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Developmental Biology

एथिल मिथेनसल्फोनेट म्यूटजेनेसिस द्वारा छोटे अनाज फसलों में जीनोम्स (TILLING) जनसंख्या में स्थानीय लेसेंस को लक्षित करने का विकास

Published: July 16, 2019 doi: 10.3791/59743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Plant Science and Landscape Architecture, University of Maryland, College Park

Summary

एथिल मेथेनसल्फोनेट (ईएमएस) को म्यूटेजन के रूप में उपयोग के साथ छोटी अनाज फसलों में लक्षित प्रेरित स्थानीय लेसेंस (TILLING) जनसंख्या विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। इसके अलावा प्रदान की Cel-1 परख का उपयोग उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल है.

Abstract

जीनोम्स में प्रेरित स्थानीय लेसेंस को लक्षित करना (TILLING) एक शक्तिशाली रिवर्स जेनेटिक्स उपकरण है जिसमें रासायनिक उत्परिवर्तन और लक्ष्य जीनों में अनुक्रम भिन्नता का पता लगाना शामिल है। TILLING जीन सत्यापन के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान कार्यात्मक जीनोमिक्स उपकरण है, विशेष रूप से छोटे अनाज में जिसमें परिवर्तन आधारित दृष्टिकोण गंभीर सीमाओं पकड़. एक मजबूत mutagenized आबादी का विकास एक TILLING आधारित जीन सत्यापन अध्ययन की दक्षता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक कम समग्र उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक TILLING आबादी इंगित करता है कि एक अव्यावहारिक बड़ी आबादी वांछित उत्परिवर्तनों को खोजने के लिए जांच की जानी चाहिए, जबकि एक उच्च mutagen एकाग्रता जनसंख्या में उच्च मृत्यु दर की ओर जाता है, एक अपर्याप्त करने के लिए अग्रणी mutagenized व्यक्तियों की संख्या. एक बार एक प्रभावी जनसंख्या विकसित की है, वहाँ ब्याज की एक जीन में उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, और मंच का चुनाव प्रयोगात्मक पैमाने और संसाधनों की उपलब्धता पर निर्भर करता है. उत्परिवर्ती पहचान के लिए Cel-1 परख और agarose जेल आधारित दृष्टिकोण सुविधाजनक है, reproduible, और एक कम संसाधन गहन मंच. यह फायदेमंद है कि यह सरल है, कोई गणना ज्ञान की आवश्यकता होती है, और यह बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों के साथ जीन की एक छोटी संख्या के सत्यापन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है. वर्तमान लेख में, वर्णित एक अच्छा TILLING आबादी के विकास के लिए तरीके हैं, खुराक वक्र की तैयारी सहित, mutagenesis और उत्परिवर्ती आबादी के रखरखाव, और पीसीआर आधारित Cel-1 परख का उपयोग उत्परिवर्ती आबादी की स्क्रीनिंग .

Introduction

जीनोम में प्वाइंट उत्परिवर्तन शोधकर्ताओं के लिए कई उपयोगी उद्देश्यों की सेवा कर सकते हैं। उनकी प्रकृति और स्थान के आधार पर, इन उत्परिवर्तनों जीन या ब्याज की प्रोटीन के भी अलग डोमेन के लिए कार्य आवंटित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दूसरी ओर, उपन्यास आनुवंशिक भिन्नता के एक स्रोत के रूप में, उपयोगी उत्परिवर्तनों phenotyping स्क्रीन का उपयोग कर वांछित लक्षण के लिए चुना जा सकता है और आगे फसल सुधार में इस्तेमाल किया. TILLING एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण है कि रासायनिक mutagenesis और लक्ष्य जीन में अनुक्रम भिन्नता का पता लगाने भी शामिल है. सबसे पहले अरिबिडोप्सिस1 और ड्रोसोफिलिया मेलेनोगैस्टर2में विकसित किया गया है , टिलिंग आबादी को विकसित किया गया है और कई छोटे अनाज फसलों जैसे हेक्सागुणित रोटी गेहूं (ट्राइटिकम एस्टिवम)3, जौ (होर्डमवल्गे )4, टेट्रापलॉयड ड्यूरम गेहूं (टी. डाइकोकोइड्स ड्यूरम)5, द्विगुणित गेहूं (टी मोनोकोकम)6 और "डी" जीनोम जनक गेहूं एगिलोप्स टौशीई7 . इन संसाधनों का उपयोग अजैविक और जैविक प्रतिबल सहिष्णुता8को विनियमित करने , फूलों केसमय9को विनियमित करने और पोषण से बेहतर फसल किस्मों के विकास में जीनों की भूमिका को सत्यापित करने के लिए किया गया है .

TILLING, इस तरह के एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस), सोडियम azide, एन-मेथिल-एन-नाइटोसौरिया (एमएनयू), और मिथाइल मीथेनसल्फोनेट (एमएमएस) के रूप में alkylating mutagenic एजेंटों के उपयोग के साथ, कई कारणों के लिए अन्य रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण ों पर लाभ है। सबसे पहले, mutagenesis व्यावहारिक रूप से किसी भी प्रजाति या पौधे की विविधता पर आयोजित किया जा सकताहै 10 और परिवर्तन बाधा है, जो छोटे अनाज11के मामले में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है से स्वतंत्र है. दूसरा, नॉकआउट उत्परिवर्तनों कि अन्य जीन सत्यापन दृष्टिकोण द्वारा प्राप्त किया जा सकता पैदा करने के अलावा, missense और splicing उत्परिवर्तनों की एक श्रृंखला प्रेरित किया जा सकता है, जो ब्याज12के प्रोटीन के व्यक्तिगत डोमेन के कार्यों को समझ सकते हैं. इसके अलावा, TILLING जीनोम भर में उत्परिवर्तनों का एक अमर संग्रह उत्पन्न करता है; इस प्रकार, एक एकल जनसंख्या एकाधिक जीनों के कार्यात्मक सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके विपरीत, अन्य रिवर्स जेनेटिक्स उपकरण केवल अध्ययन13के अधीन जीन के लिए विशिष्ट संसाधन उत्पन्न करते हैं। TILLING के माध्यम से पहचान े लिए गए उपयोगी उत्परिवर्तनों को प्रजनन उद्देश्यों के लिए तैनात किया जा सकता है और जीन संपादन के विपरीत विनियमन के अधीन नहीं हैं, जिनका गैर-ट्रांसजेनिक वर्गीकरण कई देशों में अभी भी अनिश्चित है। यह विशेष रूप से छोटे अनाजों के लिए प्रासंगिक हो जाता है जो अंतर्राष्ट्रीय स्तर पर14का व्यापार करते हैं .

TILLING एक सरल और कुशल जीन सत्यापन रणनीति है और ब्याज के जीन की जांच के लिए विकसित किया जा करने के लिए mutagenized आबादी की आवश्यकता है. एक प्रभावी mutagenized आबादी का विकास एक TILLING आधारित जीन सत्यापन अध्ययन की दक्षता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक कम समग्र उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक TILLING जनसंख्या इंगित करता है कि एक अव्यावहारिक बड़ी आबादी वांछित उत्परिवर्तनों के लिए जांच की जानी चाहिए, जबकि एक उच्च mutagen एकाग्रता जनसंख्या में उच्च मृत्यु दर और की एक अपर्याप्त संख्या की ओर जाता है mutagenized व्यक्तियों. एक बार एक अच्छी आबादी विकसित की है, वहाँ ब्याज के जीन में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, और मंच का चुनाव प्रयोगात्मक पैमाने और संसाधनों की उपलब्धता पर निर्भर करता है. संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण और बाह्य अनुक्रमण का प्रयोग पौधों में पौधों में सभी उत्परिवर्तनों को छोटे जीनोम ों के साथ15,16में बदलने के लिए किया गया है . दो टिलरिंग आबादी का एकोम अनुक्रमण रोटी और ड्यूरम गेहूं में किया गया है और वांछनीय उत्परिवर्तनों की पहचान करने और ब्याज की उत्परिवर्ती लाइनों के आदेश के लिए जनता के लिए उपलब्ध है17. यह वांछनीय उत्परिवर्तनों की उपलब्धता के संदर्भ में एक महान सार्वजनिक संसाधन है; हालांकि, जीन सत्यापन अध्ययन में, जंगली प्रकार लाइन ब्याज की उम्मीदवार जीन के अधिकारी होना चाहिए. दुर्भाग्य से, यह अभी भी एक और पृष्ठभूमि में कुछ उम्मीदवार जीन के रिवर्स आनुवंशिकी आधारित सत्यापन के लिए पूरे TILLING आबादी के exome अनुक्रम करने के लिए लागत-निरोधी है. Amplicon अनुक्रमण और Cel-1 आधारित परख गेहूं में लक्षित आबादी में उत्परिवर्तनों का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया है, और Cel-1 परख सरल कर रहे हैं, कोई कम्प्यूटेशनल ज्ञान की आवश्यकता होती है, और बुनियादी के साथ जीन की एक छोटी संख्या के सत्यापन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं प्रयोगशाला उपकरण6,18.

वर्तमान लेख में, वर्णित एक अच्छा TILLING आबादी के विकास के लिए तरीके हैं, खुराक वक्र की तैयारी सहित, mutagenesis और उत्परिवर्ती आबादी के रखरखाव, और पीसीआर आधारित Cel-1 परख का उपयोग उत्परिवर्ती आबादी की स्क्रीनिंग . इस प्रोटोकॉल को पहले से ही ट्राइटिकम एस्टिवमकी म्यूटेजेनीकृत आबादी के विकास और उपयोग में सफलतापूर्वक लागू किया गया है , ट्राइटिकम मोनोकोकम6, जौ , एजिलॉप्स टाउचीई7, और कई दूसरों. शामिल उपयोगी सुझाव है कि शोधकर्ताओं की आबादी को विकसित करने में मदद मिलेगी के साथ इन तरीकों का स्पष्ट विवरण कर रहे हैं, पसंद के किसी भी छोटे अनाज संयंत्र में एक mutagen के रूप में ईएमएस का उपयोग कर.

