Summary
Described ist ein Protokoll zur Entwicklung einer Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Population in Kleinkornkulturen mit Verwendung von Ethylmethansulfonat (EMS) als Mutagen. Ebenfalls zur Verfügung gestellt wird ein Protokoll zur Mutationsdetektion mit dem Cel-1-Assay.
Abstract
Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) ist ein leistungsstarkes Reverse-Genetik-Tool, das chemische Mutagenese und den Nachweis von Sequenzvariationen in Zielgenen umfasst. TILLING ist ein sehr wertvolles funktionelles Genomik-Tool für die Genvalidierung, insbesondere in kleinen Körnern, bei denen transformationsbasierte Ansätze ernsthafte Grenzen haben. Die Entwicklung einer robusten mutagenisierten Population ist der Schlüssel zur Bestimmung der Effizienz einer TILLING-basierten Genvalidierungsstudie. Eine TILLING-Population mit einer niedrigen Gesamtmutationshäufigkeit weist darauf hin, dass eine unpraktisch große Population untersucht werden muss, um gewünschte Mutationen zu finden, während eine hohe Mutagenkonzentration zu einer hohen Sterblichkeit in der Bevölkerung führt, was zu einer unzureichenden Anzahl der mutagenisierten Personen. Sobald eine effektive Population entwickelt ist, gibt es mehrere Möglichkeiten, Mutationen in einem Gen von Interesse zu erkennen, und die Wahl der Plattform hängt von der experimentellen Größe und Verfügbarkeit von Ressourcen ab. Der Cel-1-Assay- und Agarose-Gel-basierte Ansatz zur mutierten Identifizierung ist bequem, reproduzierbar und eine weniger ressourcenintensive Plattform. Es ist insofern von Vorteil, als es einfach ist, ohne Rechenkenntnisse, und es eignet sich besonders für die Validierung einer kleinen Anzahl von Genen mit grundlegenden Laborgeräten. In diesem Artikel werden die Methoden zur Entwicklung einer guten TILLING-Population beschrieben, einschließlich der Vorbereitung der Dosierungskurve, der Mutagenese und der Erhaltung der mutierten Population und des Screenings der mutierten Population mit dem PCR-basierten Cel-1-Assay. .
Introduction
Punktmutationen in Genomen können vielen nützlichen Zwecken für Forscher dienen. Je nach Art und Standort können diese Mutationen verwendet werden, um Genen oder sogar unterschiedlichen Bereichen von Proteinen von Interesse Funktionen zuzuweisen. Andererseits können als Quelle neuartiger genetischer Variationen nützliche Mutationen für gewünschte Merkmale ausgewählt werden, indem Phänotypisierungssiebe verwendet werden, die weiter bei der Verbesserung der Ernte verwendet werden. TILLING ist ein leistungsstarkes Reverse-Genetik-Tool, das chemische Mutagenese und den Nachweis von Sequenzvariationen im Zielgen umfasst. Zuerst entwickelt in Arabidopsis1 und Drosophilia melanogaster2, TILLING Populationen wurden entwickelt und in vielen kleinen Getreidekulturen wie Hexaploid Brot Weizen (Triticum aestivum)3verwendet Gerste (Hordeum vulgare)4, tetraploider Hartweizen (T. dicoccoides durum)5, diploider Weizen (T. monococcum)6 und der "D" Genom Vorläufer von Weizen Aegilops tauschii7 . Diese Ressourcen wurden verwendet, um die Rolle von Genen bei der Regulierung der abiotischen und biotischen Stresstoleranz8zu validieren, die Blütezeit9zu regulieren und ernährungsphysiologisch überlegene Pflanzensorten zu entwickeln5.
