En ny prov hållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi tillsammans med ett lämpligt hanterings protokoll presenteras. Systemet tillåter kristall tillväxt, kristall blöt läggning och in situ diffraktion data insamling på både, omgivande och kryogena temperatur utan behov av någon kristall manipulation eller montering.
Makro molekyl ära röntgenkristallografi (MX) är den mest framträdande metoden för att erhålla hög upplöst tredimensionell kunskap om biologiska makro molekyler. En förutsättning för metoden är att högt beställt kristallint prov måste odlas från den makro molekyl som ska studeras, som sedan måste förberedas för diffraktions försöket. Detta förberedelse förfarande innebär typiskt avlägsnande av kristallen från lösningen, där den odlades, blöt läggning av kristallen i ligand lösning eller Cryo-Protectant lösning och sedan immobilisera kristallen på ett fäste som lämpar sig för experimentet. Ett allvarligt problem för detta förfarande är att makro molekyl ära kristaller ofta är mekaniskt instabila och ganska bräckliga. Följaktligen kan hanteringen av sådana ömtåliga kristaller lätt bli en Flask hals i ett struktur bestämnings försök. Varje mekanisk kraft appliceras på sådana ömtåliga kristaller kan störa den vanliga packning av molekylerna och kan leda till en förlust av diffraktion makt kristaller. Här presenterar vi en ny allt-i-ett prov hållare, som har utvecklats för att minimera hanteringen steg av kristaller och därmed maximera framgången för strukturen beslutsamhet experiment. Prov hållaren stöder inställning av kristall droppar genom att ersätta de ofta använda Mikroskop täckglasen. Vidare tillåter det på plats kristall manipulation såsom ligand blöt läggning, Cryo-skydd och komplex bildning utan någon öppning av kristallisation hålighet och utan kristall hantering. Slutligen har prov hållaren utformats för att möjliggöra insamling av in situ-röntgen diffraktions data vid både omgivnings-och kryogena temperaturer. Genom att använda denna prov hållare, chanserna att skada kristallen på väg från kristallisation till diffraktion data insamling reduceras avsevärt eftersom direkt kristall hantering inte längre behövs.
Kunskapen om den tredimensionella strukturen hos biologiska makro molekyler utgör en viktig hörnsten i alla grundläggande biologiska, biokemiska och biomedicinska undersökningar. Detta omfattar även vissa translationella aspekter av sådan forskning, såsom till exempel läkemedels upptäckt. Bland alla metoder för att erhålla sådan tredimensionell information vid atomär upplösning är röntgenkristallografi den mest kraftfulla och mest framträdande som bevisas av det faktum att 90% av all tillgänglig strukturell information bidrar med röntgen Kristallografi1. Den stora förutsättningen för röntgenkristallografi, som samtidigt är dess stora begränsning, är att kristaller av diffraktions kvalitet måste framställas och förberedas för diffraktions experimentet. Detta steg utgör fortfarande en av de största Flask halsarna i metoden.
Historiskt sett samlades diffraktions data från protein kristaller vid rums temperatur. Enskilda kristaller var omsorgsfullt överföras till glas eller kvarts kapillärer före data insamling, mor sprit lades till kapillärerna så att kristallerna inte skulle torka ut och kapillärerna var förseglade2,3, med 4. Sedan 1980-talet blev det mer och mer uppenbart att på grund av röntgenstrålningens joniseringsegenskaper och den förestående strålnings känsligheten hos makro molekyl ära kristaller utgör data insamlingen vid omgivnings temperatur stränga begränsningar för metoden. Därför utvecklades metoder för att mildra effekterna av strålnings skador genom kylning av makro molekyl ära kristaller ner till 100 K och för att samla in diffraktions data vid en sådan låg temperatur på5,6. För att arbeta vid låga temperaturer, montering av proverna i kapillärer blev opraktiskt på grund av den låga värme överföring. Trots detta finns det pågående insatser för att också använda kapillärer, särskilt från Counter-diffusion kristalliserings experiment, för låg temperatur diffraktion arbete7,8, men oavsett det, det blev standard metod i Makromolekylär kristallografi för att montera Makro molekyl ära kristaller som innehas av en tunn film av Moder sprit inuti en tunn tråd slinga9,10. Även om ett antal förbättringar (t. ex. införandet av litografiska slingor och liknande strukturer11) har gjorts över tid till denna loop-baserade montering, är de grundläggande principer som utvecklades i början av 1990-talet fortfarande i bruk idag. Det kan säkert anges att de flesta diffraktion data samlingar på makro molekyl ära kristaller nuförtiden fortfarande förlita sig på denna metod5.