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Protocol

1. प्रभावी mutagenesis के लिए खुराक वक्र की तैयारी

  1. छह 250 एमएल कांच फ्लास्क (100 प्रत्येक फ्लास्क में) में ब्याज के जीनोटाइप के साथ 100 बीज भिगो दें जिसमें 50 एमएल आसुत जल होता है। बीज द्वारा आत्मसात करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 8 एच के लिए 100 आरपीएम पर हिलाएं।
  2. एक धूआं हुड में, 0.167, 0.249, 0.331, 0.415, और 0.498 एमएल ईएमएस के क्रमशः distiled पानी में भंग करके 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%, और 1.2% (w/v) एथिल मीथेन (ईएमएस) समाधान के 50 एमएल तैयार करते हैं।
    नोट: ईएमएस 1.206 g/mL के घनत्व के साथ आरटी पर तरल है।
    चेतावनी: ईएमएस से निपटने के दौरान उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (PPE) का उपयोग करें।
  3. पांच फ्लास्क से बाहर पानी decant और आत्मसात बीज युक्त प्रत्येक फ्लास्क में ईएमएस समाधान के 50 एमएल जोड़ें ताकि वहाँ 0.0%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%, और 1.2% ईएमएस समाधान के साथ छह अलग अलग उपचार कर रहे हैं. 75 आरपीएम और आरटी पर 16 एच के लिए फ्लास्क हिला।
  4. ईएमएस समाधान decant और पनीर कपड़े का उपयोग कर प्रत्येक उपचार के लिए अलग से इलाज के बीज इकट्ठा. 24 h के लिए ईएमएस-इनएक्टिविंग समाधान (0.1 M NaOH, 20% w/v Na2S2O3) का एक खंड जोड़कर उपयोग किए गए ईएमएस समाधान को निष्क्रिय करें। इसके अलावा 24 एच के लिए ईएमएस-इनएक्टिवेट समाधान के साथ दूषित फ्लास्क और पिपेट टिप्स का इलाज करें।
  5. 2 ज के लिए चल रहे नल के पानी के तहत ईएमएस उपचारित बीज धो लें प्रत्येक बीज को अलग-अलग रूट ट्रेनर्स में डाल कर मिट्टी युक्त करें।
  6. 16 ज प्रकाश अवधि के अंतर्गत 20-25 डिग्री सेल्सियस पर पौधों को उगाएं।
  7. प्रत्यारोपण के 15 दिनों के बाद संयंत्र अस्तित्व पर रिकॉर्ड डेटा। प्रत्येक उपचार के लिए जीवित रहने की दर की गणना करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
    Equation 1
    नोट: यदि अंकुरण दर नियंत्रण में 100% से कम है, तो नियंत्रण में अंकुरित होने में विफल रहे बीजों की संख्या घटाने के बाद सभी उपचारों में सटीक उत्तरजीविता दरों की गणना की जानी चाहिए। प्रभावी म्यूटजेनेसिस के लिए 40%-60% की उत्तरजीविता दर वांछनीय है। यह इलाज बीज के अस्तित्व के अनुसार एक संशोधित एकाग्रता के साथ खुराक अनुकूलन के दूसरे दौर प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हो सकता है जब तक की वांछनीय घातकता दर को प्राप्त करने तक 40%-60%.

2. Mutagenesis और उत्परिवर्ती आबादी के रखरखाव

  1. 300 एमएल आसुत पानी युक्त पांच 1,000 एमएल फ्लास्क में समान रूप से विभाजित कम से कम 3,000 बीजों के अंतिम बैच को भिगो दें। आत्मसात करने के लिए आरटी के तहत 100 आरपीएम पर 8 एच के लिए हिला।
    नोट: वांछनीय आबादी के अंतिम आकार उत्परिवर्तन आवृत्ति और जीनोटाइप के द्विगुणी स्तर पर निर्भर करेगा, लेकिन यह हेक्सागुणके लिए कम से कम 3,000 बीज का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है, tetraploids के लिए 4,000 बीज, और द्विगुणित के लिए 7,000 से अधिक बीज.
  2. एक धूआं हुड में, आसुत पानी में अनुकूलित ईएमएस एकाग्रता समाधान के 1,500 एमएल तैयार करते हैं।
  3. फ्लास्क से पानी को बाहर निकालें और 600 आत्मसात बीज युक्त प्रत्येक फ्लास्क में ईएमएस समाधान के इष्टतम एकाग्रता के 300 मिलीलीटर जोड़ें। 75 आरपीएम और आरटी पर 16 एच के लिए फ्लास्क हिलाओ।
  4. ईएमएस decant और पनीर कपड़े में इलाज बीज इकट्ठा. ईएमएस समाधान और उपचार कंटेनर ईएमएस-इनएक्टिविंग समाधान के साथ सक्रिय करें जैसा कि चरण 1.4 में किया गया है।
  5. 2 ज के लिए चल रहे नल के पानी के तहत ईएमएस का इलाज बीज धो लें प्रत्येक ईएमएस का इलाज एम1 बीज अलग-अलग रूट प्रशिक्षकों में।
  6. 16 ज प्रकाश अवधि के अंतर्गत 20-25 डिग्री सेल्सियस पर उ1 पादप (उ0 बीजों से व्युत्पन्न) उगाएं।
    नोट: यह 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 सप्ताह के लिए दो पत्ती चरण में अंकुर vernalize करने के लिए आवश्यक हो सकता है, अगर ब्याज के जीनोटाइप एक सर्दियों प्रकार के विकास की आदत है.
  7. एम1 पौधों को स्व-परागण करने दें, और प्रत्येक उपजाऊ एम1 पौधे के लिए एम2 बीजों को अलग से फसल दें।
    नोट: संभावित outcrossing की संभावना से बचने के लिए, anthesis से पहले परागण बैग के साथ एम1 पौधों के spikes को कवर.
  8. आनुवंशिक अतिरेक से बचने के लिए प्रत्येक एम1 पौधे से एक एम2 बीज लगाएं।
  9. एम2 पौधों से ऊतक को दो-लीफ चरण में 1.1 एमएल रैक्ड 96 अच्छी तरह से माइक्रोट्यूब के रूप में एकत्र करें। प्रत्येक संयंत्र से पत्ती ऊतक के लगभग 80 मिमी ले लीजिए और एक ऊतक संग्रह योजना में प्रत्येक नमूने की आईडी रिकॉर्ड.
  10. एक lyophilizer का उपयोग कर पत्ती ऊतक फ्रीज सूखी और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  11. 16 ज प्रकाश अवधि के अंतर्गत 20-25 डिग्री सेल्सियस पर उ 2 पादप बनाए रखें।
  12. नियमित अंतराल पर एम2 पौधों के उत्परिवर्ती phenotypes पर डेटा रिकॉर्ड. अपेक्षित फीनोटाइप एल्बिनो, क्लोरिना, घास का गोली, विभिन्न प्रकार के, आंशिक रूप से उपजाऊ, बाँझ, आदि हैं।
  13. एम2 पौधों को स्व-उर्वरित और परिपक्व होने दें। एम2 पौधों के एम 3 बीजों को अलग से फसल से बचाएं (चित्र 1)।
    नोट: एम बीज रिवर्स आनुवंशिकी अध्ययन में phenotype मान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है. इसलिए, एम ध्यान से सूचीबद्ध किया जाना चाहिए और शांत और शुष्क परिस्थितियों में संग्रहीत. वैकल्पिक रूप से, यदि बीज क्षेत्र में वृद्धि की जानी चाहिए, सिर पंक्तियों प्रत्येक एम संयंत्र के लिए लगाया जा सकता है, और प्रत्येक पंक्ति से एम बीज काटा जा सकता है और अलग से TILLING जनसंख्या संसाधन के रूप में बचाया.