TILLING, zusammen mit der Verwendung von alkyliernden mutagenen Erbgutverändern wie Ethylmetschenulfonat (EMS), Natriumazid, N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) und Methylmethansulfonat (MMS), hat aus mehreren Gründen Vorteile gegenüber anderen Reverse-Genetik-Werkzeugen. Erstens kann die Mutagenese an praktisch jeder Art oder Sorte der Pflanze10 durchgeführt werden und ist unabhängig vom Transformationsengpass, der bei Kleinkörnern besonders anspruchsvoll ist11. Zweitens können neben der Erzeugung von Knockout-Mutationen, die durch andere Genvalidierungsansätze erreicht werden können, eine Reihe von Missense- und Spleißmutationen induziert werden, die Funktionen einzelner Domänen der von Interesse interessierten Proteine erkennen können12. Darüber hinaus erzeugt TILLING eine unsterbliche Sammlung von Mutationen im gesamten Genom; So kann eine einzige Population für die funktionelle Validierung mehrerer Gene verwendet werden. Im Gegensatz dazu erzeugen andere Reverse-Genetik-Tools Ressourcen, die nur für das in Studie13unterfessliche Gen spezifisch sind. Nützliche Mutationen, die durch TILLING identifiziert werden, können zu Zuchtzwecken eingesetzt werden und unterliegen nicht der Regulierung, im Gegensatz zur Genbearbeitung, deren nicht-transgene Klassifizierung in vielen Ländern noch unsicher ist. Dies wird besonders relevant für kleine Körner, die international gehandelt werden14.
TILLING ist eine einfache und effiziente Genvalidierungsstrategie und erfordert die Entwicklung von mutagenisierten Populationen zur Untersuchung von Genen von Interesse. Die Entwicklung einer effektiven mutagenisierten Population ist der Schlüssel zur Bestimmung der Effizienz einer TILLING-basierten Genvalidierungsstudie. Eine TILLING-Population mit einer niedrigen Gesamtmutationshäufigkeit weist darauf hin, dass eine unpraktisch große Population auf gewünschte Mutationen untersucht werden muss, während eine hohe Mutagenkonzentration zu einer hohen Sterblichkeit in der Bevölkerung und einer unzureichenden Anzahl von mutagenisierte Individuen. Sobald eine gute Population entwickelt ist, gibt es mehrere Möglichkeiten, Mutationen in den Genen von Interesse zu erkennen, und die Wahl der Plattform hängt von der experimentellen Größe und Verfügbarkeit von Ressourcen ab. Ganze Genomsequenzierung und Exomsequenzierung wurde verwendet, um alle Mutationen in TILLING-Populationen in Pflanzen mit kleinen Genomen15,16zu charakterisieren. Die Exome-Sequenzierung von zwei TILLING-Populationen wurde in Brot und Hartweizen durchgeführt und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung, um wünschenswerte Mutationen zu identifizieren und mutierte Interessenslinien zu ordnen17. Es ist eine große öffentliche Ressource in Bezug auf die Verfügbarkeit von wünschenswerten Mutationen; In Genvalidierungsstudien sollte die Wildtyplinie jedoch das Kandidatengen besitzen, das von Interesse ist. Leider ist es immer noch kostenprohibitiv, das Exom der gesamten TILLING-Population für die umgekehrte genetische Validierung einiger Kandidatengene in einem anderen Hintergrund zu sequenzieren. Amplicon-Sequenzierung und Cel-1-basierte Assays wurden verwendet, um Mutationen in zielgerichteten Populationen im Weizen zu erkennen, und Cel-1-Assays sind einfacher, erfordern keine Computerkenntnisse und eignen sich besonders für die Validierung einer kleinen Anzahl von Genen mit Laborausrüstung6,18.
In diesem Artikel werden Methoden zur Entwicklung einer guten TILLING-Population beschrieben, einschließlich der Vorbereitung der Dosierungskurve, der Mutagenese und der Erhaltung der mutierten Population und des Screenings der mutierten Population mit dem PCR-basierten Cel-1-Assay. . Dieses Protokoll wurde bereits erfolgreich bei der Entwicklung und Nutzung von mutagenisierten Populationen von Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, Gerste, Aegilops tauchii7und Andere. Enthalten sind explizite Details dieser Methoden zusammen mit nützlichen Tipps, die Forschern helfen, TILLING Populationen zu entwickeln, mit EMS als Mutagen in jeder kleinen Getreidepflanze ihrer Wahl.