Med tiden fanns det en del intressanta nya utvecklingar och modifieringar av den loopbaserade monterings metoden, men dessa tillvägagångs sätt har hittills inte varit allmänt antagna i samhället. En är den so-called kretsa-mindre monteringen av kristaller, som framkallades för att uppnå lägre bakgrundscattering12,13,14. En annan är användningen av grafensheaths att linda de kristalliska proverna och för att skydda dem från uttorkning. Grafen är ett väl lämpat material i det avseendet på grund av dess mycket låga X-ray spridnings bakgrund15.
På senare tid har utvecklingen på området för prov fästen främst inriktats på att standardisera monteringar i syfte att öka prov kapaciteten16 eller på att designa fästen, som kan rymma mer än ett prov17, till exempel mönstrade membran på en kisel ram, som kan hålla hundratals små kristaller främst inom serie kristallografi18,19,20,21,22.
Alla de prov monterings metoder som diskuterades hittills kräver en viss grad av manuell intervention, vilket innebär att det finns en inneboende risk för att orsaka mekaniska skador på provet. Därför söks nya angrepps sätt genom att iscensätta prov miljön så att diffraktions data från kristaller kan samlas in i deras tillväxt miljö. En sådan metod kallas in situ eller plåt-screening23,24 och det är redan genomförts på ett antal makro molekyl ära kristallografi linjer på olika Synchrotron källor över hela världen25. Användningen av denna metod begränsas dock av kristall plåtarnas geometriska parametrar och det utrymme som finns runt instrumentets provtagnings punkt.
Ännu en metod realiseras i den så kallade CrystalDirect system26. Här skördas hela kristalliserings droppar automatiskt. Folier på vilka kristallerna har odlats är skräddarsydda med hjälp av en laser och används direkt som prov hållare27.
I det arbete som beskrivs här var syftet att utveckla en prov hållare, vilket skulle göra det möjligt för en användare att flytta det kristall klara provet från sin tillväxt kammare till data insamlings anordningen utan att röra vid den och som skulle göra det möjligt för användaren att enkelt manipulera provet. Eftersom många forskare inom Makromolekylär kristallografi fortfarande använder ett 24-väl kristalliserings format för att optimera kristall tillväxten genom att modifiera förhållanden som identifierats i stora screening kampanjer, utformades den nya prov hållaren för att kompatibelt med detta format. I det följande beskrivs utformningen av den nya prov hållaren, och prov innehavarens hantering och utförande för in situ-uppgiftsinsamling och ligand-blöt läggning kommer att påvisas. Slutligen kommer lämpligheten hos denna nya prov tagare och dess begränsningar för de olika arbets stegen att diskuteras.
Lämplighet för kristalliserings experiment. De nya prov hållarna kan användas för standard hängande fallkristalliserings experiment med hjälp av antingen 24-well Linbro typ plåtar (typ 1 och 2), eller 24-väl SBS fot avtryck plåtar där varje brunn har en diameter på 18 mm (Type 3). De kan användas i stället för de vanliga Mikroskop täckglasen. Den amorfa COC folie säkerställer luft täthet i systemet. Övervakningen av kristalliserings experiment är möjligt med hjälp av ett transmissions ljus Mikroskop, på grund av användning av hög klarhet folier. Såvitt vi vet finns det inga andra prov hållare för 24-väl kristalliserings plattor, vilket skulle möjliggöra kristall manipulation eller diffraktions experiment, utan att mekaniskt ta bort kristallen från den droppe där den odlas. Detta är av särskild betydelse, eftersom många forskare inom området fortfarande förlitar sig på sådana plattor för kristall optimering, på grund av det faktum att större Drop volymer kan användas jämfört med 96-well sittande-Drop tallrikar. Med dessa större Drop volymer, större kristaller kan erhållas.
Lämplighet för kristall manipulation. Tack vare de självläkande egenskaperna hos den yttre COC-folien och den mikroporösa strukturen hos den inre gula polyimidefolien är kristall miljön tillgänglig och kristallerna kan manipuleras utan att mekaniskt överföra dem till andra behållare. Detta gör att prov hållarna är mycket bekväma. Det enda andra systemet vi känner till, vilket gör att denna indirekta och skonsam till gång till kristallen, är CrystalDirect systemet26. Men CrystalDirect är mindre flexibelt eftersom speciella 96-och kristalliserings plattor måste användas. Folien, som kristallerna växer, är densamma som tätar kristalliserings experiment och det är inte självläkande. Detta innebär att en bländare som har genomborrat i folien genom laser ablation för ligand eller Cryo-Protectant leverans till kristallerna kommer att förbli öppen, vilket ökar chansen för flytande avdunstning. Detta är i motsats till vår design, där kristaller inte kommer att exponeras direkt för miljön även om COC folie blir genomborrade ett antal gånger.
Lämplighet för in situ diffraktions experiment vid omgivnings temperatur. Provet hållaren kan tas bort från kristallisation plattan i ett rakt framåt sätt, fastnat på en magnetisk bas och sätta på en beamline goniometer. För en diffraktion experiment vid rums temperatur, är det lämpligt att sätta provet i en luft ström av definierad fuktighet33. Mamman sprit runt kristallen kan avlägsnas innan du sätter prov hållaren på goniometer för att minska bakgrunds spridningen. En sådan uppsättning är stabil i timmar.
Lämpligheten av det använda materialet för drift och förvaring vid 100 K. Varken materialet som används vid tillverkningen av prov hållaren eller polyimid-filmen påverkas negativt av nedkylning till låga temperaturer34. Att arbeta med prov hållaren vid låg temperatur (t. ex. 100 K) utgör därför inget allvarligt problem.
Lämplighet för in situ diffraktions experiment vid 100 K. För data insamling vid 100 K i en kväve ström, måste prov hållaren avlägsnas från kristalliserings plattan som i föregående stycke, fast på en magnetisk bas och placeras i en gasformig kväve ström vid 100 K på en beamline goniometer. Om så önskas kan provet också vara kryoskyddat, även om det är troligt att det för nakna prover kanske inte är nödvändigt i de flesta fall31. För experiment på 100 K är prov hållarna typ 2 och 3 bättre lämpade eftersom den yttre plast ringen kan avlägsnas. Därför är de av mindre storlek och bör därmed vara mindre benägna att isbildning. Även en prov innehavare av typ 1 får dock användas. Med tanke på en inte alltför hög luft fuktighet i den experimentella kaninbur och en korrekt justerad Cryo-system isbildning av innehavaren är egentligen inte ett problem.
Begränsade begränsningar. Prov innehavarens geometri medger obehindrat insamling av diffraktions data med rotations metoden över ett totalt rotations område på 160 °. Detta är tillräckligt så att kompletta diffraktion data uppsättningar kan erhållas för de flesta kristall system. I fall där detta inte är möjligt måste data från mer än kristall slås samman. När kristaller odlas tillsammans, kan det vara möjligt att justera storleken på incidenten röntgen stråle så att endast delar av enskilda kristaller exponeras. I extrema fall kan man behöva tillgripa en data insamlings strategi som liknar MeshAndCollect-metoden35. Sammanfattnings vis, medan det finns vissa begränsningar i samband med urvalet innehavare, dessa kan övervinnas i de flesta fall. Naturligtvis är det alltid möjligt att situationer påträffas, där inget av detta är möjligt. I sådana fall kan man behöva tillgripa andra kristall monterings metoder.
Vi har beskrivit en ny typ av prov hållare för Makromolekylär kristallografi och vi har visat prov hållarnas lämplighet för olika tillämpningar. Med hänsyn till den enkla och reproducerbara hanteringen av protein kristaller, liksom de unika egenskaperna hos prov tagarna, anser vi att dessa prov hållare kommer att visa sig vara ett värdefullt komplement till den arsenal av prov hållare för makro molekyl ära Kristallografi.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka BESSY II, som drivs av Helmholtz-Zentrum Berlin för beam tid till gång och stöd, och avdelningarna för Sample miljö och teknisk design för deras hjälp med design och konstruktion och till gång till 3D-skrivare anläggningar.
AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 – 2.5 µL volume |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number |
Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |