एक उपयुक्त हैंडलिंग प्रोटोकॉल के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक उपन्यास नमूना धारक प्रस्तुत किया जाता है। प्रणाली क्रिस्टल विकास, क्रिस्टल भिगोने और दोनों पर situ विवर्तन डेटा संग्रह में किसी भी क्रिस्टल हेरफेर या बढ़ते की आवश्यकता के बिना परिवेश और क्रायोजेनिक तापमान की अनुमति देता है।
मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी (एमएक्स) जैविक मैक्रो अणुओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन तीन आयामी ज्ञान प्राप्त करने के लिए सबसे प्रमुख तरीका है। विधि के लिए एक पूर्वावश्यकता यह है कि उच्च क्रमित क्रिस्टलीय नमूना का अध्ययन करने के लिए स्थूल अणु से उगाए जाने की आवश्यकता होती है, जिसे तब विवर्तन प्रयोग के लिए तैयार करने की आवश्यकता होती है। इस तैयारी की प्रक्रिया आम तौर पर समाधान से क्रिस्टल को हटाने शामिल है, जिसमें यह हो गया था, लिगेंड समाधान या क्रायो-सुरक्षित समाधान में क्रिस्टल के भिगोने और फिर प्रयोग के लिए उपयुक्त एक माउंट पर क्रिस्टल immobilizing. इस प्रक्रिया के लिए एक गंभीर समस्या यह है कि मैक्रोआण्विक क्रिस्टल अक्सर यंत्रवत् अस्थिर और बल्कि नाजुक होते हैं। नतीजतन, इस तरह के नाजुक क्रिस्टल की हैंडलिंग आसानी से एक संरचना निर्धारण प्रयास में एक बाधा बन सकता है। ऐसे नाजुक क्रिस्टलों पर लागू किया गया कोई भी यांत्रिक बल अणुओं की नियमित पैकिंग को परेशान कर सकता है और क्रिस्टल ोंके विवर्तन की शक्ति का नुकसान हो सकता है। यहाँ, हम एक उपन्यास सभी में एक नमूना धारक है, जो क्रिस्टल की हैंडलिंग चरणों को कम करने के लिए विकसित किया गया है और इसलिए संरचना निर्धारण प्रयोग की सफलता की दर को अधिकतम करने के लिए प्रस्तुत करते हैं. नमूना धारक आमतौर पर इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप कवर पर्चियों की जगह क्रिस्टल बूंदों की स्थापना का समर्थन करता है। इसके अलावा, यह क्रिस्टल गुहा के किसी भी उद्घाटन के बिना और क्रिस्टल हैंडलिंग के बिना लिगन्ड भिगोने, क्रायो-संरक्षण और जटिल गठन जैसे इन-प्लेस क्रिस्टल मैनीपुलेशन की अनुमति देता है। अंत में, नमूना धारक दोनों, परिवेश और क्रायोजेनिक तापमान पर situ एक्स-रे विवर्तन डेटा के संग्रह को सक्षम करने के लिए डिजाइन किया गया है। इस नमूना धारक का उपयोग करके, क्रिस्टलीकरण से विवर्तन डेटा संग्रह करने के लिए अपने रास्ते पर क्रिस्टल को नुकसान करने की संभावना काफी कम कर रहे हैं के बाद से प्रत्यक्ष क्रिस्टल हैंडलिंग अब आवश्यक है.