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Protocol
1. Vorbereitung der Dosierungskurve für eine effektive Mutagenese
- 100 Samen mit dem Genotyp des Interesses in sechs 250 ml Glaskolben (100 in jedem Kolben) mit 50 ml destilliertem Wasser einweichen. Bei 100 Umdrehungen bei 8 h bei Raumtemperatur (RT) für die Imbibition durch die Samen schütteln.
- In einer Dunstabzugshaube 50 ml mit 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% und 1,2% (w/v) Ethylmethansulfonat (EMS) Lösung durch Auflösen von 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 und 0,498 ml EMS in destilliertem Wasser zubereiten.
HINWEIS: EMS ist bei RT mit einer Dichte von 1.206 g/ml flüssig.
VORSICHT: Verwenden Sie beim Umgang mit EMS geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA). - Dekantieren Sie das Wasser aus fünf Kolben und fügen Sie 50 ml EMS-Lösung in jedem Kolben mit imprägniertem Saatgut hinzu, so dass es sechs verschiedene Behandlungen mit 0,0%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% und 1,2% EMS-Lösung gibt. 16 H-Flaschen bei 75 U/min und RT schütteln.
- Dekantieren Sie die EMS-Lösung und sammeln Sie die behandelten Samen separat für jede Behandlung mit Käsetuch. Inaktivieren Sie die verwendete EMS-Lösung durch Hinzufügen eines Volumens von EMS-inaktivierender Lösung (0,1 M NaOH, 20% w/v Na2S2O3) für 24 h. Behandeln Sie auch die kontaminierten Kolben und Pipettenspitzen mit der EMS-inaktivierenden Lösung für 24 h.
- Waschen Sie die EMS-behandelten Samen unter fließendem Leitungswasser für 2 h. Verpflanzen Sie jedes Saatgut einzeln in Wurzeltrainer, die Blumenerde enthalten.
- Pflanzen bei 20–25 °C unter einer Lichtperiode von 16 h anbauen.
- Zeichnen Sie Daten über das Überleben von Pflanzen nach 15 Tagen Transplantation auf. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Überlebensrate für jede Behandlung zu berechnen:
HINWEIS: Wenn die Keimrate bei kontrollen unter 100 % liegt, sollten genaue Überlebensraten in allen Behandlungen berechnet werden, nachdem die Anzahl der Samen subtrahiert wurde, die in den Kontrollen nicht keimten. Eine Überlebensrate von 40%–60% ist für eine effektive Mutagenese wünschenswert. Es kann erforderlich sein, eine zweite Runde der Dosierungsoptimierung mit einer modifizierten Konzentration entsprechend dem Überleben der behandelten Samen durchzuführen, bis die wünschenswerte Letalitätsrate von 40%–60% erreicht wird.
2. Mutagenese und Erhaltung der mutierten Bevölkerung
- Die letzte Charge von mindestens 3.000 Samen, die sich gleichmäßig (je 600 Samen) teilen, in fünf 1.000 ml-Flaschen mit 300 ml destilliertem Wasser einweichen. 8 h bei 100 U/min unter RT für Imbibition schütteln.
HINWEIS: Die endgültige Größe der wünschenswerten Population hängt von der Mutationshäufigkeit und dem Ploidie-Niveau des Genotyps ab, aber es ist ratsam, mindestens 3.000 Samen für Hexaploide, 4.000 Samen für Tetraploide und mehr als 7.000 Samen für Diploide zu verwenden. - In einer Dunstabzugshaube 1.500 ml der optimierten EMS-Konzentrationslösung in destilliertem Wasser vorbereiten.
- Dekantieren Sie das Wasser aus den Kolben und fügen Sie 300 ml der optimalen Konzentration der EMS-Lösung in jeden Kolben mit 600 imprägnierten Samen hinzu. Schütteln Sie die Kolben für 16 h bei 75 U/min und RT.
- Dekantieren Sie das EMS und sammeln Sie die behandelten Samen in Käsetuch. Inaktivieren Sie die EMS-Lösung und Behandlungsbehälter mit EMS-inaktivierender Lösung wie in Schritt 1.4.
- Waschen Sie die EMS-behandelten Samen unter fließendem Leitungswasser für 2 h. Transplantieren Sie jedes EMS-behandelte M 1-Saatgut einzeln in Wurzeltrainer.
- M 1-Pflanzen (abgeleitet aus M 0-Samen) bei 20–25 °C unter einer 16-h-Lichtperiode anbauen.
HINWEIS: Es kann erforderlich sein, die Sämlinge in der Zwei-Blatt-Phase für 6 Wochen bei 4 °C zu vernalisieren, wenn der Genotyp des Interesses eine winterartige Wachstumsgewohnheit hat. - Lassen Sie die M 1-Pflanzen selbst bestäubungsmittelisieren und ernten Sie die M 2-Samen separat für jede fruchtbare M 1-Pflanze.
HINWEIS: Um die Wahrscheinlichkeit einer möglichen Überquerung zu vermeiden, bedecken Sie die Spitzen von M 1-Pflanzen vor der Anthese mit Bestäubungsbeuteln. - Pflanzen Sie einen einzelnen M2 Samen aus jeder M1 Pflanze, um genetische Redundanz zu vermeiden.
- Sammeln Sie Gewebe aus M 2-Pflanzen im Zwei-Blatt-Stadium in 1,1 ml zerrissenen 96 Well-Mikroröhren. Sammeln Sie rund 80 mm Blattgewebe von jeder Pflanze und notieren Sie die ID jeder Probe in einem Gewebesammelplan.
- Das Blattgewebe mit einem Lyophilisator einfrieren und bei -80 °C lagern.
- Halten Sie die M 2-Anlagen bei 20–25 °C unter einer 16-h-Lichtperiode.
- Erfassen Sie in regelmäßigen Abständen Daten zu mutierten Phänotypen der M2-Pflanzen. Die erwarteten Phänotypen sind Albino, Chlorina, Grastrieb, bunt, teilweise fruchtbar, steril, etc.
- Lassen Sie die M 2-Pflanzen selbst düngen und reifen. Die M3-Samen der M2-Pflanzen separat ernten und speichern (Abbildung 1).
HINWEIS: M-Samen werden zur Validierung des Phänotyps in Reverse-Genetik-Studien verwendet. Daher sollte M sorgfältig katalogisiert und unter kühlen und trockenen Bedingungen gelagert werden. Wenn der Samen im Feld erhöht werden muss, können für jede M-Pflanze Kopfreihen gepflanzt werden, und M-Samen aus jeder Reihe können separat als TILLING-Populationsressource geerntet und gespeichert werden.
3. Cel-1-Assay zur genetischen Charakterisierung von Mutanten
- Extrahieren Sie DNA aus dem Blattgewebe von M2 mit einem pflanzlichen DNA-Extraktionskit mit einem DNA-Reinigungssystem (siehe Materialtabelle) nach den Empfehlungen des Herstellers.
- Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer und normalisieren Sie die DNA-Konzentrationen auf 25 ng/l mit nukleasefreiem Wasser in 96 Brunnenblöcken.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Qualität der DNA zu überprüfen, indem Sie sie auf einem Gel ausführen, da minderwertige DNA (verschmierte DNA) zu falschen Negativen in gepoolten Proben führen kann. - Erstellen Sie 4x DNA-Pools, indem Sie DNA aus vier 96 Well-Blöcken zu einer Platte kombinieren, während die Zeilen- und Spaltenidentität jeder Probe beibehalten wird. Fügen Sie 50 l DNA aus jeder einzelnen Probe in die Poolplatte ein, so dass jede Poolplatte insgesamt 200 l DNA aus vier verschiedenen 96 Brunnenblöcken enthält.
- Katalogisieren Sie die Identität der gepoolten DNA im Format der Pool Plate-Row-Column (z.B. Pool 1 A1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1).
- Entwerfen Sie genomspezifische Primer [A1] für das gen von Interesse mit der Seite Genome Specific Primers (GSP)
HINWEIS: Die neueste IWGSC-Baugruppe kann verwendet werden, um Sequenzen für das Gen von Interesse für Weizen mit dem URGI BLAST-Tool - Führen Sie eine PCR für genspezifische Primer auf gepoolter DNA wie folgt aus:
- Fügen Sie 5 l PCR-Puffer, 2 l (jeweils) von 4 ,M Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, 0,1 l DNA-Polymerase (siehe Tabelle derMaterialien), 5 l gepoolte DNA-Vorlage hinzu, und erhöhen Sie dann das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 25 l.
- Verwenden Sie ein Touchdown-Profil, um die PCR-Reaktion auf einem Thermischen Cycler wie folgt auszuführen: 95 °C für 1 min, sieben Zyklen von 95 °C für 1 min, 67 °C bis 60 °C für 1 min mit Temperaturabnahmen von 1 °C pro Zyklus und 72 °C für 2 min , gefolgt von 30 Zyklen von 95 °C für 1 min, 60 °C für 1 min, 72 °C für 2 min und Endverlängerung bei 72 °C für 7 min.
HINWEIS: Ob PCR-Profil funktioniert auf Weizen-DNA-Vorlage für die meisten der Primer mit Primer 3 Standardeinstellungen entwickelt. Bei unspezifischer Verstärkung sollte das PCR-Profil vor dem Wechsel zu den nächsten Schritten streng gestellt werden.
- Generieren Sie Heteroduplexe zwischen nicht übereinstimmender DNA durch Inkubation von PCR-Produkten im thermischen Cycler unter Verwendung des Profils wie folgt: 95 °C für 2 min, fünf Zyklen von 95 °C für 1 s, 95 °C bis 85 °C für 1 min mit Temperaturabsenkungen von 2 °C pro Zyklus und 60 Zyklen von 85 °C bis 25 °C mit ab 1 °C pro Zyklus.
- Den heteroduplexierten PCR-Produkten 2,5 L hausgemachte Cel-1-Endonuklease hinzufügen und 45 min bei 45 °C inkubieren. Beenden Sie die Cel-1-Reaktion, indem Sie 2,5 l von 0,5 M EDTA (pH 8,0) hinzufügen.
HINWEIS: Cel-1 Endonuklease kann aus frischen Selleriestielen mit dem Protokoll von Till et al.19 extrahiert werden. Es ist sehr wichtig, die Aktivität und die optimale Menge an Cel-1-Endonuklease zu testen, die mit zuvor charakterisierten Mutanten getestet werden kann oder ein handelsübliches Mutationserkennungskit. - Führen Sie die Cel-1 behandelten Produkte auf einem 3,0% Agarose-Gel bei 100 V für 2,5 h. Die Brunnen, die kleinere und einzigartige Spaltenbänder enthalten, enthalten zusätzlich zu den in voller Länge uncleaved Bänder die mutierte DNA-Probe.
- Denconvolute mutierte Pools.
- Befolgen Sie die Schritte 3.6, 3.7, 3.8 und 3.9 für einzelne M 2-DNA-Proben, die die in Schritt 3.9 identifizierten mutierten Pools bilden.
- Um die Zygosität von Mutanten zu bestimmen, führen Sie zwei PCR (wie in Schritt 3.6 beschrieben) für einzelne M 2-DNA aus, in der die erste Reaktion 2,5 l M2 DNA und 2,5 l Wild-DNA enthält und die zweite Reaktion nur 5 l M2 DNA enthält. Wenn die Mutation heterozygot ist, wird in beiden Reaktionen ein zusätzliches Spaltenband vorhanden sein. Auf der anderen Seite werden zusätzliche Spaltenbänder nur in der ersten Reaktion gefunden, wenn die Mutante homozygot ist.
- Um die Art der Mutation zu identifizieren, sequenzieren Sie die PCR-Produkte der bestätigten Mutanten mithilfe einer Sanger-Sequenzierungsplattform nach den Anweisungen des Herstellers.
4. Berechnung der Mutationshäufigkeit
HINWEIS: Die Mutationshäufigkeit einer TILLING-Population bezieht sich auf die durchschnittliche physische Entfernung, in der eine Mutation bei den Individuen dieser Population auftritt. Zum Beispiel bedeutet eine Mutationshäufigkeit von 1/35 kb in einer TILLING-Population, dass ein durchschnittliches Individuum dieser Population 1 Mutation pro 35 kb im Genom besitzt.
- Um die Mutationshäufigkeit einer TILLING-Population zu bestimmen, berechnen Sie die Gesamtzahl der gescreenten Basen.
- Um die Gesamtzahl der überprüften Basen zu berechnen, multiplizieren Sie die PCR-Produktgröße mit der Gesamtzahl der überprüften Personen.
- Dividieren Sie die Gesamtzahl der Basen, die durch die Anzahl der eindeutigen Mutationen gescreent werden, die mit der folgenden Gleichung beobachtet wurden, was die physikalische Region ergibt, die 1 Mutation in der angegebenen TILLING-Population besitzt:
ANMERKUNG: Um die Begrenzung in Derauflösung von 50 bp an beiden Enden auf basis auf einer Agarose-Gel-basierten Plattform zu berücksichtigen, subtrahieren Sie 100 bp von der Produktgröße in der Berechnung.
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Representative Results
Abbildung 2 zeigt die Dosierungskurve von Hexaploid Brot WeizenSorte Jagger, diploid Weizen Triticum monococcum6, und ein Genom Spender von Weizen Aegilops tauschii7. Die EMS-Dosen für die gewünschten 50% Überlebensraten betrugen etwa 0,25%, 0,6% bzw. 0,7% für T. monococcum, Ae. tauschiiund T. aestivum. Die höhere EMS-Toleranz von Hexaploid-Weizen ist auf seine Genompufferungskapazität zurückzuführen. Obwohl beide diploid waren, war die EMS-Toleranz von T. monococcum fast halb so groß wie die von Ae. tauschii. Daher unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung der Bestimmung der geeigneten EMS-Dosis für einzelne Genotypen von Interesse.
Das Vorhandensein leicht identifizierbarer Phänotypen in der M 2-Population bestätigt die Wirksamkeit der Mutagenese in kleinen Getreidepopulationen. Die mutierten Phänotypen sind in der Regel Albino, Chlorina, verkümmert, Grastrieb, bunt, früh/spät blühend, teilweise fruchtbar und steril. Abbildung 3 zeigt einige typische mutierte Phänotypen, die in TILLING-Populationen gewonnen wurden.
Der Cel-1-Assay- und Agarose-Gel-basierte Ansatz zur mutierten Identifizierung ist eine bequeme, reproduzierbare und weniger ressourcenintensive Plattform. Abbildung 4 zeigt eine mutierte Identifikation mit Cel-1 auf Agarose-Gel-Plattformen. Es sollte beachtet werden, dass mutierte DNA-Spuren einzigartige Muster des Spaltenbandes enthalten. Die erste Runde des 4x Pool Screening reduziert den Arbeitsbedarf, die Ressourcen und den Zeitaufwand. Wie in Abbildung 4Adargestellt, wurde beispielsweise ein mutierter Pool aus 12 gepoolten Proben identifiziert, die 48 Personen durch pcR und den Cel-1-Test darstellen. Die Dekonvolution von mutierten Pools bestimmte die Zygosität der Mutation und half, die Mutation bis zu einzelnen Proben zu verfolgen (Abbildung 4B,C). Abbildung 3B zeigt den Nachweis heterozygoter Mutationen im A4-Pool, da sowohl in Box 4-A4 als auch in Box 4-A4 + Wild-Typ-DNA-Proben einzigartige, spaltende Bänder vorhanden sind. Auf der anderen Seite enthielt der H5-Pool homozygote Mutationen, da einzigartige, gespaltete Bänder nur in der Box 5-H5 + Wild-Typ-DNA-Probe vorhanden sind.
Abbildung 1: Schemat für die Entwicklung von EMS-mutagenisierten TILLING-Populationen in Kleingetreidekulturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: EMS-Dosierungskurve in drei verschiedenen Weizenarten einschließlich Triticum aestivum, T. monococcumund Aegilops tauschii. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mutante Phänotypen (gelbe Pfeile) in verschiedenen kleinen Kornm2 TILLING-Populationen. (A) Eine Albino-Mutation in einer Gerste M2-Population, (B) Chlorina-Mutant in einer Gersten-M2-Population, (C) bunt mutierte Mutante mit rosa Verfärbung in einer Ae. tauschii M2-Population und (D) niedrigbäuerliche Mutante in einem T. monococcum M2-Bevölkerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mutante Identifizierung in 4x Pools nach Dekonvolution mit dem Cel-1-Assay und dem Agarose-Gel-basierten Ansatz. Gezeigt wird der (A) Mutantenpool in Spur 7 mit einzigartigen Spaltenbändern, (B) Dekonvolution des heterozygoten Mutantenpools, der die Mutation in der A4-Probe von DNA Box 4 mit einzigartigen Spaltenbändern in Box 4-A4 und Box 4-A4+ Wildtyp-DNA-Proben erkennt und (C) Dekonvolution des homozygoten Mutanten, Nachweis der Mutation in der H5-Probe von DNA Box 5 mit einzigartigen Spaltenbändern nur in der Box 5-H5+ Wildtyp-DNA-Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| gen | Primername | Primer-Sequenz (5'-3') | Produktgröße |
| Wachsartige | Wx_AF | TCGCTCTGCATATCAATTTTGC | 1022 |
| Wx_AR | GGAACTGGCAAGAAGGACTG | ||
| Wachsartige | Wx_BF | GCGTCGTCTCCGAGGTACAC | 870 |
| Wx_BR | GTCGAAGGACGACTTGAACC | ||
| Wachsartige | Wx_DF | CCATGGCCGTAAGCTAGAC | 1124 |
| Wx_DR | GTCGAAGGACGACTTGAACC |
Tabelle 1: Primer zur Verstärkung wachsartiver Gene in hexaploidem Weizen.
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Discussion
TILLING ist ein sehr wertvolles Reverse-Genetik-Tool für die Genvalidierung, insbesondere für kleine Körner, bei denen transformationsbasierte Ansätze gravierende Engpässe haben11. Die Entwicklung einer mutagenisierten Population mit einer hohen Mutationshäufigkeit ist einer der entscheidenden Schritte bei der Durchführung funktioneller Genomstudien. Der wichtigste Schritt bei der Entwicklung einer robusten TILLING-Population ist die Bestimmung der optimalen Konzentration von EMS. Die Überlebensrate von 40%-60% in der M1 ist ein guter Indikator für die Wirksamkeit der EMS-Mutagenese bei Weizen und Gerste4,6,18. Die überlebenden Pflanzen können anständige Mutationsfrequenzen bereitstellen, um Mutationen in jedem Gen von Interesse zu entdecken. Im Reis ist die Fruchtbarkeit der M1-Pflanze neben dem Überleben von M 1-Pflanzen ein weiterer Determinant und schwankt berichtend zwischen den verschiedenen Genotypen20.
Hexaploide Brotweizen und tetraploider Hartweizen haben aufgrund ihrer Polypoidie für die meisten Gene Homöoallele in jedem Genom und kompensieren den Funktionsverlust wichtiger Gene aufgrund von Mutationen. Dies wird als Genompufferung bezeichnet. So können Polyploide höhere Mengen an EMS-Dosen im Vergleich zu Diploiden aufgrund der Genompufferung21,22tolerieren. Es ist jedoch bekannt, dass die Toleranz verschiedener diploider Arten gegenüber Mutagenen variiert und durch die Vielfalt des genetischen Hintergrunds reguliert werden kann. So zeigte Ae. tauschii eine Überlebensrate von 55 % bei 0,6 % EMS, während T. monococcum eine Rate von 51 % mit 0,24 % EWS aufwies; darüber hinaus führte eine höhere Konzentration bei letzteren Arten zu einem übermäßigen Pflanzentod6,7. Wir haben bereits erlebt, dass auch bei Hexaploiden verschiedene Sorten unterschiedliche Mutagenkonzentrationen tolerieren (Daten werden nicht angezeigt). Darüber hinaus variiert die EMS-Toleranz erheblich zwischen den verschiedenen Reisgenotypen20. Daher wird dringend empfohlen, Dosierungskurven für den individuellen Genotyp von Interesse zu erhalten.
Um die Wirksamkeit der Mutagenese zu analysieren, sollten mehrere Arten von phänotypischen Mutanten vom Sämlingsstadium bis zur Reife einer TILLING-Population7,23,24sichtbar sein. Zu den phänotypischen Mutanten gehören Chlorina, Albinos, bunte Blätter, verkümmerte, breite/schmale Blätter, niedrige/hohe Bodenbearbeitung, früh/spät blühend, teilweise fruchtbar und steril. Jede Abweichung vom Typ Wildtyp phänotyp stellt eine potenzielle phänotypische Mutante dar.
Da G und C die primären Zielrückstände der EMS-Mutagenese sind, wird es je nach GC-Gehalt zu Verzerrungen in den Mutationsfrequenzen von Genen kommen. Eine Region mit höherem GC-Gehalt ergibt eine hohe Mutationshäufigkeit, während eine Region mit niedrigem GC-Gehalt eine niedrige Mutationshäufigkeit ergibt. Um die korrekte Mutationshäufigkeit einer TILLING-Population zu berechnen, wird daher vorgeschlagen, durchschnittlich zwei bis drei Gene mit unterschiedlichem GC-Gehalt zu erhalten oder die Mutationsrate auf einen 50% GC-Gehalt13zu normalisieren.
Das hier beschriebene Cel-1-Assay- und Agarose-Gel-basierte Protokoll sind einfache Methoden, die keine teure Instrumentierung oder komplexe Analyse erfordern. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Methode nur für den Mutationsnachweis in einigen wenigen Genen geeignet und effizient ist. Für das Screening von Mutationen in einem größeren Satz von Genen wird eine Multiplex-Amplikon-Sequenzierungsmethode empfohlen3,24. Für ein detailliertes Protokoll über multiple Amplicon-Sequenzierungsmethode können Leser auf Tsai et al.25 verweisen. Mit Fortschritten in der Sequenzierungstechnologie und reduzierten Kosten für die Sequenzierung wurden Plattformen wie die Exome-Erfassung verwendet, um Mutationen über eine ganzes Genom in der gesamten WeizenTILLING-Population17. Bei Pflanzen mit kleinen Genomen können sogar ganze Genome aller Individuen in der TILLING-Population sequenziert werden15,16. Die Kosten für das Screening aller Mutationen bei den Individuen einer bestimmten TILLING-Population machen es jedoch teuer, eine Vollgenomsequenzierung für eine Population durchzuführen, die für bestimmte Zwecke entwickelt wurde. Daher sind Cel-1-basierte Assays eine anständige Methode für die Durchführung einer reverse genetischen Validierung für eine begrenzte Anzahl von Kandidatengenen in jedem Labor mit regelmäßiger molekularbiologischer Instrumentierung. Nichtsdestotrotz ist die Wahl der Plattform für den Nachweis von Mutationen zweitrangig für die Entwicklung einer TILLING-Population, die mehrere Mutationen im gesamten Genom enthält. Daher ist der wichtigste Schritt im Protokoll die Entwicklung einer robusten TILLING-Population mit einer hohen Mutationshäufigkeit.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1016879 und Maryland Agricultural Experiment Station via MAES Grant No. 2956952 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
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