3. म्यूटेंट की आनुवंशिक विशेषता के लिए Cel-1 परख

  1. एम2 के पत्ती ऊतक से निकालें एक डीएनए शोधन प्रणाली के साथ एक संयंत्र डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता की सिफारिशों के बाद.
  2. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर डीएनए की मात्रा और 96 अच्छी तरह से ब्लॉक में nuclease मुक्त पानी के साथ 25 एनजी /
    नोट: यह एक जेल पर इसे चलाने के द्वारा डीएनए की गुणवत्ता की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में कम गुणवत्ता वाले डीएनए (धमकी डीएनए) जमा नमूनों में झूठी नकारात्मक में परिणाम हो सकता है.
  3. पंक्ति और प्रत्येक नमूने के स्तंभ पहचान को बनाए रखने, जबकि एक थाली में चार 96 अच्छी तरह से ब्लॉक से डीएनए के संयोजन के द्वारा 4x डीएनए पूल बनाएँ. पूल प्लेट में प्रत्येक व्यक्ति के नमूने से डीएनए के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें ताकि प्रत्येक पूल प्लेट अच्छी तरह से चार अलग 96 अच्छी तरह से ब्लॉक से डीएनए की कुल 200 $L शामिल हैं.
  4. पूल प्लेट-पंक्ति-कॉलम के प्रारूप में पूल किए गए डीएनए की पहचान कैटलॉग करें (उदा., पूल 1 A1 ] Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1).
  5. जीनोम-विशिष्ट प्राइमर [A1] जीनोम विशिष्ट प्राइमर (जीएसपी) पृष्ठ का उपयोग करके ब्याज के जीन के लिए डिज़ाइन करें;https://probes.pw.usda.gov/GSP और बहुगुणित प्रजातियों के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ। द्विगुणितों के लिए, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करके प्राइमर डिज़ाइन करने के लिए प्राइमर 3 और lt;http://primer3.ut.ee/ ब्याज की जीन के पूरे कोडिंग क्षेत्र को कवर करने के लिए, यदि आवश्यक हो, तो कई प्राइमर डिजाइन करें।
    नोट: नवीनतम IWGSC विधानसभा URGI ब्लास्ट उपकरण का उपयोग कर गेहूं में ब्याज की जीन के लिए दृश्यों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है;lt;https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Sec-Repository/BLAST/BLAST. इष्टतम प्रप्लिचन लंबाई 800-1,500 बीपी की सीमा में है। तालिका 1 हेक्सागुणित गेहूं में मोमी जीनों के लिए प्राइमर के उदाहरण दिखाती है।
  6. जमा डीएनए पर जीन-विशिष्ट प्राइमर के लिए PCR निम्नानुसार चलाएँ:
    1. पीसीआर बफर के 5 डिग्री एल जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस आगे और रिवर्स प्राइमर के 2 डिग्री एल (प्रत्येक), डीएनए पॉलिमरेज के 0.1 डिग्री एल (सामग्री की तालिकादेखें), पूल्ड डीएनए टेम्पलेट के 5 डिग्री एल, फिर मात्रा को 25 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ा दें।
    2. एक थर्मल साइकिलर पर पीसीआर प्रतिक्रिया को चलाने के लिए एक टच डाउन प्रोफाइल का उपयोग करें: 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के सात चक्र, 67 डिग्री सेल्सियस से 60 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ 1 डिग्री सेल्सियस प्रति चक्र और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस कम हो जाती है , 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 7 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार के बाद।
      नोट: ऊपर पीसीआर प्रोफ़ाइल प्राइमर 3 डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग कर डिजाइन प्राइमर के अधिकांश के लिए गेहूं डीएनए टेम्पलेट पर काम करता है। गैर-विशिष्ट प्रवर्धन के मामले में, पीसीआर प्रोफ़ाइल अगले चरणों में जाने से पहले कठोर बनाया जाना चाहिए।
  7. इस प्रकार के रूप में प्रोफ़ाइल का उपयोग कर थर्मल साइकिलर में पीसीआर उत्पादों incubating द्वारा बेमेल डीएनए के बीच हेटेरोडउपलेक्स उत्पन्न करें: 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 मिनट, 1 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के पांच चक्र, 95 डिग्री सेल्सियस से 85 डिग्री सेल्सियस तापमान के साथ 1 मिनट के लिए 2 डिग्री सेल्सियस की कमी, और 85 डिग्री सेल्सियस के 60 चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस के साथ प्रति चक्र 1 डिग्री सेल्सियस की कमी हो जाती है।
  8. हेटरोडअपेड पीसीआर उत्पादों के लिए घर का बना सेल-1 एंडोक्यूल्यूलेस का 2.5 डिग्री एल जोड़ें और 45 मिनट के लिए 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) के 2.5 डिग्री एल जोड़कर Cel-1 प्रतिक्रिया समाप्त।
    नोट: Cel-1 endonuclease ताजा अजवाइन डंठल से निकाला जा सकता है एट अल द्वारा प्रदर्शन प्रोटोकॉल का उपयोग कर19 यह बहुत महत्वपूर्ण है की गतिविधि और Cel-1 endonuclease, जो पहले की विशेषता म्यूटेंट का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है की इष्टतम राशि का परीक्षण या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्परिवर्तन का पता लगाने किट.
  9. 2.5 एच के लिए 100 वी पर एक 3.0% agarose जेल पर Cel-1 इलाज उत्पादों चलाते हैं। पूर्ण लंबाई uncleaved बैंड के अलावा छोटे और अद्वितीय cleaved बैंड (ओं) युक्त कुओं, उत्परिवर्ती डीएनए नमूना शामिल होंगे.
  10. Denconvolute उत्परिवर्ती पूल.
    1. चरण 3.9 में पहचाने गए उत्परिवर्ती पूलों का गठन करने वाले अलग-अलग एम2 डीएनए नमूनों के लिए 3.6, 3.7, 3.8 और 3.9 चरणों का पालन करें।
    2. म्यूटेंट की युग्मनजता का निर्धारण करने के लिए, अलग-अलग एम2 डीएनए के लिए दो पीसीआर (जैसा कि चरण 3.6 में वर्णित है) चलाएं, जिसमें पहली प्रतिक्रिया में एम2 डीएनए का 2.5 डिग्री सेल्सियस और जंगली-प्रकार के डीएनए का 2.5 डिग्री सेल्सियस होता है और दूसरी प्रतिक्रिया में एम2 डीएनए का केवल 5 डिग्री सेल्सियस होता है। यदि उत्परिवर्तन विषमयुग्मज है, तो दोनों अभिक्रियाओं में एक अतिरिक्त क्लीव्ड बैंड उपस्थित होगा। दूसरी ओर, अतिरिक्त cleaved बैंड केवल पहली प्रतिक्रिया में पाया जाएगा अगर उत्परिवर्ती समयुग्मज है.
  11. उत्परिवर्तन की प्रकृति की पहचान करने के लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक Sanger अनुक्रमण मंच का उपयोग कर की पुष्टि म्यूटेंट के पीसीआर उत्पादों अनुक्रम।

4. उत्परिवर्तन आवृत्ति की गणना

नोट: एक TILLING जनसंख्या की उत्परिवर्तन आवृत्ति औसत शारीरिक दूरी जिसमें एक उत्परिवर्तन है कि जनसंख्या के व्यक्तियों में होता है को संदर्भित करता है. उदाहरण के लिए, एक TILLING जनसंख्या में 1/35 kb की उत्परिवर्तन आवृत्ति का अर्थ है कि उस जनसंख्या के एक औसत व्यक्ति जीनोम में हर 35 केबी प्रति 1 उत्परिवर्तन के पास है.

  1. एक TILLING जनसंख्या के उत्परिवर्तन आवृत्ति का निर्धारण करने के लिए, जांच की कुर्सियां की कुल संख्या की गणना.
  2. स्क्रीन किए गए आधारों की कुल संख्या की गणना करने के लिए, स्क्रीन किए गए व्यक्तियों की कुल संख्या से PCR उत्पाद आकार को गुणा करें.
  3. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके देखे गए अद्वितीय उत्परिवर्तनों की संख्या द्वारा जांचे गए आधारों की कुल संख्या विभाजित करें, जो दिए गए लिंग जनसंख्या में 1 उत्परिवर्तन वाले भौतिक क्षेत्र को प्राप्त करेगा:
    Equation 2
    नोट: एक agarose जेल आधारित मंच के आधार पर दोनों सिरों पर 50 बीपी के संकल्प में सीमा के लिए खाते के लिए, गणना में उत्पाद आकार से 100 bp घटाना.

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Representative Results

चित्र 2 षट्गुणित रोटी गेहूं की खेती, द्विगुणित गेहूं ट्राइटिकम मोनोकोकम6और गेहूं एजिलॉप्स टौशीई7 के जीनोम दाता की खुराक वक्र को दर्शाता है। वांछित 50% जीवित रहने की दर के लिए ईएमएस खुराक के बारे में थे 0.25%, 0.6% और 0.7% टी monococcumके लिए , Ae. tauschii, और टी aestivum, क्रमशः. हेक्सागुणित गेहूं की उच्च ईएमएस सहिष्णुता इसकी जीनोम बफरिंग क्षमता के कारण है। हालांकि, दोनों द्विगुणित होने के बावजूद, टी मोनोकोकम के ईएमएस सहिष्णुता लगभग आधा था कि ए. tauschii. इसलिए, इन परिणामों ब्याज की व्यक्तिगत जीनोटाइप के लिए उपयुक्त ईएमएस खुराक का निर्धारण करने के महत्व को रेखांकित.

एम2 जनसंख्या में आसानी से पहचाने जाने योग्य phenotypes की उपस्थिति छोटे अनाज आबादी में mutagenesis की प्रभावशीलता की पुष्टि करता है. उत्परिवर्ती phenotypes आम तौर पर एल्बिनो, क्लोरिना, अवरुद्ध, घास की गोली मार, variegated, जल्दी / चित्र 3 कुछ विशिष्ट उत्परिवर्ती phenotypes TILLING आबादी में प्राप्त से पता चलता है.

उत्परिवर्ती पहचान के लिए Cel-1 परख और agarose जेल आधारित दृष्टिकोण सुविधाजनक है, reproduible, और कम संसाधन गहन मंच. चित्रा 4 agarose जेल प्लेटफार्मों पर Cel-1 का उपयोग कर एक उत्परिवर्ती पहचान से पता चलता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उत्परिवर्ती डीएनए गलियों cleaved बैंड के अद्वितीय पैटर्न होते हैं. 4x पूल स्क्रीनिंग के पहले दौर श्रम की जरूरत है, संसाधनों, और समय खर्च कम कर देता है. उदाहरण के लिए, जैसा कि चित्र 4Aमें दिखाया गया है, एक उत्परिवर्ती पूल की पहचान 12 पूल किए गए नमूनों में से की गई थी जो पीसीआर और Cel-1 परख के प्रदर्शन से 48 व्यक्तियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। उत्परिवर्ती पूलों के विपरित रूपांतरण ने उत्परिवर्तन की युग्मनजता को निर्धारित किया और उत्परिवर्तन को अलग-अलग नमूनों में ट्रैक करने में मदद की (चित्र 4ठ,ब्) . चित्रा 3B A4 पूल में विषमयुग्मज उत्परिवर्तनों का पता लगाने से पता चलता है, अद्वितीय के रूप में, cleaved बैंड दोनों बॉक्स 4-A4 और बॉक्स 4-A4 + जंगली प्रकार डीएनए नमूने में मौजूद हैं. दूसरी ओर, H5 पूल समयुग्मज उत्परिवर्तन निहित, अद्वितीय के रूप में, cleaved बैंड केवल बॉक्स 5-H5 + जंगली प्रकार डीएनए नमूने में मौजूद हैं.

Figure 1
चित्र 1: छोटे अनाज फसलों में ईएमएस-म्यूटेनेइज्ड टिलरिंग आबादी के विकास की योजना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: गेहूं की तीन अलग-अलग प्रजातियों में ईएमएस खुराक वक्र , ट्राइटिकम एस्टिवम, टीमोनोकोकम, और एजिलॉप्स टौशीई. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: विभिन्न छोटे अनाज एम2 TILLING आबादी में उत्परिवर्ती phenotypes (पीले तीर)। (A) जौ M2 जनसंख्या में एक एल्बिनो उत्परिवर्ती , (B) एक जौ M2 जनसंख्या में क्लोरिना उत्परिवर्ती , (C ) एक Ae. tauschii M2 जनसंख्या में गुलाबी विकलन के साथ उत्परिवर्ती, और (D) एक टी monococum में उत्परिवर्ती कम टिके हुए M2 जनसंख्या. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Cel-1 परख और agarose जेल आधारित दृष्टिकोण का उपयोग deconvolution के बाद 4x पूल में उत्परिवर्ती पहचान। दिखाया गया है (एक) लेन में उत्परिवर्ती पूल 7 अद्वितीय cleaved बैंड के साथ, (बी) विषमयुग्मज उत्परिवर्ती पूल के deconvolution, बॉक्स 4 में अद्वितीय cleaved बैंड के साथ डीएनए बॉक्स 4 के A4 नमूने के A4 नमूने में उत्परिवर्तन का पता लगाने और बॉक्स 4-A4 + जंगली प्रकार के डीएनए नमूने , और (सी) समयुग्मज उत्परिवर्ती के deconvolution, केवल बॉक्स 5-H5 + जंगली प्रकार डीएनए नमूने में अद्वितीय cleaved बैंड के साथ डीएनए बॉक्स 5 के H5 नमूने में उत्परिवर्तन का पता लगाने. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जीन प्राइमर नाम प्राइमर अनुक्रम (5'-3') उत्पाद का आकार
मोमी Wx]AF टीसीजीसीटीजीसीएएटीटीजीसी १०२२
Wx$AR GGAACTGGCAAGAGAACTG
मोमी डब्ल्यूएक्सजेडबीएफ GCGTCGTCCGAGGTACAC 870
डब्ल्यूएक्सजेडबीआर जी.टी.सी.जी.ए.जी.ए.सी.सी.टी.जी.ए.सी.सी.
मोमी डब्ल्यूएक्सजेडडीएफ सीसीएटीजीसीसीजीटीएजीएजीएजीएजीएसी 1124
डब्ल्यूएक्सजेडडीआर जी.टी.सी.जी.ए.जी.ए.सी.सी.टी.जी.ए.सी.सी.

तालिका 1: हेक्सागुणित गेहूं में मोमी जीनों को बढ़ाने के लिए प्राइमर्स।

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Discussion

TILLING जीन सत्यापन के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण है, विशेष रूप से छोटे अनाज के लिए जहां परिवर्तन आधारित दृष्टिकोण गंभीर बाधाओं11है. एक उच्च उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक mutagenized आबादी का विकास कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन के संचालन में महत्वपूर्ण चरणों में से एक है. एक मजबूत लिंग जनसंख्या के विकास में सबसे महत्वपूर्ण कदम ईएमएस के इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए है. एम1 में 40%-60% जीवित रहने की दर गेहूं और जौ4,6,18में ईएमएस मटजनन की प्रभावशीलता का अच्छा संकेत है . जीवित पौधों ब्याज के किसी भी जीन में उत्परिवर्तन की खोज में मदद करने के लिए सभ्य उत्परिवर्तन आवृत्तियों प्रदान कर सकते हैं. चावल में, एम1 पौधे की उर्वरता एक अन्य निर्धारक है, एम1 पौधों के जीवित रहने के अलावा, और विभिन्न जीनोटाइप20में भिन्न होने की सूचना है।

हेक्ऐल्लॉयड ब्रेड गेहूं और टेट्रागुणड्यूल ड्यूरम गेहूं, उनके पॉलीपोइडी के कारण, अधिकांश जीनों के लिए प्रत्येक जीनोम में homoeoallles है, उत्परिवर्तनों के कारण महत्वपूर्ण जीनों के नुकसान के कार्य के लिए मुआवजा. इसे जीनोम बफरिंग कहते हैं। इस प्रकार बहुगुणित ईएमएस खुराक के उच्च स्तर को जीनोम बफरिंग21,22के कारण द्विगुणित की तुलना में सहन कर सकते हैं। हालांकि, यह ज्ञात है कि mutagens के लिए विभिन्न द्विगुणित प्रजातियों की सहिष्णुता भिन्न होता है और आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विविधता द्वारा विनियमित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, Ae. tauschii 0.6% ईएमएस पर एक 55% जीवित रहने की दर से पता चला है, जबकि टी monococcum 0.24% ईएमएस के साथ एक 51% दर से पता चला; इसके अलावा , बाद की प्रजातियों में किसी भी उच्च एकाग्रता अत्यधिक संयंत्र मौत के लिए नेतृत्व6,7. हम पहले भी हेक्साप्लाइड्स में, विभिन्न cultivars विभिन्न mutagen सांद्रता सहन (डेटा नहीं दिखाया गया है) का अनुभव किया है। इसके अलावा, ईएमएस सहिष्णुता विभिन्न चावल जीनोटाइप20के बीच काफी भिन्न होता है। इसलिए, यह अत्यधिक ब्याज की व्यक्तिगत जीनोटाइप के लिए खुराक घटता प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है.

