibel med sann tidsmaskin i bruk.
Merk: Minimer produksjonen av bobler i brønnene mens pipettering. - I et eget rom, eller i et UV kabinett tilberedt som beskrevet i 3,2, tilsett forsiktig 1 μL av RNA tidligere justert til 1 μg/μL (se trinn 1,5) under overflaten av den aktuelle Master-Mix godt og bland forsiktig. Kast dråpe spissen inn i desinfeksjonsmiddel rett etter bruk (under overflaten).
- Legg kontrollene etter testprøvene, med den positive kontrollen lagt til neste og ingen mal kontroll (NTC-molekylær karakter vann) lagt til sist. Mengden RNA som brukes kan endres avhengig av prøve typen og RNA-ekstraksjon som brukes. Beløpet som brukes må godkjennes for å sikre at reaksjonen er optimalisert.
- Tetningsplate med stripe lokk eller sealer ta vare for å sikre at alle lokkene er godt lukket og merket tilstrekkelig til å orientere prøvene. Merk kanten på plate/stripe-rørene.
- Snurr ned prøvene ved hjelp av en sentrifuge for å samle all væsken i bunnen av brønnene.
- Overfør plate til PCR-maskinen i sanntid, åpne døren og plasser i holderen som sikrer riktig plassering/orientering av prøvene i henhold til plate oppsettet.
Merk: Hvis det brukes rør strimler, må du kontrollere at holderen er på plass. - Åpne opp i sanntid PCR maskinen programmet og velg alternativet for SYBR sanntids eksperiment med dissosiasjon kurve. Programmere PCR-maskinen i sanntid ved hjelp av de termiske sykkel forholdene som er angitt i tabell 3, inkludert datainnsamlings punktene.
- Velg SYBR som fluorescerende fargestoff og velg Ukjent som eksempel type og sett inn et navn i riktig eksempel navn boksen.
Merk: Skill mellom de replikerer og også mellom lyssavirus og ß-utgangen brønner. - Velg en filplassering for å lagre de eksperimentelle dataene, sørg for at lampen blir slått av på slutten av kjøringen, og start deretter kjøringen.
Merk: Som det første trinnet er et RT-Stadium, blir ingen data samlet inn i løpet av denne tiden, derfor, hvis lampen krever en oppvarmingsperiode, kan dette skje under RT-stadiet. Sann tidsmaskinen og programvaren vil vise forsterknings kurvene i sanntid, mens den smeltende kurven vil bli generert på slutten av syklusen.
4. data analyse
-
Når kjøringen er fullført utføre dataanalyse som følger.
- Først analysere forsterkning tomten resultatene av testen prøvene langs kontroll prøvene. Positive prøver viser eksponentiell ramper, vanligvis etterfulgt av platå og en Ct verdi. Negative prøver viser flate forsterknings plott uten Ct -verdier (figur 1a). Verdien Ct beregnes automatisk av programvaren, selv om dette bør kontrolleres og endres manuelt hvis det er nødvendig.
- For det andre, analysere dissosiasjon kurve resultatene av testprøvene sammen med kontroll prøvene. En positiv prøve vil ha en Smeltetemperatur (Tm) 77 – 80 ° c, og overlapper med den positive kontrollen figur 1B).
- Få det samlede diagnose resultatet ved å sikre at kontrollene er gyldige. Bruk Tabell 4 til å tolke resultatene i forhold til den interne ß-utgangen kontrollen. Hvis de positive kontroll prøvene er negative og/eller de negative prøvene er positive, skal kjøringen ignoreres.
- Ta opp Ct og tm verdier innhentet for kontroll RNA i et ' kontrollkort ' for å muliggjøre trendanalyse og bidra til å identifisere drifts i analyse følsomheten.
Representative Results
Etter protokollen beskrevet ovenfor, følsomheten til Pan-lyssavirus RT-PCR ble demonstrert på en fortynning serie av kontroll standard viruset (CVS) (Figur 1) og en rekke andre lyssaviruses (Figur 2OgFigur 3). SYBR grønn I fargestoff ble benyttet som en universell ett-trinns RT-PCR, der cDNA-syntese og PCR-forsterkning utføres i et enkelt rør. Som forsterkning av det spesifikke målet oppstår, mer fargestoff er bundet, noe som resulterer i sanntids økte nivåer av fluorescens. Alle farge interkalering sanntidsanalyser må tolkes i to faser: forsterkning og dissosiasjon. Forsterknings fasen er identisk med enhver sann tids forsterkning (Figur 1A). Det er en lineær "tidlig fase" i løpet av de tidlige syklusene der DNA forsterkning ikke kan beregnes på grunn av utilstrekkelig signal i forhold til bakgrunnen. Lengden på dette er direkte relatert til mengden av målet i utvalget. Deretter er det en eksponentiell fase der dobling av DNA molekyler er oppdaget og registrert. Til slutt er platå fasen nådd (bortsett fra de svært fortynnede prøvene som kanskje ikke når denne fasen før slutten av programmet). I denne fasen, intensiteten av fluorescens nivåer ut, på grunn av tømming av reagenser. Forsterkningen tomter observert ved hjelp av en 10-fold seriell fortynning av CVS, likedannet til forventet tomter (Figur 1AC) der lyssavirus analysen viste en høyere følsomhet enn ß-utgangen analysen. Dissosiasjon kurven ble beregnet etter forsterkning, der dsDNA ble dissosiert inn i ssDNA av en trinnvis økning i temperatur og fluorescens overvåkes som en funksjon av temperatur (Figur 1B, D-F). Terskel temperaturen som den spesifikke amplicon dissociates til ssDNA, forårsaket en frigjøring av fluorescens, som ble målt ved thermocycler programvare (TM). Denne dissosiasjon fasen ga data om amplicon størrelse, slik at brukeren kan tolke resultatet sammenlignet med en positiv kontroll, noe som resulterte i en ubetydelig sannsynlighet for falske positive resultater. Den TMfor CVS ved bruk av Pan-lyssavirus analysen (Figur 1B) og ß-utgangen-analysen (Figur 1D) er forskjellige, og hjulpet brukeren til å bekrefte den riktige analysen analysen ved å merke TMinnhentetFigur 1E). Videre er CTog TMmellom runs og operatører ble vurdert og vist å være reproduserbar (Tabell 5). Terskelen som brukes til å beregne CTverdi ble beregnet automatisk av programvaren og avhengig av mange faktorer, inkludert reaksjonsblandingen eller instrumentet som brukes. Over 12 uavhengige kjører gjennomsnittet CTvar 20,66 (SD 0,63) for lyssavirus-analysen og 27,5 (SD 1,13) for ß-utgangen-analysen. I motsetning variasjonen observert i TMverdier var markant lavere, på grunn av mangelen på ytre påvirkninger på denne målingen. For eksempel betyr TMfor CVS lyssavirus analysen var 78,92 (SD 0,16) (Tabell 5), sammenlignet med gjennomsnittet av alle lyssaviruses 78,81 ° c (SD 0,531) (Tabell 6OgFigur 1F). Denne mangelen på variasjon i TMpå tvers av Lyssaviruser fordelaktig som samme kontroll RNA kan brukes uavhengig av lyssavirus i prøven, men differensiering mellom lyssavirus artene ved hjelp av TMer ikke mulig, spesielt fordi ulike RABV sub-linjene spredte omfanget av TMverdier observert (Tabell 6). Ikke-spesifikke forsterkning plott er sjelden observert med denne analysen; Det kreves imidlertid spesifikke parametere for å definere et positivt resultat kontra et ikke-spesifikt negativt resultat. SD observert på tvers av alle lyssaviruses (0,531) ble brukt på den laveste (77,34-LBVa) og høyeste (79,67-IKOV) observert TMverdier for å sette et område på 76,8 ° c-80,2 ° c for positive spesifikke bånd. Derfor, TMverdier utenfor dette området ble ansett som ikke-spesifikke, og derfor et negativt resultat. Av og til observeres flere topper for en prøve. Hvis den dominerende toppen er på riktig TM(for hver replikere) så prøven anses positive. Den vanligste årsaken en ikke-spesifikk Peak er observert skyldes primer-dimers, analysen er optimalisert for å minimere primer dimers. Primer dimers vanligvis resultere i en amplicon mindre enn for målet sekvensen, derfor ville ha en TMlavere enn det spesifikke produktet.
En 10-fold seriell fortynning av tre lyssavirus positiv hjerne prøve RNAs ekstrahert ved hjelp av TRIzol, ble kjørt parallelt og plottet (figur 2). Grensen for deteksjon for de tre lyssaviruses varierte, men ingen overskredet Ct 36. R2 koeffisient verdier for virusene plottet i figur 2 varierte fra 0,9637 og 0,996. For alle virus analysert (tabell 6) området ikke overstiger dette, videre, 7 av de 29 Lyssavirus hadde R2 > 0.99 (data ikke vist). Tatt i betraktning at utarbeidelsen av fortynning serien er fra total RNA utdrag, linearitet observert gir bevis for at analysen er robust. Endelig deteksjon av alle lyssavirus arter (spesielt de mest varierte phylogroup III virus) ble undersøkt ved hjelp av et panel av RNAs spenner over alle tre phylogroups i lyssavirus slekten. RNA Hentet fra enten originale, eller eksperimentelt infiserte mus, hjerne materiale, ble utnyttet ved hjelp av protokollene beskrevet ovenfor. Resultatene bekrefter at primere forsterke alle lyssavirus arter, inkludert avvikende phylogroup III lyssaviruses IKOV, WBCV og LLEBV (tabell 6 og Figur 3). Et mangfoldig panel av ikke-lyssavirus rhabdoviruses, opprinnelig samlet og analysert antigenically16, og mer nylig genetisk17 ble vist og ingen-kryss reaktivitet ble oppdaget, noe som indikerer at primere er spesifikke for medlemmer av Lyssavirus slekten bare (data ikke vist). Den pan-lyssavirus sanntids analysen har vært inkludert i EURL (EUs referanse laboratorium) Inter-laboratorium dyktighet ordninger siden 2013, demonstrere 100% overensstemmelse med andre molekylære analyser som Pan-lyssavirus TaqMan analysen og konvensjonelle RT-PCR-analysen i tillegg til fett (fluorescerende antistoff test).
Figur 1:10-fold seriell fortynning av CVS positiv kontroll RNA, Kjør på Pan-LYSSAVIRUS RT-PCR-analysen, som er en bilde av forsterknings plottet (A) og dissosiasjon kurve (B), og Kjør på den ß-utgangen RT-PCR-analysen som er dissosiasjon kurve (D). NTC = ingen mal kontroll. Sammenligning av CVS kontroll RNA kjører både på den pan-lyssavirus RT-PCR-analysen (blå) og den ß-utgangen RT-PCR-analysen (rød) som demonstrerer forskjellen i dissosiasjon kurver (E) – se tabell 5 for gjennomsnittsverdier; og til slutt dissosiasjon kurver for LBVa (blå) og IKOV (rød) demonstrere rekkevidden av Tm verdier observert på tvers av Lyssavirus slekten (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:10-fold seriell fortynninger for tre lyssavirus arter: RABV (RV108), DUVV (RV131) og ARAV (RV3379). R2 = 0,996, 0,9962 og 0,9637 hhv. Data punkter på 10-7 (0,0001 ng/μL) nådde grensen for påvisning (hvor en verdi ble innhentet). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant 10-fold seriell fortynning data fra hele Lyssavirus slekten (se individuelle legender for Lyssavirus identitet og tabell 6 for ordnet resultater i forhold til andre lyssaviruses). Paneler a, C, E, g forsterkning plott og B, D, F, H dissosiasjon kurver for A, C, e, og g henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | μL/reaksjon |
| Molekylær karakter vann | 7,55 |
| 2x universell RT PCR-reaksjons blanding | 10 |
| Primer fremover [20 μM] | 0,6 |
| Omvendt primer [20 μM] | 0,6 |
| RT enzym Mix | 0,25 |
| Totalt per reaksjon | 19 |
Tabell 1: Pan-lyssavirus Real-Time RT-PCR Master Mix reagenser.
| Analysen | Primer navn | Primer rolle | Sekvens 5 '-3 ' | Posisjon1 |
| Lyssavirus | JW12 | RT-PCR | ATG TAA CAC CYC TAC AAT G | 53-73 |
| N165 | Pcr | GCA GGG TAY TTR TAC TCA TA | 165-146 | |
| ß-utgangen | ß-utgangen intronic | Pcr | CGA TGA AGA TCA AGA TCA TTG | 1051-1072 |
| ß-utgangen revers | RT-PCR | AAG CAT TTG CGG TGG AC | 1204-1188 | |
| Primer posisjoner er gitt i forhold til Pasteur virus sekvens (M13215) og mus ß-utgangen gen sekvens (NM_007393) | ||||
Tabell 2: Pan-lyssavirus Real-Time RT-PCR primer detaljer.
| Scenen | Sykluser | Temperatur | Tid | Data innsamling |
| Omvendt transkripsjon | 1 | 50 ° c | 10 min | |
| RT inaktive/innledende denaturering | 1 | 95 ° c | 5 min | |
| Forsterkning | 40 | 95 ° c | 10 s | |
| 60 ° c | 30 s | sluttpunkt | ||
| Analyse av dissosiasjon kurve | 1 | 9 ° c | 1 min | |
| 55 ° c | 1 min | |||
| 55-95 ° c | 10 s | alle punkter |
Tabell 3: Pan-lyssavirus Real-Time RT-PCR sykling forhold.
| Test resultat | Intern ß-utgangen kontroll | Samlet resultat |
| Negative | Negativ1 | Ugyldig. Gjenta ekstraksjon og analyse2 |
| Negative | Positive | Negativt resultat rapportert |
| Positive | Positive | Positivt resultat rapportert |
| Positive | Negativ1 | Gjenta ekstraksjon og analyse3 |
| 1 den andre Bruk av heterologous ekstern kontroll vil være fordelaktig under gjentatt ekstraksjon. | ||
| 2 andre priser Hvis det oppnås et andre negativt resultat for den interne kontrollen, vil prøven rapporteres som untestable av denne analysen. | ||
| 3 andre priser Hvis en andre negativt resultat er innhentet for den interne kontrollen, sammen med en positiv test resultat en sekundær rabies | ||
| diagnosetest bør gjennomføres for å bekrefte dette resultatet. | ||
Tabell 4: oppsummering av utfall og generelle resultater for Pan-lyssavirus Real-Time RT-PCR. Negativ er utpekt til en prøve uten Ct verdi (forsterkning) og ingen Smeltetemperatur (dissosiasjon), eller en Smeltetemperatur som er utenfor tm -rekkevidden for positiv Lyssaviruses (76,8 ° c-80,2 ° c). Positiv er utpekt til en prøve med en Ct verdi (forsterkning) og en Smeltetemperatur (dissosiasjon) som er inne i tm rekkevidde for positive lyssaviruses.
| Lyssavirus analysen | ß-utgangen analysen | |||
| Ct | Tm | Ct | Tm | |
| Mener | 20,66 | 78,92 | 27,5 | 85,26 |
| Sd | 0,63 | 0,16 | 1,13 | 0,35 |
| LCL (95%) | 19,39 | 78,59 | 25,23 | 84,56 |
| UCL (95%) | 21,93 | 79,25 | 29,76 | 85,96 |
Tabell 5: Inter-Run analyse av CVS positiv kontroll over 12 uavhengige løyper inkludert flere operatører.
| Phylogroup | Arter | Virus-ID | Lineage | Grense for påvisning | Tm |
| I | RABV | RV50 | AMERIKANSKE bat | 10-5 | 79,5 |
| I | RABV | RV51 | AMERIKANSK rev | 10-7 | 77,6 |
| I | RABV | RV108 | Chile bat | 10-7 | 78,63 |
| I | RABV | RV313 | Europeisk rev | 10-9 | 78,53 |
| I | RABV | RV437 | Europeisk RacDog | 10-7 | 78,09 |
| I | RABV | RV1237 | Europeisk hjort | 10-8 | 78,76 |
| I | RABV | RV334 | Kinesisk vaksine | 10-8 | 79,03 |
| I | RABV | RV102 | Afrika 2 | 10-7 | 78,58 |
| I | RABV | RV995 | Africa 3a | 10-8 | 79,66 |
| I | RABV | RV410 | Africa 3b | 10-7 | 79,03 |
| I | RABV | RV2324 | Afrika 4 | 10-7 | 79,17 |
| I | RABV | RV2417 | Sri Lanka hunden | 10-9 | 78,71 |
| I | RABV | CVS-11 | 10-7 | 79,17 | |
| I | EBLV-1 | RV20 | Tyskland | 10-6 | 79,05 |
| I | EBLV-2 | RV1787 | Storbritannia | 10-7 | 78,76 |
| I | BBLV | RV2507 | Tyskland | 10-9 | 78,71 |
| I | ABLV | RV634 | 10-8 | 78,25 | |
| I | DUVV | RV131 | 10-5 | 79,03 | |
| I | GBLV | RV3269 | 10-7 | 79,15 | |
| I | ARAV | RV3379 | 10-7 | 79,46 | |
| I | KHUV | RV3380 | 10-7 | 78,97 | |
| I | SHIBV | RV3381 | 10-7 | 78,59 | |
| I | IRKV | RV3382 | 10-3 | 78,59 | |
| Ii | LBVa | RV767 | 10-5 | 77,34 | |
| Ii | LBVd | RV3383 | 10-7 | 78,59 | |
| Ii | MOKV | RV4 | 10-3 | 78,81 | |
| Iii | IKOV | RV2508 | 10-5 | 79,67 | |
| Iii | LLEBV | RV3208 | 10-4 | 79,15 | |
| Iii | WCBV | RV3384 | 10-3 | 79 |
Tabell 6: oppsummering av Pan-lyssavirus Real-Time RT-PCR spesifisitet, følsomhet og Tm for representative lyssaviruses på tvers av alle tre phylogroups. Gjennomsnittlig Tm på tvers av lyssaviruses var 78,81 (SD 0,531).
Discussion
Det gryte-lyssavirus virkelig-tid RT-PCR analysen beskrevet er en stengt-rør, ettall-steg analysen hvilke merker lyssaviruses vannrett alle tre phylogroups. Analysen har blitt validert for både dyr og menneskelig rabies diagnose, inkludert post-obduksjon hjernevev (optimalt hjernestammen), og Ante-obduksjon prøver som hud biopsi, serielt samlet spytt, eller cerebral spinalvæske (CSF). Den primere benyttes i denne analysen ble først designet og benyttet for en sonde-basert analyse for å skille mellom RABV, EBLV-1 og EBLV-23, som har vært brukt i mange OIE rabies laboratorier og utfører KONSEKVENT i EURL ferdighet ordninger. Deretter ' Pan-lyssavirus ' natur disse primere er bekreftet ved hjelp av en 2-trinns sanntids analysen15. Analysen beskrevet her har benyttet grunning å ytterligere optimalisere RT-PCR i en ett-trinns SYBR analysen muliggjør en lukket tube, rask system. Videre opplæring i rabies endemiske land som bruker denne analysen har bekreftet egnethet til å gjennomføre i ethvert laboratorium med grunnleggende PPE og kvalitetssystemer for å redusere krysskontaminering og spor prøver, fasiliteter for å lagre reagensene og en real-time maskin med SYBR-deteksjon. Analysen er ekstremt robust og har 100% korrelasjon med FAT, med forbedret følsomhet for nedbrutt prøver3. En av de viktigste fordelene for en DNA interkalering fargestoff basert analysen i forhold til en sonde basert analysen er den relative kostnaden. En ekstra fordel er at analysen bare benytter to primere, derfor er det mindre risiko for mislykket deteksjon på grunn av sekvens avvik, som har vært en svakhet i tidligere publiserte sonde-baserte analyser. Faktisk, representanter for alle lyssavirus arter (bortsett fra TWBLV og KBLV) oppdages ved hjelp av denne analysen, og sekvens analyse av TWBLV og KBLV over primer nettsteder avslører ingen vesentlige forskjeller sterkt tyder på at de vil også bli oppdaget ved hjelp Denne metoden. Rekkevidden av grensen for påvisning observert på tvers av virus analysert, kan anses å være på grunn av to viktigste faktorene. Den første er at RNA ble isolert fra klinisk hjerne materiale, derfor er mengden av Genova eksemplarer i hver ufortynnet prøve ikke direkte sammenlignbare. RNA ble "normalisert" ved å justere den totale RNA-en til 1 μg/μL; imidlertid vil andelen av viral Genova RNA innenfor denne prøven variere. Den andre er mangfoldet av lyssavirus sekvenser, til tross for primer områder som ligger i bevarte regioner, er det fortsatt posisjoner av variasjon. Derfor er det ikke overraskende at flertallet av lyssaviruses med lavere følsomhet for analysen er phylogroup II og III virus. Den dissosiasjon kurve analysen representerer en viktig parameter, minimere et falskt positivt resultat som ellers kunne oppstå på grunn av dannelsen av primer dimers, eller forsterkning av en ikke-spesifikk region i verten Genova. I realiteten er dette en sjelden forekomst og dissosiasjon kurve analysen tilsvarer å kjøre en agarose gel å visualisere riktig størrelse konvensjonelle RT-PCR amplicons. Utvalget av akseptable Tm -verdier er gitt (77-80 ° c), basert på dataene som er samlet inn i laboratoriet vårt. Det anbefales på det sterkeste at enkelte laboratorier sorterer interne data for å sikre at rekkevidden er overførbar og endrer seg deretter. Tolkning av resultatene fra både forsterkning og dissosiasjon tomter, sammen med positive og negative kontroller og ß-utgangen resultater, gir robuste og reproduserbar diagnostiske utfall.
Utenfor omfanget av denne protokollen er RNA utvinningsmetode brukt for å oppnå høy kvalitet RNA. Alle RNA analysert i denne protokollen ble utarbeidet ved hjelp TRIzol; Det er imidlertid mange egnede guanidium-baserte utdrag RNA utvinnings protokoller tilgjengelig, inkludert Kol onne-og perle BAS ert avsugs sett. Behandling av lyssavirus positive (eller mistenkte positive) prøver må være innenfor de lisensierte biosikkert-fasilitetene som er godkjent i landet. Imidlertid er den totale RNA utvunnet ikke-smittsomme, derfor håndteres i lav kontroll laboratorier. Avhengig av utvinnings metoden som brukes, må behovet for å kvantifisere og fortynne RNA vurderes. For fenol-baserte utdrag, inkludert TRIzol, er dette trinnet nødvendig og hindrer hemming av analysen fra forurensende gDNA; kolonne-og perle BAS ert utdrag (spesielt de med en fase for DNA-tømming) krever ikke fortynning før testing.
Gjennom hele protokollen, er det viktig at omsorg og flid brukes for å hindre krysskontaminering og nøyaktig tilsetning av prøven til de riktige brønnene. Et regneark med reagens beregninger og plate oppsett er tilgjengelig for nedlasting som en tilleggsfil. God laboratoriepraksis, inkludert rene arbeidsflater, regelmessige endringer av hansker, bruk av barriere spisser og forskjellige rom/UV-skap for å skille hvert trinn minimerer sjansen for forurensning. For å sikre at testen utfører med forventede parametere, må positive og negative kontroller inkluderes, og alle testprøvene kjøres i duplikat (eller tre eksemplarer).
Inkludering av kontroller er en viktig funksjon i enhver PCR, spesielt for diagnostikk. Positiv kontroll RNA ble klargjort fra CVS (Challenge virus standard) infisert mus hjerner i grupper og validert og kalibrert for å sikre konsistens mellom partiene. Kontroll RNA-en ble kvantifisert og fortynnet til 1 μg/μL. RNA, der et positivt resultat ble oppnådd i en seriell fortynning ned til minst 10-4 (lik 100 PG/μL) ble ansett som egnet for formålet. Den positive kontroll RNA-en ble lagret ved-80 ° c i 10-1 alikvoter. Ved behov ble en alikvot fortynnet 1:100 for å gi et arbeids lager ved 1 ng/μL og lagret ved-80 ° c i 5 μL alikvoter for enkel bruk. Den fortynnede positive kontrollen RNA ble brukt til å representere positive prøver på lavt nivå, og for å sikre at en eventuell reduksjon i følsomheten til analysen ble oppdaget. Et kontrollkort ble beholdt for hver kontroll for å overvåke Ct -verdiene og identifisere trender (tabell 5). Tabell 5 demonstrerte gode Inter-Run SAMMENLIGNBARHET for CVS positiv kontroll prøven Ct og tm verdier på tvers av flere dager og operatører, noe som gir trygghet for at analysen er robust og reproduserbar. Resultater som avviker fra disse målingene bør undersøkes og testprøvene gjentas om nødvendig. Molekylær karakter vann ble inkludert i hvert løp som en NTC å bekrefte at reagensene var fri for forurensning med lyssavirus RNA og bekrefte en negativ prøve. Videre, for å sikre RNA utvinnings effekt, ble ß-utgangen testet ved siden av testprøvene i et separat rør. Den lyssavirus positive kontrollen RNA ble også benyttet for den ß-utgangen positive kontrollen. Andre endogene gener eller heterologous interne kontrollsystemer kan utnyttes. Bruk av disse kontrollene sørget for at alle trinnene ble analysert under de samme betingelsene som testprøvene. Av og til, hvis prøven var svært degradert eller ikke inneholdt tilstrekkelig vert RNA (for eksempel spytt eller CSF), kan den endogene genet PCR mislykkes. I dette tilfellet, der lyssavirus i sanntid RT-PCR-resultatet var positivt, bekreftelse på en uavhengig RNA-ekstraksjon-å utelukke forurensning under RNA-ekstraksjon på den opprinnelige testen eller ved en sekundær test (enten molekylær, slik som konvensjonell RT-PCR) eller FAT. Bruk av Tabell 4 under analyse av et diagnostisk utvalg sørget for riktig tolkning.
Uten hensyn til det molekylær analysen pleide anerkjenne rabiat infeksjon, følge etter etter opp undersøkelser benytter sanger sekvensering å avgjøre lyssavirus Art og klassisk teknikker inne Virology som basin eller virus isolasjon burde likeledes være gjennomført å regne med fremme virus karakterisering og oppbacking anmeldelsen av positiv sakene å OIE og WHO.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Miss Emma Wise og Miss Megan Golding for å få hjelp til å fullføre eksperimentene. Utviklingen av denne protokollen ble økonomisk støttet av den britiske avdeling for miljø, mat og Rural Affairs (DEFRA), Scottish Government og walisisk regjering ved tilskudd [SV3500 og SE0431] og av European virus Archive Global (EVAg) prosjekt som har mottatt støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings-og innovasjonsprogram under stipend avtalen no 653316.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
| Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
| Centrifuge (mico) | Sigma | ||
| Finnpipettes (to dispense 0.5-1,000 µL) | Thermofisher | various | |
| iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
| MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
| MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
| Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
| Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
| Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
| Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
| Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
| Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
| Unless stated, alternative equipment can be used |
References
- OIE. OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).
- Panning, M., et al. Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).
- Wakeley, P. R., et al. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).
- Wang, L., et al. A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence. Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).
- Wadhwa, A., et al. A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258 (2017).
- Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. I. Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1484-1497 (2009).
- Hoffmann, B., et al. Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR "double check" strategy. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3970-3978 (2010).
- Faye, M., et al. Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus. Journal of Virological Methods. 243, 120-130 (2017).
- Dacheux, L., et al. Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- Marston, D. A., et al. Ikoma lyssavirus, highly divergent novel lyssavirus in an african civet. Emerging Infectious Diseases. 18 (4), 664-667 (2012).
- ICTV. Virus Taxonomy: 2018 Release: Email ratification October 2018 (MSL #33). , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hayman, D. T., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Calisher, C. H., et al. Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods. Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).
- Aznar-Lopez, C., et al. Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats. Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).