जैविक स्थूल अणुओं की त्रि-आयामी संरचना का ज्ञान सभी बुनियादी जैविक, जैव रासायनिक और जैव-चिकित्सा अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण आधारशिला है। यह भी इस तरह के अनुसंधान के कुछ translational पहलुओं तक फैली हुई है, उदाहरण के लिए दवा की खोज के रूप में. परमाणु संकल्प एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी पर इस तरह के तीन आयामी जानकारी प्राप्त करने के लिए सभी तरीकों में सबसे शक्तिशाली और सबसे प्रमुख एक के रूप में तथ्य यह है कि सभी उपलब्ध संरचनात्मक जानकारी का 90% एक्स-रे द्वारा योगदान दिया है द्वारा सबूत है क्रिस्टलोग्राफी1| एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी की प्रमुख पूर्वावश्यकता, जो एक ही समय में इसकी प्रमुख सीमा है, यह है कि विवर्तन-गुणवत्ता क्रिस्टलों का उत्पादन करना होता है और विवर्तन प्रयोग के लिए तैयार किया जाता है। यह चरण अभी भी विधि की प्रमुख बाधाओं में से एक है।
ऐतिहासिक रूप से, प्रोटीन क्रिस्टल से विवर्तन डेटा परिवेश के तापमान पर एकत्र किए गए थे। व्यक्तिगत क्रिस्टल ध्यान से डेटा संग्रह से पहले कांच या क्वार्ट्ज केशिकाओं में स्थानांतरित कर रहे थे, माँ शराब केशिकाओं में जोड़ा गया था ताकि क्रिस्टल बाहर सूख नहीं होगा और केशिकाओं2,3सील कर दिया गया 4. 1980 के दशक के बाद से, यह अधिक से अधिक स्पष्ट हो गया है कि एक्स विकिरण के ionizing गुणों और मैक्रोआण्विक क्रिस्टल के आसन्न विकिरण संवेदनशीलता के कारण, परिवेश के तापमान पर डेटा संग्रह विधि पर गंभीर सीमाओं बन गया. परिणामस्वरूप, मैक्रोआण्विक क्रिस्टलों को 100 ज्ञ तक ठंडा करके तथा इतने कम तापमान5,6पर विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए विकिरण क्षति के प्रभावों को कम करने के लिए दृष्टिकोण विकसित किए गए। कम तापमान पर काम करने के लिए, गर्मी हस्तांतरण की कम दर के कारण केशिकाओं में नमूनों का बढ़ते अव्यावहारिक हो गया। इसके बावजूद, कम तापमान विवर्तन कार्य7,8, के लिए विशेष रूप से काउंटर-डिफ्यूजन क्रिस्टलीकरण प्रयोगों से केशिकाओं का उपयोग करने के लिए भी चल रहे प्रयास चल रहे हैं, लेकिन, इसके बावजूद, यह मानक बन गया स्थूल अणुक क्रिस्टलोग्राफी में एक पतली वायर्ड लूप9,10के अंदर मां शराब की पतली फिल्म द्वारा धारित स्थूल आण्विक क्रिस्टलों को माउंट करने के लिए दृष्टिकोण . हालांकि सुधार की एक संख्या (जैसे, लिथोग्राफिक छोरों और इसी तरह की संरचनाओं की शुरूआत11)इस पाश आधारित बढ़ते करने के लिए समय के साथ किया गया है, बुनियादी सिद्धांतों है कि 1990 के दशक के शुरू में विकसित किए गए थे आज भी उपयोग में हैं. यह सुरक्षित रूप से कहा जा सकता है कि स्थूल आण्विक क्रिस्टलों पर अधिकांश विवर्तन डेटा संग्रह आजकल अभी भी इस दृष्टिकोण 5 पर निर्भर करते हैं .
समय के साथ, वहाँ कुछ दिलचस्प नए घटनाक्रम और पाश आधारित बढ़ते विधि के संशोधन थे, लेकिन इन दृष्टिकोण अभी तक व्यापक रूप से समुदाय में अपनाया नहीं गया है. एक क्रिस्टल का तथाकथित लूप-कम माउंटिंग है, जिसे निम्न पृष्ठभूमि प्रकीर्णन12,13,14प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था। एक और एक क्रिस्टलीय नमूने लपेटो करने के लिए और उन्हें बाहर सुखाने से बचाने के लिए ग्राफीन म्यान का उपयोग है। ग्राफीन अपनी बहुत कम एक्स-रे प्रकीर्णन पृष्ठभूमि15के कारण इस संबंध में एक अच्छी तरह से अनुकूल सामग्री है।
हाल ही में, नमूना mounts के क्षेत्र में विकास मुख्य रूप से इस तरह के उदाहरण के लिए के रूप में एक से अधिक नमूना17पकड़ कर सकते हैं, जो नमूना थ्रूपुट16 बढ़ाने के उद्देश्य से या mounts डिजाइन करने के उद्देश्य से mounts के मानकीकरण पर ध्यान केंद्रित किया गया सिलिकॉन फ्रेम पर पैटर्न वाली झिल्ली, जो ज्यादातर सीरियल क्रिस्टलोग्राफी18,19,20,21,22के क्षेत्र में सैकड़ों छोटे क्रिस्टल धारण करने में सक्षम हैं .
