Summary
Een nieuwe steekproef houder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie samen met een geschikt behandelingsprotocol wordt voorgesteld. Het systeem maakt kristalgroei, Crystal soaken en in situ diffractie gegevens verzamelen op beide, ambient en cryogene temperatuur zonder de noodzaak van een kristal manipulatie of montage.
Abstract
Macromoleculaire X-Ray kristallografie (MX) is de meest prominente methode om een hoge resolutie driedimensionale kennis van biologische macromoleculen te verkrijgen. Een voorwaarde voor de methode is dat het hoogst bevolen kristallijne specimen van de te bestuderen macromolecule moet worden gekweekt, die dan voor het diffractie experiment moet worden voorbereid. Deze voorbereidingsprocedure impliceert typisch verwijdering van het kristal van de oplossing, waarin het werd gekweekt, het onderdompelen van het kristal in ligand oplossing of Cryo-beschermende oplossing en dan het immobiliseren van het kristal op een onderstel geschikt voor het experiment. Een ernstig probleem voor deze procedure is dat de macromoleculaire kristallen vaak mechanisch onstabiel en eerder breekbaar zijn. Dientengevolge, kan de behandeling van dergelijke breekbare kristallen gemakkelijk een knelpunt in een poging van de structuurbepaling worden. Om het even welke mechanische kracht die op dergelijke gevoelige kristallen wordt toegepast kan de regelmatige verpakking van de molecules verstoren en kan tot een verlies van diffractie macht van de kristallen leiden. Hier presenteren we een nieuwe all-in-een monsterhouder, die is ontwikkeld om de behandeling stappen van kristallen te minimaliseren en dus om het succespercentage van de structuurbepaling experiment te maximaliseren. De monsterhouder ondersteunt de instelling van kristallen druppels door het vervangen van de veelgebruikte Microscoop cover slips. Verder, maakt het in-plaats kristal manipulatie zoals ligand het onderdompelen, Cryo-bescherming en complexe vorming zonder enige opening van de kristallisatie Holte en zonder kristal behandeling. Ten slotte is de monsterhouder is ontworpen om de verzameling van in situ X-Ray diffractie gegevens op zowel, omgevings-en cryogene temperatuur mogelijk te maken. Door het gebruik van deze steekproef houder, de kans om het kristal op zijn weg van kristallisatie schade aan diffractie data collectie zijn aanzienlijk verminderd, omdat directe Crystal handling is niet langer nodig.
Introduction
De kennis van de driedimensionale structuur van biologische macromoleculen vormt een belangrijke hoeksteen in alle elementaire biologische, biochemische en biomedische onderzoeken. Dit strekt zich zelfs uit tot bepaalde Vertaal aspecten van dergelijk onderzoek, zoals bijvoorbeeld Drug Discovery. Onder alle methoden voor het verkrijgen van deze drie-dimensionale informatie op atomaire resolutie X-Ray kristallografie is de meest krachtige en de meest prominente een zoals blijkt uit het feit dat 90% van alle beschikbare structurele informatie wordt bijgedragen door X-Ray kristallografie1. De belangrijkste voorwaarde van X-Ray kristallografie, die op hetzelfde moment zijn grote beperking, is dat diffractie-kwaliteit kristallen moeten worden geproduceerd en voorbereid op de diffractie-experiment. Deze stap vormt nog steeds een van de belangrijkste knelpunten van de methode.
Historisch, werden de diffractie gegevens van eiwitkristallen verzameld bij omgevingstemperatuur. Individuele kristallen werden zorgvuldig overgebracht in glas of kwarts haarvaten voorafgaand aan de gegevensverzameling, moeder drank werd toegevoegd aan de haarvaten, zodat de kristallen niet zou uitdrogen en de haarvaten werden verzegeld2,3, 4. Sinds de jaren ' 80, werd het meer en meer duidelijk dat wegens de het ioniseren eigenschappen van X-straling en de dreigende stralingsgevoeligheid van macromoleculaire kristallen, gegevensinzameling bij omgevingstemperatuur strenge beperkingen op de methode vormt. Dientengevolge werden de benaderingen ontwikkeld om stralingsschade gevolgen te verminderen door macromoleculaire kristallen neer aan 100 K te koelen en diffractie gegevens bij dergelijke lage temperatuur te verzamelen5,6. Voor het werken bij lage temperaturen, de montage van de monsters in haarvaten werd onpraktisch als gevolg van het lage tarief van warmte-overdracht. Ondanks dit, zijn er voortdurende inspanningen om ook te gebruiken haarvaten, in het bijzonder van de tegen-diffusie kristallisatie experimenten, voor lage-temperatuur diffractie werk7,8, maar, ongeacht dat, werd het de standaard aanpak in macromoleculaire kristallografie te monteren macromoleculaire kristallen gehouden door een dunne film van moeder drank in een dunne bedrade lus9,10. Hoewel een aantal verbeteringen (bijv. de invoering van lithografie lussen en soortgelijke structuren11) zijn gemaakt in de tijd om deze lus-gebaseerde montage, de basisprincipes die werden ontwikkeld in de vroege jaren 1990 zijn nog steeds in gebruik vandaag. Het kan veilig worden verklaard dat de meeste diffractie datacollecties op macromoleculaire kristallen tegenwoordig nog steeds rekenen op deze aanpak5.
Na verloop van tijd waren er enkele interessante nieuwe ontwikkelingen en wijzigingen van de lus-gebaseerde montage methode, maar deze benaderingen zijn tot nu toe niet op grote schaal aangenomen in de Gemeenschap. Men is zogenaamd lijn-minder steun van kristallen, die werd ontwikkeld om het lagere verstrooien van de achtergrond12,13,14te bereiken. Een andere is het gebruik van grafeen scheden om de kristallijne steekproeven te verpakken en hen te beschermen tegen het uitdrogen. Grafeen is een goed geschikt materiaal in dat opzicht vanwege de zeer lage X-Ray verstrooiing achtergrond15.
Meer recentelijk, de ontwikkelingen op het gebied van steekproef mounts waren vooral gericht op het standaardiseren van de mounts met het doel van het verhogen van steekproef doorvoer16 of op het ontwerpen van mounts, die kan houden meer dan een monster17, zoals bijvoorbeeld patroon membranen op een siliconen frame, die in staat zijn te houden honderden kleine kristallen meestal op het gebied van seriële kristallografie18,19,20,21,22.
Alle van de steekproef montage methoden besproken tot nu toe nog steeds een zekere mate van handmatige interventie, wat betekent dat er een inherent gevaar van het veroorzaken van mechanische schade aan het monster. Daarom, nieuwe benaderingen worden gezocht door engineering de monster omgeving zodanig dat diffractie gegevens van kristallen kunnen worden verzameld binnen hun groeiomgeving. Een dergelijke methode wordt genoemd in situ of plaat-screening23,24 en het is al geïmplementeerd op een aantal macromoleculaire kristallografie beamlines op verschillende synchotron bronnen wereldwijd25. Nochtans, wordt het gebruik van deze methode beperkt door de geometrische parameters van de kristal plaat en de ruimte beschikbaar rond het steekproef punt van het instrument.
Nog een andere aanpak is gerealiseerd in de zogenaamde CrystalDirect systeem26. Hier worden hele kristallisatie druppels automatisch geoogst. De folies waarop de kristallen zijn geteeld zijn op maat gesneden met behulp van een laser en direct gebruikt als de monsterhouder27.
In het hier beschreven werk, was het doel om een steekproef houder te ontwikkelen, die een gebruiker zou toestaan om het kristallijne steekproef van zijn groeikamer aan het apparaat van de gegevensinzameling te bewegen zonder het aan te raken en dat de gebruiker zou toelaten om het monster gemakkelijk te manipuleren. Aangezien veel onderzoekers op het gebied van macromoleculaire kristallografie nog steeds met behulp van de 24-goed kristallisatie formaat voor het optimaliseren van de kristalgroei door het wijzigen van de voorwaarden geïdentificeerd in grote screening campagnes, de nieuwe monsterhouder is ontworpen om te worden compatibel met dit formaat. In het volgende wordt het ontwerp van de nieuwe monsterhouder beschreven en wordt de behandeling en de prestaties van de monsterhouder voor in situ gegevensverzameling en ligand soaken aangetoond. Tot slot zal de geschiktheid van deze nieuwe steekproef houder evenals zijn beperkingen voor de diverse het werkstappen worden besproken.
Protocol
Let op: voor alle daaropvolgende werkzaamheden is het zeer belangrijk dat de geel gekleurde polyimide folie niet met onbeschermde vingers wordt aangeraakt, vanwege mogelijke contaminatie aan de monsterhouder. Ook is het gebruik van beschermde Tang sterk aanbevolen.
1. de monsterhouder
- Gebruik een van de drie soorten monsterhouder.
Opmerking: drie verschillende versies van de nieuwe ontwikkelde monsterhouder worden weergegeven in Figuur 1. Elk van hen bevat een zwarte plastic steunstructuur, een luchtdichte COC folie aan de buitenkant en een microporeus gestructureerde polyimide folie aan de binnenkant. Type 1 (Figuur 1a) bevat een vaste buitenste kunststof ring, terwijl voor de types 2 en 3 (Figuur 1b,1c) de buitenste ring mechanisch kan worden afgebroken op de aangewezen respectieve breekpunten voor gebruik in geautomatiseerde steekproef transfersystemen (zie rode pijlen in Figuur 1b). Het ontwerp van de steekproef houders staat de opstelling van veelvoudige kristallisatie dalingen op de gele polyimide folie toe. Het doet geen afbreuk aan de controle van de kristallisatie experiment, omdat het materiaal is zeer transparant voor zichtbaar licht. De 21 μm dikke polyimide folie beschikt ook over 5 μm poriën, die eenvoudige kristal manipulatie mogelijk maakt doorweken later. Aangezien de transmissie van röntgenstralen dicht aan 1,0 bij alle algemeen gebruikte diffractie gegevens inzamelings energieën in macromoleculaire kristallografie is, is de bijdrage van de folie aan achtergrond het verstrooien in een diffractie experiment verwaarloosbaar28.
2. het opzetten van kristallisatie druppels
- Maak een schoon en stofvrij oppervlak met behulp van een vochtige pluisvrije doek. Neem een monsterhouder uit de doos en plaats deze voorzichtig, gele folie naar boven, op het gereinigde oppervlak om beschadiging of ongewenste punctie van de achterzijde COC folie te voorkomen.
- Stel de kristallisatie druppels met een maximaal aanbevolen volume van 2 µ L op de gele folie zoals het zou worden gedaan op de meest gebruikte cover dia's. Plaats de druppels zachtjes om te voorkomen dat een breuk of piercing van de folie met behulp van een pipet. Op een monsterhouder van type 1 (Figuur 2a) kunnen maximaal drie druppels worden geplaatst, terwijl op monster houders van type 2 en 3 2 druppels het aanbevolen maximum zijn (figuur 2c).
- Flip de monsterhouder over en plaats deze op een pre-ingevette holte van een 24-Well Linbro stijl plaat. Gebruik de positionerings hulpmiddelen (zie rode pijlen in Figuur 1a) van de monsterhouder om deze naar de optimale positie te leiden.
- Zorg voor de juiste positie van de monsterhouder om ongewenste verdamping te voorkomen (Figuur 2a).
3. observeren van kristalgroei
- Door het plaatsen van de kristallisatie plaat onder een transmissie lichtmicroscoop, met of zonder polarisatoren, monitor kristalgroei zonder enige verstoring van het experiment (Figuur 4).
- Bij gebruik van de kleinere 18-mm monster houders van type 3 (figuur 1c), die zijn ontworpen voor gebruik op SBS footprint platen, gebruik maken van een Imaging robot geschikt voor het hanteren SBS-footprint platen om de kristalgroei te controleren op een meer geautomatiseerde manier.
4. Crystal manipulatie
Nota: het wordt geadviseerd om alle verdere stappen onder een transmissie lichte Microscoop uit te voeren.
-
Cryo-bescherming
- Doordring de buitenste COC folie voorzichtig met een fijne bril. Zorg ervoor dat de binnenste gele folie blijft onaangeroerd. De punctie moet vlak naast de druppel die moet worden gemanipuleerd (Figuur 3a,3c).
- Gebruik een fijne papieren lont en steek deze in de poked gat. Duw voorzichtig de lont naar voren totdat hij raakt de gele polyimide folie. Houd de lont in contact met de geperforeerde folie. De lont zal zuigen weg alle overtollige oplossing. De tijd die nodig is voor een volledige vloeistof afvoer is afhankelijk van de viscositeit van de oplossingen en de samenstelling van de moeder likeur (Figuur 3b).
- Nadat alle vloeistof is wegge zogen, voorzichtig intrekken van de papieren lont. Onthoud de positie van de druppel, omdat het misschien niet zichtbaar zijn na het verwijderen van de moeder drank.
- Neem een standaard pipet om een kleine hoeveelheid Cryo-protectie oplossing toe te passen, Max. 3 µ L, met behulp van een geëxtrudeerde tip (bijv. een gel loading tip) door hetzelfde gat. Zodra de vloeistof wordt afgegeven, trekt u de tip. De porositeit van de gele folie zorgt voor diffusie in de folie. De tijd om Cryo-bescherming van uw kristallen te bereiken hangt hoogst van de tewerkgestelde oplossing en zijn componenten af.
- Om de Self-Healing COC folie opnieuw te verzegelen, plaats een beschermde vinger op het gat voor ongeveer 1 s en schuif het over de punctie. De lichte druk in combinatie met de verhoogde temperatuur zal de hersluiting van perforaties, die niet te groot zijn, bevorderen.
-
Ligand weken
Opmerking: overtollige moeder drank kan worden verwijderd voordat ligand weken. Hiertoe volgt u de in 4.1.1 tot en met 4.1.3 beschreven stappen.- Los de ligand in de moeder drank in de gewenste concentratie in een reactiebuis.
- Draai de oplossing gedurende 10 minuten bij 12.000 x g om onoplosbare deeltjes te verwijderen. Gebruik een temperatuur-gecontroleerde centrifuge indien nodig.
- Plaats een volume van Max. 3 µ L van ligand met oplossing in de kloof tussen de COC folie en de polyimide film met behulp van een lange, geëxtrudeerde pipet tip. Trek de tip.
- Om de Self-Healing COC folie opnieuw te verzegelen, plaats een beschermde vinger op het gat voor ongeveer 1 s en schuif het over de punctie (Zie ook 4.1.5).
- Incubeer het experiment voor enige tijd om te zorgen voor diffusie over het membraan. De het weken tijd hoogst hangt van de viscositeit van de het verspreiden oplossing en zijn componenten af29.
- Herhaal stap 4.2.1 tot 4.2.5 meerdere keren om vervolgens te genieten van verschillende liganden.
5. in situ diffractie gegevens verzamelen bij omgevingstemperatuur
Nota: om het verstrooien van het oplosmiddel te minimaliseren, verwijder bovenmatige oplossing vóór gegevensinzameling.
- Zorgen voor een stabiele luchtvochtigheid gecontroleerde Dubble omgeving met vooraf vastgestelde voorwaarden30.
- Til de transparante COC folie op het aangewezen punt met behulp van een tang en schil het af als men zou het deksel te verwijderen uit een yoghurt beker ( Figuur 6b).
- Til de monsterhouder voorzichtig uit de holte en plaats deze onmiddellijk in een vooraf geprepareerde magnetische monsterhouder basis. Geen lijm nodig is voor deze stap (Figuur 6b).
- Breng zachte druk om de juiste positionering van de monsterhouder te waarborgen binnen de basis.
- Monteer de monsterhouder op een Dubble goniometer en zorg voor een correcte positionering van de houder. Afhankelijk van de goniometer geometrie kan de monsterhouder met maximaal 160 ° gedraaid worden zonder dat er tijdens het diffractie experiment een schaduw wordt veroorzaakt.
- Gebruik een papieren lont en raak de gele polyimide folie van de achterzijde voorzichtig om overtollige moeder drank te verwijderen. Let op, dat in dat stadium ligand soaken of Cryo-bescherming kan worden uitgevoerd net zo goed. Het monster is nu klaar voor centreren en diffractie dataverzameling.
- Wanneer het gebruiken van een steekproef houder met verwijderbare buitenring, toepassing zachte druk door op de buitenring te houden en het weg te breken bij de aangewezen onderbrekingspunten (cijfer 6C). Het monster is nu klaar voor centreren en diffractie dataverzameling.
6. in situ diffractie gegevens verzamelen bij cryogene temperatuur
Opmerking: het is aanbevolen om residuele moeder likeur uit het monster te verwijderen door het uitvoeren van de stappen 4.1.1. aan 4.1.3. voordat u doorgaat met de volgende stappen om het verstrooien van oplosmiddelen te minimaliseren. De meeste monsters kunnen worden overgedragen aan vloeibare stikstof zonder voorafgaande Cryo-bescherming31. Als Cryo-Protection nodig is, zie stap 4.1.1. naar 4.1.5.
- Til het COC folie op het aangewezen punt met behulp van een pincet en Pel het af (zie stap 5.1.2) (Figuur 6a).
- Neem de monsterhouder uit de holte en monteer het op een magnetische monsterhouder basis. De zachte druk kan worden toegepast om de juiste en strakke montage te waarborgen (zie stap 5.1.5, Figuur 6b).
Nota: de symmetrisch geschikte aangewezen onderbrekingspunten staan voor eenvoudige verwijdering van de buitenring van de steekproef houder toe door zachte druk toe te passen (zie stap 5.1.8., figuur 6C). Nu, de monsterhouder is klaar en kan worden ondergedompeld in vloeibare stikstof. De geometrie van de monsterhouder types 2 en 3 (Figuur 1b,1c) laat hun overdracht in standaard wervelkolom monster flacons, die kunnen worden gebruikt voor de robot bijgestaan steekproef montage (figuur 6d).
Representative Results
De monsterhouder type 1 is zo ontworpen dat het past op een put van een 24-Well Linbro stijl plaat. Elke individuele monsterhouder bevat positionerings hulpmiddelen aan weerszijden van de buitenste rand om een optimale positionering op de rand van de put te garanderen (Figuur 1a, Figuur 2a). Maximaal drie individuele kristallisatie druppels van maximaal volume 2 µ L elk kan worden geplaatst op de gele polyimide folie (Figuur 2b). Voor monster houders van de types 2 en 3, is het raadzaam om maximaal twee druppels van maximaal volume 2 µ L per stuk in te stellen. 24 monster houders kunnen worden gemonteerd op 1 24-goed Linbro plaat (figuur 3D).
Een kristallisatie-experiment op een 24-Well Linbro plaat met behulp van monsterhouder type 1 werd opgericht. 1 µ L van kip ei-witte lysozym oplossing (15 mg/mL) werd gemengd met 1 µ L van moeder-alcoholische drank bestaande uit 50 mM RIA pH 4,7, 500 mM NaCl en 25% (w/v) PEG-6000 op de gele polyimide folie op de monsterhouder (tabel 1). De daling was geëquilibreerd bij 293 K tegen 500 µ L van moeder-alcoholische drank en de kristallen van de grootte 40-50 µm werden waargenomen na 5 uren (Figuur 4). Kristalgroei kan worden waargenomen met behulp van een transmissie lichtmicroscoop (Figuur 4) met of zonder een polarisator. Hoge transparantie films zorgen voor de beste observatie en monitoring van kristallen groeiende omstandigheden met behulp van beide, een conventionele lichtmicroscoop of een geautomatiseerde Crystal Imaging systeem. Kristalgroei observatie met UV-licht werd niet getest.
Na het verwijderen van de moeder drank uit de hele kristallen, een monsterhouder met kip ei-witte lysozym kristallen werd genomen uit de kristallisatie plaat en geplaatst in een luchtvochtigheid gecontroleerde Airstream op HZB-MX Dubble 14,332. Diffractie gegevens werden verzameld bij omgevingstemperatuur in 1 °-stappen met behulp van een 150 μm bundel op 13,8 keV energie met 4 x 1010 fotonen/s en een belichtingstijd van 5 s per beeld. Een typisch diffractie beeld wordt weergegeven in Figuur 5. Geen verhoogde achtergrond verstrooiing op de diffractie beeld kan worden gedetecteerd. De verdere experimentele details evenals de bijbehorende gegevens verwerkings statistieken zijn vermeld in tabel 2.
Figuur 1 : Schematische weergave van de nieuwe monster houders. De monster houders bestaan uit een zwarte plastic steun, die aan de buitenkant met een amorfe cyclische olefin copolymeer (COC) folie wordt behandeld. Deze folie (blauw gekleurd) is zeer transparant en zelf-helend. Het zorgt ook voor de dichtheid van het gas van het experiment. De binnenste folie (gekleurd in het geel) is gemaakt van bio-inerte polyimide, die is zeer transparant voor X-stralen. Op deze folie kunnen de kristallisatie druppels geplaatst worden. De buitenste rand van de monsterhouder bevat twee positionerings hulpmiddelen aangegeven door de rode pijl (paneel A), die het mogelijk maakt nauwkeurige plaatsing van de monsterhouder op de individuele pre-ingevette holte van de kristallisatie plaat. Amonsterhouder (type 1) met een diameter van 22 mm met een vaste externe steunring. (B) monsterhouder (type 2) met een diameter van 22 mm met afneembare externe steunring. Cmonsterhouder (type 3) met een diameter van 18 mm met uitneembare externe steunring. De laatste twee zijn ontwikkeld voor het gebruik ervan in een high-throughput mode met geautomatiseerde steekproef montage robots met behulp van WERVELKOLOM standaard. De aangegeven pauze punten worden gemarkeerd door de rode pijlen in paneel B. De zwarte pijl in paneel C geeft de positionerings markering aan. De uitstekende pinnen aan de buitenrand van de gele folie zijn noodzakelijk om de polyimide folie tijdens het productieproces af te stemmen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : De monsterhouder kan worden gebruikt op een 24-goed Linbro plaat op dezelfde manier als de veelgebruikte Microscoop cover slips. Het verzegelt de holte luchtdicht. Positionerings hulpmiddelen zorgen voor de juiste positionering van de monsterhouder op de holte (rode pijlen in paneel a). Maximaal drie individuele druppels kunnen worden geplaatst op een type 1 monsterhouder (paneel B), terwijl de aanbevolen maximum aantal druppels geplaatst op een type 2 of 3 monsterhouder is twee. Het maximaal aanbevolen volume voor elke druppel is 2 µ L. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : 24 type 1 monster houders passen op een 24-Well plaat. De monster houders kunnen in twee richtingen op de 24-Well plaat worden geplaatst zoals aangegeven (paneel D). Een bril wordt gebruikt om de rug te doordringen COC folie om overtollige drank te verwijderen uit een kristallisatie druppel (panelen a en C) met behulp van een papieren lont zachtjes ingevoegd in hetzelfde gat (paneel B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Afbeelding van kip ei-witte lysozym kristallen waargenomen door middel van een transmissie Microscoop uitgerust met een polarisator. De individuele kristallen worden gemakkelijk onderscheiden van neergeslagen eiwitoplossing. De kristallen in dit beeld zijn van een gemiddelde grootte van 40 µm x 50 µm. Please Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Een typische X-Ray diffractie beeld van een lysozym kristal geteeld op de monsterhouder. Voorafgaand aan de blootstelling aan X-stralen alle overtollige moeder drank werd verwijderd uit de buurt van het kristal. De gegevens van de diffractie werden verzameld bij omgevingstemperatuur op BL 14.3 bij de elektronen opslagring BESSy II32 gebruikend een vochtigheid gecontroleerde steekproef omgeving met 97,5% relatieve vochtigheid. Geen verhoogde achtergrond als gevolg van de steekproef houders kunnen worden waargenomen. De stippellijnen in de afbeelding geven de resolutie ringen aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : De monsterhouder is voorbereid voor diffractie gegevens verzamelen. Eerst wordt de COC-film voorzichtig opgeheven met behulp van een pincet en vervolgens afgepeld (paneel a). Vervolgens wordt de monsterhouder uit de holte verwijderd en in het centrale gat van een magneetvoet geplaatst totdat deze door de marker (paneel B) wordt aangegeven. Door vast te houden aan het centrale deel, zachte druk wordt toegepast op de buitenste ring om het centrale deel met behulp van de symmetrisch gerangschikt aangewezen breekpunten (paneel C) vrij te maken. Na de verwijdering, kan de monsterhouder worden ondergedompeld in vloeibare stikstof en overgebracht in standaard WERVELKOLOM flacons. Geplaatst, bijvoorbeeld, in pucks kunnen zij aan synchotron plaatsen worden vervoerd waar de geautomatiseerde steekproef-opzettende robots hen als regelmatige steekproeven (paneel D) erkennen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Details kristallisatie | |
| Methode | Hangende daling, de methode van de damp verspreiding |
| Type plaat | Superclear platen |
| Temperatuur (K) | 293 |
| Eiwitconcentratie (mg mL-1) | 15 |
| Samenstelling van reservoir oplossing | 50 mM RIA pH 4,7, 500 mM NaCl, 25% (w/v) PEG-6000 |
| Volume en verhouding van daling | 2 µ L totaal, 1:1 verhouding (proteïne: de alcoholische drank van de moeder |
| Volume van het reservoir | 500 µ L |
| Incubatietijd | 12 uur |
Tabel 1: experimentele Details van het beschreven kristallisatie experiment.
| Verzamelen en verwerken van gegevens | |
| Golflengte (Å) | 0,89429 |
| Temperatuur (K) | 293 |
| Detector | Rayonix MX225 CCD |
| De afstand van de kristal-detector (mm) | 120 |
| Rotatie bereik per beeld (°) | 0,5 |
| Totaal rotatie bereik (°) | 120 |
| Belichtingstijd per beeld (en) | 5 |
| Ruimtegroep | P43212 |
| Eenheid-cel parameters (Å) | a = 79,01, b = 79,01, c = 37,95 |
| Mosacity (°) | 0,07 |
| Resolutie bereik (Å) | 39,50-1,35 (1,37-1,35) |
| Totaal aantal reflecties | 191940 (8932) |
| Aantal unieke reflecties | 27020 (1292) |
| Volledigheid (%) | 99,88 (99,20) |
| Veelheid | 7,1 (6,9) |
| Gemiddelde I/σ (I) | 15,0 (1,9) |
| Rmeas35 (%) | 6,3 (107,0) |
| Rpim36 (%) | 2,4 (40,4) |
| CC1/237 | 99,9 (68,5) |
| ISa38 | 16,1 |
| De B-factor van Wilson (Å2) | 17,0 |
Tabel 2: verzameling van diffractie gegevens en verwerking van statistieken.
Discussion
Geschiktheid voor kristallisatie experimenten. De nieuwe monster houders kunnen worden gebruikt voor standaard opknoping druppel kristallisatie experimenten met behulp van 24-goed Linbro type platen (types 1 en 2), of 24-goed SBS footprint platen waarin elk goed heeft een diameter van 18 mm (type 3). Ze kunnen worden gebruikt in plaats van de standaard Microscoop cover slips. De amorfe COC folie zorgt voor de luchtdichtheid van het systeem. De controle van het kristallisatie experiment is mogelijk met behulp van een transmissie lichtmicroscoop, vanwege het gebruik van hoge duidelijkheid folies. Om het beste van onze kennis, geen andere monster houders bestaan voor 24-goed kristallisatie platen, die het mogelijk maken kristal manipulatie of diffractie-experimenten, zonder mechanisch verwijderen van het kristal uit de druppel, waarin het wordt geteeld. Dit is van bijzonder belang, aangezien vele onderzoekers op het gebied nog op dergelijke platen voor de optimalisering van het kristal baseren, wegens het feit dat de grotere dalings volumes kunnen worden gebruikt in vergelijking met 96-goed het zitten-dalings platen. Met deze grotere dalings volumes, kunnen de grotere kristallen worden verkregen.
Geschiktheid voor kristal manipulatie. Door de zelf-helende eigenschappen van de buitenste COC folie en de microporeuze structuur van de binnenste gele polyimide folie, de kristal omgeving is toegankelijk en de kristallen kunnen worden gemanipuleerd zonder mechanisch overbrengen naar andere containers. Dit maakt de monster houders erg handig. Het enige andere systeem dat wij kennen, dat deze indirecte en zachte toegang tot het kristal toestaat, is het CrystalDirect systeem26. Echter, CrystalDirect is minder flexibel omdat speciale 96-goed kristallisatie platen moeten worden gebruikt. De folie, waarop de kristallen groeien, is het zelfde dat het kristallisatie experiment verzegelt en het niet zelf-helend is. Dit betekent dat een diafragma dat is doordrongen in de folie door laser ablatie voor ligand of Cryo-bescherming levering aan de kristallen zal blijven open, het verhogen van de kans op vloeibare verdamping. Dit is in tegenstelling tot ons ontwerp, waar kristallen niet direct worden blootgesteld aan het milieu, zelfs als het COC folie wordt doorboord een aantal keer.
Geschiktheid voor in situ diffractie experimenten bij omgevingstemperatuur. De monsterhouder kan worden verwijderd uit de kristallisatie plaat in een rechttoe rechtaan manier, geplakt op een magnetische basis en zet op een Dubble goniometer. Voor een diffractie experiment bij kamertemperatuur, is het raadzaam om het monster te zetten in een luchtstroom van gedefinieerde vochtigheid33. De moeder drank rond het kristal kan worden verwijderd voorafgaand aan het zetten van de monsterhouder op de goniometer om de achtergrond verstrooiing te verminderen. Een dergelijke set-up is stabiel voor uren.
Geschiktheid van het gebruikte materiaal voor gebruik en opslag op 100 K. Noch het materiaal dat wordt gebruikt voor de productie van de monsterhouder, noch de polyimide film worden negatief beïnvloed door ze af te koelen tot lage temperaturen34. Vandaar dat het werken met de monsterhouder bij lage temperatuur (bijv. 100 K) geen ernstig probleem opleveren.
Geschiktheid voor in situ diffractie experimenten op 100 K. Voor het verzamelen van gegevens op 100 K in een stikstofstroom, de monsterhouder moet worden verwijderd uit de kristallisatie plaat als in de vorige paragraaf, geplakt op een magnetische basis en in een gasvormige stikstofstroom op 100 K op een Dubble goniometer. Indien gewenst, kan het monster ook worden Cryo-beschermd, hoewel het waarschijnlijk is dat voor naakte monsters kan dit niet nodig zijn in de meeste gevallen31. Voor experimenten op 100 K, de monster houders type 2 en 3 zijn beter geschikt, omdat de buitenste kunststof ring kan worden verwijderd. Vandaar, ze zijn van kleinere omvang en moet daarom minder gevoelig voor glazuur. Er mag echter ook een monsterhouder van type 1 worden gebruikt. Gezien een niet al te hoge luchtvochtigheid in de experimentele hok en een goed uitgelijnd Cryo-systeem poeder van de houder is niet echt een probleem.
Beperkingen. De geometrie van de monsterhouder maakt een onbelemmerde diffractie gegevensverzameling mogelijk door de rotatie methode over een totaal rotatie bereik van 160 °. Dit is voldoende zodat complete diffractie datasets kunnen worden verkregen voor de meeste kristalsystemen. In gevallen waarin dit niet mogelijk is, moeten gegevens van meer dan Crystal samen worden samengevoegd. Wanneer de kristallen samen worden gekweekt, kan het mogelijk zijn om de grootte van de inherente röntgenstraal aan te passen zodat slechts de delen van individuele kristallen worden blootgesteld. In extreme gevallen, kan men nodig hebben om een beroep te doen op een dataverzameling strategie vergelijkbaar met de MeshAndCollect aanpak35. Samengevat, terwijl er bepaalde beperkingen verbonden aan de steekproef houders zijn, kunnen deze in de meeste gevallen worden overwonnen. Natuurlijk is het altijd mogelijk dat er situaties worden aangetroffen, waarbij niets van dit alles mogelijk is. In dergelijke gevallen kan men nodig hebben om toevlucht te nemen tot andere kristal montage methoden.
Wij hebben een nieuw type van steekproef houder voor macromoleculaire kristallografie beschreven en wij hebben de geschiktheid van de steekproef houders voor diverse toepassingen aangetoond. Rekening houdend met de eenvoudige en reproduceerbare behandeling van eiwitkristallen, evenals de unieke eigenschappen van de monster houders, zijn wij van mening dat deze monster houders zal blijken te zijn een waardevolle aanvulling op het arsenaal van monster houders voor macromoleculaire Kristallografie.
Disclosures
Octrooiaanvragen met betrekking tot de gerapporteerde monsterhouder zijn ingediend door Helmholtz-Zentrum Berlin met de volgende registratienummers en registratiedata met de Duitse octrooi-en Merkenbureau: DE 10 2018 129 125,6, registratiedatum 20 november th, 2018; DE 10 2018 125 129,7, registratiedatum 11th, 2018; DE 10 2017 129 761,8, registratiedatum 13th, 2017. Een daaropvolgende internationale octrooiaanvraag via de PCT route, met behulp van de prioriteit van DE 10 2017 129 761,8 is ingediend, PCT/de2018/101007. Een registratie van een gebruiksmodel met het nummer DE 20 2018 106 955,1 werd ingediend op 6 decemberth, 2018. De monsterhouder is commercieel beschikbaar gesteld onder de handelsnamen XtalTool en XtalTool/HT door Jena Bioscience, Jena, Duitsland.
Acknowledgments
De auteurs willen BESSy II bedanken, geëxploiteerd door Helmholtz-Zentrum Berlijn voor Beam time toegang en ondersteuning, en de afdelingen van het monster milieu en technisch ontwerp voor hun hulp bij het ontwerp en de bouw en de toegang tot de 3D-printer faciliteiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
| Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
| COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
| ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
| Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 - 2.5 µL volume |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
| Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
| GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 - 20 µL), manufacturer reference number |
| Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
| Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
| Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
| Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
| SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
| UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
| VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
| XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
| XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
| XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |
References
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
- Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
- Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
- Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
- Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
- Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
- Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
- Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
- Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
- Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
- Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
- Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
- Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
- Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
- Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
- Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
- Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
- Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
- Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
- McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
- Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).