म्यूटजेनेस की प्रभावकारिता का विश्लेषण करने के लिए , कई प्रकार के फीनोटाइपिक म्यूटेंट अंकुर चरण से एक लिंग जनसंख्या7,23,24की परिपक्वता तक दिखाई देने चाहिए . नोट करने के लिए phenotypic म्यूटेंट क्लोरीना, albinos, विभिन्न पत्ते, अवरुद्ध, व्यापक / जंगली प्रकार phenotype से किसी भी विचलन एक संभावित phenotypic उत्परिवर्ती का प्रतिनिधित्व करता है.

चूंकि जी और सी ईएमएस mutagenesis के प्राथमिक लक्ष्य अवशेष हैं, वहाँ जीसी सामग्री के आधार पर जीन के उत्परिवर्तन आवृत्तियों में पूर्वाग्रह हो जाएगा. उच्च जीसी सामग्री वाले क्षेत्र में उच्च उत्परिवर्तन आवृत्ति प्राप्त होगी, जबकि कम जीसी सामग्री वाला क्षेत्र कम उत्परिवर्तन आवृत्ति प्राप्त करेगा। एक TILLING जनसंख्या की सही उत्परिवर्तन आवृत्ति की गणना करने के लिए, यह अलग जीसी सामग्री के साथ दो से तीन जीन के एक औसत प्राप्त करने या एक 50% जीसी सामग्री13करने के लिए उत्परिवर्तन की दर को सामान्य करने के लिए सुझाव दिया है।

Cel-1 परख और agarose जेल आधारित प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित सरल तरीके है कि महंगा इंस्ट्रूमेंटेशन या जटिल विश्लेषण की आवश्यकता नहीं है. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस विधि केवल उपयुक्त और कुछ जीन में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए कुशल है. जीनों के एक बड़े समुच्चय में उत्परिवर्तनों की स्क्रीनिंग के लिए, मल्टीप्लेक्स एम्प्लिकॉन अनुक्रमण विधि की सिफारिश की जाती है3,24. एकाधिक amplicon अनुक्रमण विधि पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, पाठकों Tsai एट अल का उल्लेख कर सकते हैं25 अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में अग्रिम और अनुक्रमण की कम लागत के साथ, ऐसे exome कब्जा के रूप में प्लेटफार्मों एक भर में उत्परिवर्तनों की विशेषता में इस्तेमाल किया गया है पूरे गेहूं की कुल आबादी में पूरे जीनोम17. छोटे जीनोम वाले पौधों के लिए भी जनसंख्या में सभी व्यक्तियों के पूरे जीनोम का अनुक्रम15,16किया जा सकता है . हालांकि, किसी दिए गए लिंग जनसंख्या के व्यक्तियों में सभी उत्परिवर्तनों की स्क्रीनिंग की लागत यह महंगा विशिष्ट प्रयोजनों के लिए विकसित की आबादी के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रदर्शन करते हैं। इसलिए, नियमित आणविक जीव विज्ञान इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ किसी भी प्रयोगशाला में उम्मीदवार जीन की एक सीमित संख्या के लिए रिवर्स आनुवंशिकी आधारित सत्यापन प्रदर्शन के लिए, Cel-1 आधारित परख पसंद का एक सभ्य तरीका है. फिर भी, उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए मंच का चुनाव जीनोम भर में कई उत्परिवर्तनों शरण एक TILLING आबादी के विकास के लिए माध्यमिक है. इसलिए, प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम एक उच्च उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक मजबूत TILLING आबादी का विकास है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

इस काम को यूएसडीए राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान, हैच परियोजना 1016879 और मैरीलैंड कृषि प्रयोग स्टेशन द्वारा MAES अनुदान संख्या 2956952 के माध्यम से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well 1.1 ml microtubes in microracks National Scientific TN0946-08R For collecting leaf tissues
Agarose I biotechnology grade VWR 0710-500G
Biosprint 96 DNA Plant Kit Qiagen 941558 Kit for DNA extraction
Cel-1 endonuclease Extracted as described by Till et al 2006 Single strand specific endonuclease
Centrifuge 5430 R Eppendorf
Ethyl methanesulfonate Sigma Aldrich M-0880-25G EMS, Chemical mutagen
Freeze Dry/Shell freeze system Labconco For lyophilization of leaf tissue
Kingfisher Flex purification system Thermo fisher scientific 5400610 High throughput DNA extraction robot
My Taq DNA Polymerase Bioline BIO-21107
Nuclease free water Sigma aldrich W4502-1L
NuGenius gel imaging system Syngene
Orbit Environ-shaker Lab-line
SPECTROstar Nano BMG LABTECH Nano drop for DNA quantification
T100 Thermal cycler BIO-RAD 1861096

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 149 Mutagenesis जनसंख्या ईएमएस रिवर्स आनुवंशिकी छोटे अनाज Cel-1 endonuclease
एथिल मिथेनसल्फोनेट म्यूटजेनेसिस द्वारा छोटे अनाज फसलों में जीनोम्स (TILLING) जनसंख्या में स्थानीय लेसेंस को लक्षित करने का विकास
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Singh, L., Schoen, A., Mahlandt, A., … More

Singh, L., Schoen, A., Mahlandt, A., Chhabra, B., Steadham, J., Tiwari, V., Rawat, N. Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis. J. Vis. Exp. (149), e59743, doi:10.3791/59743 (2019).

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