अब तक चर्चा नमूना बढ़ते तरीकों के सभी अभी भी मैनुअल हस्तक्षेप के कुछ डिग्री की आवश्यकता है, जिसका अर्थ है कि नमूने के लिए यांत्रिक क्षति के कारण का एक अंतर्निहित खतरा है. इसलिए, नमूना वातावरण को इंजीनियरिंग द्वारा नए दृष्टिकोणों की मांग की जा रही है ताकि क्रिस्टल के विवर्तन डेटा को उनके विकास वातावरण में एकत्र किया जा सके। ऐसी ही एक विधि को सिटू या प्लेट-स्क्रीनिंग23,24 में कहा जाता है और इसे विश्व भर में25विभिन्न सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर मैक्रोआण्विक क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन्स की संख्या में पहले से ही कार्यान्वित किया जा चुका है . हालांकि, इस विधि का उपयोग क्रिस्टल प्लेट के ज्यामितीय मापदंडों और साधन के नमूना बिंदु के आसपास उपलब्ध स्थान द्वारा सीमित है।
अभी तक एक और दृष्टिकोण तथाकथित CrystalDirect प्रणाली26में महसूस किया है. यहाँ, पूरे क्रिस्टलीकरण बूँदें स्वचालित रूप से काटा जाता है. पन्नी जिस पर क्रिस्टल उगाया गया है कस्टम काट रहे हैं एक लेजर का उपयोग कर और सीधे नमूना धारक के रूप में इस्तेमाल किया27.
यहाँ वर्णित काम में, उद्देश्य एक नमूना धारक है, जो एक उपयोगकर्ता इसे छूने के बिना डेटा संग्रह डिवाइस के लिए अपने विकास कक्ष से क्रिस्टलीय नमूना स्थानांतरित करने की अनुमति होगी विकसित करने के लिए किया गया था और जो उपयोगकर्ता आसानी से नमूना हेरफेर करने के लिए सक्षम होगा. चूंकि मैक्रोआण्विक क्रिस्टलोग्राफी के क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं अभी भी बड़े स्क्रीनिंग अभियानों में पहचान की शर्तों को संशोधित करके क्रिस्टल विकास के अनुकूलन के लिए 24 अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्रारूप का उपयोग कर रहे हैं, नए नमूना धारक के लिए डिजाइन किया गया था इस स्वरूप के साथ संगत. निम्नलिखित में, नए नमूना धारक के डिजाइन का वर्णन किया जाएगा और हैंडलिंग और situ डेटा संग्रह और लिगन्ड भिगोने के लिए नमूना धारक के प्रदर्शन का प्रदर्शन किया जाएगा. अंत में, इस नए नमूना धारक की उपयुक्तता के साथ-साथ विभिन्न कार्य चरणों के लिए इसकी सीमाओं पर चर्चा की जाएगी।
क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए उपयुक्तता. नए नमूना धारकों मानक फांसी ड्रॉप क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या तो 24-अच्छी तरह Linbro प्रकार प्लेटें (प्रकार 1 और 2), या 24 अच्छी तरह से एसबीएस पदचिह्न प्लेटें जिसमें प्रत्येक अच्छी तरह से 18 मिमी का एक व्यास है का उपयोग कर (प्रकार 3). वे मानक माइक्रोस्कोप कवर पर्चियों के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है. अक्रिस्टलीय सीओसी पन्नी प्रणाली की वायु-जलता सुनिश्चित करती है। क्रिस्टलीकरण प्रयोग की निगरानी एक संचरण प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर संभव है, क्योंकि उच्च स्पष्टता पन्नी के उपयोग की. हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, कोई अन्य नमूना धारकों के लिए मौजूद 24 अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेटें, जो क्रिस्टल हेरफेर या विवर्तन प्रयोगों की अनुमति होगी, यंत्रवत् ड्रॉप से क्रिस्टल को हटाने के बिना, जिसमें यह हो जाता है. यह विशेष महत्व का है, के बाद से क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं अभी भी क्रिस्टल अनुकूलन के लिए ऐसी प्लेटों पर भरोसा करते हैं, तथ्य यह है कि बड़ी बूंद मात्रा 96 अच्छी तरह से बैठे ड्रॉप प्लेटों की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है के कारण. इन बड़ी बूंद मात्रा के साथ, बड़ा क्रिस्टल प्राप्त किया जा सकता है.
क्रिस्टल हेरफेर के लिए उपयुक्तता| बाहरी सीओसी पन्नी के आत्म-उपचार गुणों और आंतरिक पीले पॉलीमाइड पन्नी की सूक्ष्म संरचना के कारण, क्रिस्टल पर्यावरण सुलभ है और क्रिस्टल को यंत्रवत् रूप से अन्य कंटेनरों में स्थानांतरित किए बिना हेरफेर किया जा सकता है। यह नमूना धारकों बहुत सुविधाजनक बनाता है. केवल अन्य प्रणाली हम जानते हैं, जो क्रिस्टल के लिए इस अप्रत्यक्ष और कोमल उपयोग की अनुमति देता है, CrystalDirect प्रणाली26है. हालांकि, CrystalDirect कम लचीला है के बाद से विशेष 96 अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेटों का इस्तेमाल किया जाना है. पन्नी, जिस पर क्रिस्टल बढ़ रहे हैं, वही है जो क्रिस्टलीकरण प्रयोग को सील करता है और यह स्वयं को चंगा नहीं करता है। इसका मतलब यह है कि एक एपर्चर है कि ligand या क्रिस्टल के लिए क्रायो-सुरक्षित वितरण के लिए लेजर ablation द्वारा पन्नी में छेदा गया है खुला रहेगा, तरल वाष्पीकरण के लिए मौका बढ़ रही है. यह हमारे डिजाइन के विपरीत है, जहां क्रिस्टल सीधे पर्यावरण को उजागर नहीं किया जाएगा, भले ही सीओसी पन्नी कई बार छेदा जाता है।
परिवेश के तापमान पर स्थिति विवर्तन प्रयोगों के लिए उपयुक्तता। नमूना धारक एक सीधे आगे तरीके से क्रिस्टलीकरण प्लेट से हटाया जा सकता है, एक चुंबकीय आधार पर अटक गया और एक बीमलाइन गोनियोमीटर पर डाल दिया. कमरे के तापमान पर विवर्तन प्रयोग के लिए, नमूने को परिभाषित आर्द्रता33की वायु धारा में रखने की सलाह दी जाती है। क्रिस्टल के आसपास माँ शराब क्रम में पृष्ठभूमि प्रकीर्णन को कम करने के लिए goniometer पर नमूना धारक डालने से पहले हटाया जा सकता है. इस तरह के एक सेट अप घंटे के लिए स्थिर है.
100 K पर प्रचालन और भंडारण के लिए प्रयुक्त सामग्री की उपयुक्तता। न तो नमूना धारक के उत्पादन के लिए प्रयुक्त सामग्री और न ही पॉलीमिडफिल्म उन्हें कम तापमान34तक ठंडा करके प्रतिकूल रूप से प्रभावित होती है . इसलिए, कम तापमान पर नमूना धारक के साथ काम करना (उदा., 100 K) गंभीर समस्या नहीं पैदा करता है।
100 K पर सीटू विवर्तन प्रयोगों के लिए उपयुक्तता| एक नाइट्रोजन धारा में 100 K पर डेटा संग्रह के लिए, नमूना धारक पिछले पैरा ग्राफ में के रूप में क्रिस्टलीकरण प्लेट से हटादिया जा करने की जरूरत है, एक चुंबकीय आधार पर अटक गया और एक beamline goniometer पर 100 K पर एक गैसीय नाइट्रोजन धारा में डाल दिया. यदि वांछित, नमूना भी cryo-सुरक्षित हो सकता है, हालांकि यह संभावना है कि नग्न नमूनों के लिए यह ज्यादातर मामलों में आवश्यक नहीं हो सकताहै 31. 100 K पर प्रयोगों के लिए, नमूना धारकों प्रकार 2 और 3 बेहतर अनुकूल हैं क्योंकि बाहरी प्लास्टिक की अंगूठी हटाया जा सकता है. इसलिए, वे छोटे आकार के होते हैं और इसलिए टुकड़े करने के लिए कम प्रवण होना चाहिए। हालांकि, यहां तक कि प्रकार 1 का एक नमूना धारक इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रयोगात्मक हच में एक बहुत अधिक नमी और धारक के एक ठीक से गठबंधन क्रायो-प्रणाली टुकड़े को देखते हुए वास्तव में एक समस्या नहीं है।
सीमाएं. नमूना धारक की ज्यामिति 160 डिग्री की कुल रोटेशन रेंज पर रोटेशन विधि द्वारा unobstructed विवर्तन डेटा संग्रह की अनुमति देता है। यह पर्याप्त है ताकि अधिकांश क्रिस्टल प्रणालियों के लिए पूर्ण विवर्तन डेटा सेट प्राप्त किए जा सकें। मामलों में जहां यह संभव नहीं है, क्रिस्टल से अधिक से डेटा एक साथ विलय करने की आवश्यकता है। जब क्रिस्टल एक साथ बड़े हो रहे हैं, यह घटना एक्स-रे बीम के आकार को समायोजित करने के लिए इतना है कि व्यक्तिगत क्रिस्टल के केवल भागों को उजागर कर रहे हैं संभव हो सकता है। चरम मामलों में, एक MeshAndCollect दृष्टिकोण35के समान एक डेटा संग्रह रणनीति का सहारा लेने की आवश्यकता हो सकती है. सारांश में, जबकि वहाँ कुछ सीमाओं नमूना धारकों के साथ जुड़े रहे हैं, इन ज्यादातर मामलों में दूर किया जा सकता है. बेशक, यह हमेशा संभव है कि स्थितियों का सामना कर रहे हैं, जिसमें इस में से कोई भी संभव है. ऐसे मामलों में, एक अन्य क्रिस्टल बढ़ते तरीकों का सहारा लेने की आवश्यकता हो सकती है.
हमने स्थूल अणुक क्रिस्टलविज्ञान के लिए एक नवीन प्रकार के नमूना धारक का वर्णन किया है और हमने विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए नमूना धारकों की उपयुक्तता का प्रदर्शन किया है। प्रोटीन क्रिस्टल, साथ ही नमूना धारकों के अद्वितीय गुणों के सरल और reproduible हैंडलिंग को ध्यान में रखते हुए, हम इन नमूना धारकों मैक्रोआण्विक के लिए नमूना धारकों के शस्त्रागार के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त साबित होगा कि विश्वास करते हैं क्रि.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों BESY द्वितीय, बीम समय का उपयोग और समर्थन के लिए helmholtz-जेन्ट्रम बर्लिन द्वारा संचालित शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और नमूना पर्यावरण और तकनीकी डिजाइन के विभागों डिजाइन और निर्माण और 3 डी-प्रिंटर सुविधाओं के लिए उपयोग के साथ उनकी मदद के लिए.
AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 – 2.5 µL volume |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number |
Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |