提出了一种用于大分子X射线晶体学的新型样品架以及合适的处理方案。该系统允许在环境温度和低温温度下采集晶体生长、晶体浸泡和原位衍射数据,无需任何晶体操作或安装。
大分子X射线晶体学(MX)是获取高分辨率生物大分子三维知识的最显性方法。该方法的前提是,需要从大分子中生长高有序的晶体标本,然后需要为衍射实验做好准备。此制备过程通常涉及从溶液中去除晶体,在溶液中生长,将晶体浸泡在配体溶液或冷冻保护剂溶液中,然后将晶体固定在适合实验的底座上。这个过程的一个严重问题是,大分子晶体往往是机械不稳定和相当脆弱。因此,处理这种易碎晶体很容易成为结构确定尝试的瓶颈。施加在这种精密晶体上的任何机械力都可能干扰分子的常规包装,并可能导致晶体的衍射力丧失。在这里,我们提出了一种新颖的一体式样品保持器,它是为了最小化晶体的处理步骤,从而最大限度地提高结构测定实验的成功率而开发的。样品架通过更换常用的显微镜盖滑,支持晶体滴的设置。此外,它允许就地晶体操作,如配体浸泡,低温保护和复杂的形成,没有任何结晶腔的开口,没有晶体处理。最后,设计了样品架,以便能够在环境温度和低温温度收集原位X射线衍射数据。通过使用这个样品保持架,由于不再需要直接晶体处理,从结晶到衍射数据收集的晶体在传输途中受损的机会大大降低。
生物大分子三维结构的知识是所有基础生物、生物化学和生物医学研究的重要基石。这甚至延伸到此类研究的某些翻译方面,例如药物发现。在原子分辨率X射线晶体学中获取这种三维信息的所有方法中,最有力、最突出的方法就是X射线所贡献的,这一事实证明了这一点,即90%的现有结构信息是由X射线贡献的。晶体学1.X射线晶体学的主要先决条件是必须为衍射实验制作和制备衍射质量晶体,这也是它的主要局限性。此步骤仍然是该方法的主要瓶颈之一。
从历史上看,蛋白质晶体的衍射数据是在环境温度下收集的。在收集数据之前,将个别晶体小心地转移到玻璃或石英毛细血管中,将母液添加到毛细血管中,使晶体不会变干,毛细血管被密封2、3、 4.自20世纪80年代以来,由于X辐射的电离特性和大分子晶体的辐射灵敏度,在环境温度下的数据收集对该方法构成了严重限制, 这一点越来越明显。因此,我们开发了一些方法,通过将大分子晶体冷却到100K来减轻辐射损伤的影响,并在这种低温下收集衍射数据5,6。在低温下工作,由于传热率低,将样品安装在毛细血管中变得不切实际。尽管如此,人们仍在努力使用毛细血管,特别是反扩散结晶实验,进行低温衍射工作7、8,但不管怎样,它还是成为标准在大分子晶体学中,将母液的薄膜在薄线环9、10中安装大分子晶体。尽管随着时间推移,这种基于环的安装进行了一些改进(例如,引入平版环和类似结构11),但1990年代初阶段制定的基本原则至今仍在使用。可以有把握地说,目前大分子晶体上的大多数衍射数据收集仍然依赖于这种方法5。
随着时间的推移,基于循环的安装方法出现了一些有趣的新发展,并作了修改,但这些方法迄今尚未在社区中得到广泛采用。一个是所谓的无环安装晶体,这是开发实现较低的背景散射12,13,14。另一个是使用石墨烯护套来包装晶体样品,并保护它们不干燥。石墨烯是一种非常适合这方面的材料,因为它的X射线散射背景非常低15。
最近,样品装载领域的开发主要侧重于标准化装载,目的是提高样品吞吐量16或设计可容纳多个样本17的装载,例如硅框架上的图案膜,能够保存数百个小晶体,主要在序列晶体学领域18,19,20,21,22。
到目前为止讨论的所有样品安装方法仍然需要一定程度的手动干预,这意味着存在对样品造成机械损坏的固有危险。因此,通过工程化样品环境,可以收集晶体的衍射数据,从而在其生长环境中收集新的方法。其中一种方法称为原位或板筛选23,24,它已经在全球25个同步辐射源的一些大分子晶体学束线上实施。然而,这种方法的使用受到晶体板的几何参数和仪器采样点周围可用空间的限制。
然而,在所谓的水晶定向系统26中,另一种方法也实现了。在这里,整个结晶滴是自动收获的。晶体生长的箔是使用激光定制切割,并直接用作样品架27。
在本文介绍的工作中,目的是开发一个样品保持架,允许用户将晶体样品从生长室移动到数据收集设备,而无需接触它,从而使用户能够轻松操作样品。由于大分子晶体学领域的许多研究人员仍在使用 24 孔结晶格式,通过修改大型筛选活动中确定的条件来优化晶体生长,因此新样品保持器被设计为与此格式兼容。在下面,将描述新样品架的设计,并演示样品保持器对原位数据收集和配体浸泡的处理和性能。最后,将讨论新样品持有人的适用性及其对各种工作步骤的限制。
适合结晶实验。新的样品支架可用于标准悬垂结晶实验,使用 24 孔林布罗型板(类型 1 和 2)或 24 孔 SBS 封装板,其中每个孔的直径为 18 mm(类型 3)。它们可用于代替标准显微镜盖滑。无定形的 COC 箔可确保系统的密封性。由于使用了高净度箔,因此可以使用透射光显微镜对结晶实验进行监测。据我们所知,24孔结晶板没有其他样品架,这将允许晶体操作或衍射实验,而无需机械地从晶体滴中取出晶体,在其中生长。这一点特别重要,因为该领域的许多研究人员仍然依赖这种晶板进行晶体优化,因为与 96 孔坐落板相比,可以使用更大的滴量。有了这些较大的落差,可以获得更大的晶体。
适合晶体操作。由于外部COC箔的自愈特性和内黄色聚酰亚胺箔的微孔结构,晶体环境是可访问的,晶体可以在不机械地将它们转移到其他容器的情况下进行操作。这使得样品架非常方便。我们所知道的唯一一个允许这种间接和温和地访问晶体的系统是水晶直系统26。然而,CrystalDirect 的弹性较低,因为必须使用特殊的 96 孔结晶板。晶体生长的箔与密封结晶实验相同,不能自愈。这意味着,通过激光消融将配体或冷冻保护剂输送到晶体的孔径将保持开放,增加液体蒸发的机会。这与我们的设计形成鲜明对比,即使 COC 箔多次被刺穿,晶体也不会直接暴露在环境中。
适合在环境温度下进行原位衍射实验。样品架可以以直前的方式从结晶板上取出,卡在磁基上,并放在横梁测角仪上。对于室温下衍射实验,建议将样品放入规定湿度33的气流中。在将样品支架放在测焦仪上之前,可以去除晶体周围的母液,以减少背景散射。这种设置在几个小时里是稳定的。
用于操作和储存的所用材料的适用性,在 100 K。用于生产样品架的材料和聚酰亚胺薄膜均不会因冷却至34低温而受到不利影响。因此,在低温(例如 100 K)下使用样品架不会造成严重问题。
适合在100K下进行原位衍射实验。在氮流中,在 100 K 处收集数据时,样品架需要像前一段一样从结晶板上移除,卡在磁基上,并放入横梁测角仪上 100 K 的气态氮流中。如果需要,样品也可能受到低温保护,尽管对于裸体样品来说,这可能在多数情况下可能没有必要。对于 100 K 的实验,2 型和 3 型样品支架更适合于外部塑料环。因此,它们的大小较小,因此应不太容易结冰。但是,即使可以使用类型为 1 的样本保持体。在实验小屋中,如果湿度不是太高,并且支架的低温系统结冰不是真正的问题。
限制。样品持有人的几何形状允许通过旋转方法在 160° 的总旋转范围内进行无阻碍的衍射数据收集。这就足够了,因此大多数晶体系统都可以获得完整的衍射数据集。在无法这样做的情况下,需要将来自多个晶体的数据合并在一起。当晶体一起生长时,可以调整事件X射线束的大小,以便只暴露单个晶体的一部分。在极端情况下,可能需要采用类似于 MeshAndCollect 方法35的数据收集策略。总之,虽然与样本持有者有某些限制,但在大多数情况下可以克服这些限制。当然,总是有可能遇到这种情况,而这种情况是不可能实现的。在这种情况下,可能需要采用其他晶体安装方法。
我们描述了一种用于大分子晶体学的新型样品支架,并证明了样品持有人对各种应用的适用性。考虑到蛋白质晶体的简单和可重复的处理,以及样品持有人的独特特性,我们相信这些样品持有者将被证明是大分子样品持有者库的宝贵补充晶体。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢由赫尔姆霍尔茨-曾特鲁姆柏林公司运营的BESSY II提供光束时间访问和支持,以及样品环境和技术设计部门在设计和施工以及 3D 打印机设施访问方面给予的帮助。
AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 – 2.5 µL volume |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number |
Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |