Summary
기재된 것은 돌연변이원으로서 에틸 메탄설포네이트(EMS)를 사용하는 작은 곡물 작물에서 게놈(TILLING) 집단의 표적화 유도국소 병변을 개발하기 위한 프로토콜이다. 또한 Cel-1 분석규를 이용한 돌연변이 검출프로토콜이 제공된다.
Abstract
게놈에서 유도된 국소 병변을 표적으로 하는 것은 (TILLING) 표적 유전자에 있는 화학적인 돌연변이 및 서열 변이의 탐지를 포함하는 강력한 역유전학 공구입니다. TILLING은 유전자 검증을 위한 매우 가치 있는 기능성 유전체학 도구로, 특히 변형 기반 접근법이 심각한 한계를 가지고 있는 작은 곡물에서 특히 중요합니다. 강력한 돌연변이 집단을 개발하는 것은 TILLING 기반 유전자 검증 연구의 효율성을 결정하는 열쇠입니다. 낮은 전반적인 돌연변이 빈도를 가진 TILLING 인구는 비실질적으로 큰 인구가 부족한 부족으로 이끌어 내는 인구에 있는 높은 사망으로 이끌어 내는 반면, 원하는 돌연변이를 찾아내는 것을 가려야 한다는 것을 표시합니다 돌연변이 된 개인의 수. 효과적인 인구가 개발되면 관심 있는 유전자에서 돌연변이를 감지하는 여러 가지 방법이 있으며 플랫폼의 선택은 실험 적 규모와 자원의 가용성에 달려 있습니다. 돌연변이 식별을 위한 Cel-1 분석 및 아가로즈 겔 기반 접근법은 편리하고 재현 가능하며 자원 집약적인 플랫폼입니다. 그것은 간단하다는 점에서 유리하다, 어떤 계산 지식을 필요로하지 않으며, 기본 실험실 장비를 가진 유전자의 소수의 유효성 검사에 특히 적합하다. 본 기사에서, 설명된 양호한 틸링 집단의 개발 방법은, 투여 곡선의 제조, 돌연변이 집단의 돌연변이 발생 및 유지, 및 PCR 기반 Cel-1 분석법을 이용한 돌연변이 집단의 스크리닝을 포함하는 것이다. .
Introduction
게놈에 있는 점 돌연변이는 연구원을 위한 많은 유용한 목적을 봉사할 수 있습니다. 그들의 성격 과 위치에 따라, 이 돌연변이는 관심 있는 단백질의 유전자 또는 명백한 도메인에 기능을 할당하기 위하여 이용될 수 있습니다. 한편, 새로운 유전적 변이의 근원으로서, 유용한 돌연변이는 자형질 나는 스크린을 사용하여 원하는 특성에 대해 선택될 수 있고 작물 개선에 더 많이 사용될 수 있다. TILLING은 표적 유전자에서 화학적 돌연변이 발생 및 서열 변이의 검출을 포함하는 강력한 역유전학 도구이다. 애기장대 1과 초록색 멜라노가스터2에서 처음 개발된 틸링 개체수는 헥사플로이드 빵 밀(Triticumaestivum)3, 보리(Hordeum vulgare)4,테트라포이드 듀럼 밀 (T.dicoccoides durum)5, 디플로이드 밀 (T.모노 코쿰)6 및 밀 Aegilops tauschii7의 "D"게놈 선조 . 이러한 자원은 비생물성 및 생물학적 스트레스 내성 조절 8, 개화 시간조절 9,영양적으로 우수한 작물 품종 을 개발하는 유전자의 역할을 검증하는 데 사용되었습니다5.
틸링, 에틸 메탄설포네이트 (EMS), 나트륨 아지드, N-메틸 -N-n-n-nitrosourea (MNU) 및 메틸 메탄 술포네이트 (MMS)와 같은 알킬라이팅 돌연변이 성 제제의 사용과 함께, 여러 가지 이유로 다른 역 유전학 도구에 비해 장점이 있습니다. 먼저, 돌연변이 발생은 거의 모든 종 또는 다양한 식물(10)에서 수행될 수 있으며, 변형 병목 현상과 무관하며, 이는 작은입자(11)의경우에 특히 도전적이다. 둘째, 다른 유전자 유효성 검사 접근법에 의해 수득될 수 있는 녹아웃 돌연변이를 생성하는 것 외에도, 관심 있는 단백질의 개별 도메인의 기능을 분별할수 있는 다양한 오센스 및 접합 돌연변이가 유도될 수 있다. 더욱이, 틸링은 게놈을 통하여 돌연변이의 불멸의 집합을 생성합니다; 따라서, 단일 집단은 다중 유전자의 기능적 검증을 위해 사용될 수 있다. 대조적으로, 그밖 역유전학 공구는 연구13의밑에 유전자에특정 자원을 생성합니다. TILLING을 통해 확인된 유용한 돌연변이는 번식 목적으로 전개될 수 있으며, 유전자 편집과 달리 많은 국가에서 비유전자 변형 분류가 아직 불확실하다는 규제의 대상이 되지 않습니다. 이것은 국제적으로 거래되는 작은 곡물과 특히 관련이있습니다14.
TILLING은 간단하고 효율적인 유전자 검증 전략이며 관심 있는 유전자를 조사하기 위해 돌연변이 집단을 개발해야 합니다. 효과적인 돌연변이 집단을 개발하는 것은 TILLING 기지를 둔 유전자 검증 연구 결과의 효율성을 결정하는 열쇠입니다. 낮은 전반적인 돌연변이 빈도를 가진 TILLING 인구는 비현실적으로 큰 인구가 원하는 돌연변이를 위해 가려져야 한다는 것을, 반면 높은 돌연변이 원 농도는 인구에 있는 높은 사망으로 이끌어 내고 부족한 수의 돌연변이 개인. 좋은 인구가 개발되면 관심있는 유전자에서 돌연변이를 감지하는 여러 가지 방법이 있으며 플랫폼의 선택은 실험 적 규모와 자원의 가용성에 달려 있습니다. 전체 게놈 시퀀싱 및 엑솜 시퀀싱은 작은 게놈15,16을가진 식물에서 틸링 집단의 모든 돌연변이를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 2개의 틸링 집단의 엑소메 시퀀싱은 빵과 듀럼 밀에서 수행되었으며 바람직한 돌연변이를 식별하고 관심 있는 돌연변이 라인을 주문하기 위한 대중에게 제공된다17. 그것은 바람직한 돌연변이의 가용성 측면에서 훌륭한 공공 자원입니다. 그러나, 유전자 검증 연구에서, 야생형 선은 관심 있는 후보 유전자를 소유해야 한다. 불행하게도, 다른 배경에서 몇 가지 후보 유전자의 역유전학 기반 유효성 검사를 위해 전체 틸링 집단의 엑소메를 서열화하는 것은 여전히 비용이 많이 든다. Amplicon 시퀀싱 및 Cel-1 기반 분석은 밀의 표적 집단에서 돌연변이를 검출하는 데 사용되어 왔으며, Cel-1 분석제는 더 간단하고 계산 지식이 필요하지 않으며, 기본유전자의 소수의 유효성 검사에 특히 적합합니다. 실험실장비 6,18.
본 기사에서, 설명된 양호한 틸링 집단의 개발을 위한 방법은, 투여 곡선의 제조, 돌연변이 집단의 돌연변이 생성 및 유지, 및 PCR 기반 Cel-1 분석법을 이용한 돌연변이 집단의 스크리닝을 포함하는 것이다. . 이 프로토콜은 이미 트리티쿰 aestivum, Triticum monoccocum6, 보리, Aegilops tauchii7,및 몇몇의 돌연변이 인구를 개발하고 활용하는 데 성공적으로 구현되었습니다. 다른. 여기에는 연구원이 틸링 인구를 개발하는 데 도움이되는 유용한 팁과 함께 이러한 방법의 명시적 세부 사항이 포함되어 있으며, EMS를 선택한 작은 곡물 식물에서 돌연변이 원으로 사용하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 효과적인 돌연변이 발생을 위한 투여 곡선의 준비
- 증류수 50mL를 함유한 6개의 250 mL 유리 플라스크(각 플라스크에 100개)에 100개의 씨앗을 담그십시오. 실온(RT)에서 100rpm에서 8시간 동안 흔들어 서 씨앗에 의한 침전을 위해 흔들어 주세요.
- 연기 후드에서, 0.167, 0.249, 0.331, 0.415 및 0.498 mL의 증류수를 용해시킴으로써 50 mL을 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%, 1.0%, 1.2%(emS) 용액을 준비한다.
참고: EMS는 RT의 액체이며 밀도는 1.206 g/mL입니다.
주의: EMS를 취급하는 동안 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오. - 5개의 플라스크에서 물을 데낸제와 imbibed seed를 함유하는 각 플라스크에 50 mL의 EMS 용액을 첨가하여 0.0%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%, 1.0%, 1.2% EMS 용액을 가진 6가지 치료법이 있습니다. 75 rpm 및 RT에서 16 시간 동안 플라스크를 흔들어주세요.
- EMS 용액을 데시드하고 치즈 천을 사용하여 각 처리에 대해 처리된 씨앗을 별도로 수집한다. 24시간 동안 EMS 비활성화 솔루션(0.1 M NaOH, 20% w/vNa2S2 O3)을 추가하여 사용한 EMS 솔루션을 비활성화합니다. 또한 오염된 플라스크및 파이펫 팁을 EMS 비활성화 솔루션으로 24시간 동안 처리하십시오.
- 흐르는 수돗물 에서 EMS 처리 된 씨앗을 2 시간 동안 씻으소서 각 씨앗을 포팅 토양을 포함하는 뿌리 트레이너로 개별적으로 이식하십시오.
- 16 시간 빛 기간 에서 20-25 °C에서 식물을 성장.
- 이식 후 15일 후 식물 생존에 대한 데이터를 기록합니다. 다음 방정식을 사용하여 각 치료의 생존율을 계산합니다.
참고 : 발아 율이 대조군에서 100 % 미만인 경우, 모든 치료법에서 정확한 생존율은 대조군에서 발아하지 못한 종자의 수를 뺀 후에 계산되어야합니다. 40%-60%의 생존율은 효과적인 돌연변이 발생을 위해 바람직하다. 40%-60%의 바람직한 치사율을 달성할 때까지 처리된 종자의 생존에 따라 변형된 농도로 제2 투여 최적화를 수행해야 할 수도 있다.
2. 돌연변이 집단의 돌연변이 발생 및 유지
- 300 mL 증류수를 함유한 5 개의 1,000 mL 플라스크에 동등하게 나누어 적어도 3,000 종자 (각 600 씨앗)의 최종 배치를 담그십시오. RT 에서 100 rpm에서 8 시간 동안 흔들어서 imbibition을하십시오.
참고 : 바람직한 인구의 최종 크기는 유전자형의 돌연변이 빈도와 ploidy 수준에 따라 달라집니다, 하지만 헥사 플로이드에 대한 적어도 3,000 씨앗을 사용하는 것이 좋습니다, 4,000 테트라 폴이드 씨앗, 그리고 이상 7,000 디플로이드 씨앗. - 연기 후드에서 증류수에 최적화된 EMS 농축 액의 1,500mL를 준비합니다.
- 플라스크에서 물을 배출하고 600 개의 임비브 씨앗을 함유 한 각 플라스크에 EMS 용액의 최적 농도 300 ml를 추가하십시오. 75 rpm 및 RT에서 16 시간 동안 플라스크를 흔들어줍니다.
- EMS를 장식하고 치즈 천에 처리 된 씨앗을 수집합니다. 1.4단계에서 수행된 EMS 비활성화 솔루션으로 EMS 솔루션 및 처리 용기를 비활성화합니다.
- 흐르는 수돗물 에서 EMS 처리 된 씨앗을 2 시간 동안 씻으소서. 각 EMS 처리 된 M1 씨앗을 뿌리 트레이너로 개별적으로 이식하십시오.
- M1 식물 (M0 종자에서 파생)을 20-25 °C에서 16 h 의 빛 주기 로 성장시.
참고: 관심있는 유전자형이 겨울형 성장 습관을 가지고 있는 경우, 4°C에서 6주 동안 두 잎 단계에서 묘목을 버게 해야 할 수도 있다. - M1 식물이 자가 수분되도록 하고, 각 비옥한 M1 식물에 대해 M2 씨앗을 따로 수확한다.
참고: 교차 가능성을 방지하려면 마취 전에 수분 봉투로 M1 식물의 스파이크를 덮습니다. - 유전적 중복을 피하기 위해 각 M1 식물에서 단일 M2 씨앗을 심습니다.
- 1.1 mL의 2잎 단계에서 M2 식물로부터 조직을 수집하여 96개의 웰 마이크로튜브를 올렸다. 각 식물에서 약 80mm의 잎 조직을 수집하고 조직 수집 계획에 각 샘플의 ID를 기록합니다.
- 동결 건조된 잎 조직을 동결건조시키고 -80°C에서 보관한다.
- M2 식물을 16시간 의 경유지 에서 20-25°C에서 유지한다.
- M2 식물의 돌연변이 표현형에 대한 데이터를 일정한 간격으로 기록합니다. 예상되는 표현형은 알비노, 염소, 잔디 싹, 다양한, 부분적으로 비옥한, 멸균 등입니다.
- M2 식물이 자체 비옥하고 성숙하도록 하십시오. M2 식물의 M3 씨앗을 별도로 수확하고 저장한다(그림 1).
참고 : M 씨앗은 역 유전학 연구에서 표현형을 검증하는 데 사용됩니다. 따라서 M은 시원하고 건조한 조건에서 신중하게 분류하고 보관해야 합니다. 또는, 종자 필드에서 증가해야하는 경우, 머리 행은 각 M 공장에 대해 심어 질 수 있으며, 각 행에서 M 씨앗은 TILLING 인구 자원으로 별도로 수확및 저장할 수 있습니다.
3. 돌연변이의 유전 적 특성에 대한 Cel-1 분석
- M2의 잎 조직에서 DNA를 추출하는 식물 DNA 추출 키트를 사용하여 DNA 정제 시스템(재료 표참조)을 사용하여 제조업체의 권장 사항에 따라.
- 분광광도계를 사용하여 DNA를 정량화하고 96 개의 우물 블록에서 뉴클레아제없는 물로 DNA 농도를 25 ng / μL로 정상화합니다.
참고 : 낮은 품질의 DNA (얼룩진 DNA)가 풀된 샘플에서 거짓 음성을 초래할 수 있으므로 젤에서 DNA를 실행하여 DNA의 품질을 확인하는 것이 중요합니다. - 각 샘플의 행 및 열 정체성을 유지하면서 4개의 96개의 우물 블록에서 DNA를 하나의 플레이트에 결합하여 4x DNA 풀을 만듭니다. 각 풀 플레이트가 4개의 다른 96개의 우물 블록에서 총 200 μL의 DNA를 잘 포함되도록 각 개별 샘플에서 50 μL의 DNA를 풀 플레이트에 추가합니다.
- 풀 플레이트 행 열 형식의 풀린 DNA 의 ID를 카탈로그로 지정합니다(예: 풀 1 A1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box3A1 + Box4A1).
- 게놈 특이적 프라이머[A1]를 사용하여 관심 있는 유전자에 대한 게놈 특이적 프라이머[A1]를 설계합니다. 디플로이드의 경우, 기본 설정을 사용하여 프라이머를 디자인할 때 프라이머 3&http://primer3.ut.ee/>를 사용하십시오. 필요한 경우 관심 있는 유전자의 전체 코딩 영역을 커버하기 위해 여러 프라이머를 설계합니다.
참고: 최신 IWGSC 어셈블리는 URGI BLAST 도구 & https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST>를 사용하여 밀에 관심 있는 유전자에 대한 서열을 얻는 데 사용할 수 있습니다. 최적 암프리카 길이는 800-1,500 bp의 범위입니다. 표 1은 헥사플로이드 밀에서 왁시 유전자에 대한 프라이머의 예를 나타낸다. - 다음과 같이 풀화 된 DNA에 유전자 특이적 프라이머에 대한 PCR을 실행하십시오.
- 5 μL의 PCR 버퍼, 4 μM 전방 및 역방향 프라이머의 2 μL(각), DNA 폴리머라제 0.1 μL(재료 표참조), 풀링된 DNA 템플릿 5 μL을 추가한 다음, 뉴클레아제 없는 물을 사용하여 부피를 25μL로 늘립니다.
- 터치 다운 프로파일을 사용하여 열 사이클러에서 PCR 반응을 실행하기: 1분 동안 95°C, 1분 동안 95°C의 7사이클, 67°C ~ 60°C의 사이클당 1°C, 2분 동안 72°C의 온도 감소와 함께 1분 동안 , 1 분 동안 95 °C의 30 사이클, 1 분 동안 60 °C, 2 분 동안 72 °C, 72 °C에서 7분 동안 최종 연장.
참고 : 위의 PCR 프로파일프라이머 3 기본 설정을 사용하여 설계 프라이머의 대부분밀 DNA 템플릿에서 작동합니다. 비특이적 증폭의 경우 다음 단계로 이동하기 전에 PCR 프로파일을 엄격하게 만들어야 합니다.
- 프로파일을 사용하여 열 사이클러에서 PCR 제품을 인큐베이팅하여 불일치DNA 사이의 이질성 을 생성: 2 분 동안 95 °C, 1 초에 대한 95 °C의 5 사이클, 95 °C ~ 85 °C 의 사이클 당 2 °C의 온도 감소, 및 85 °C ~ 25 °C의 60 사이클 사이클당 1°C의 감소.
- 홈메이드 Cel-1 endonuclease 2.5 μL을 이종 PCR 제품에 넣고 45°C에서 45분 동안 배양합니다. 0.5 M EDTA(pH 8.0)의 2.5 μL을 첨가하여 Cel-1 반응을 종료한다.
참고 : Cel-1 endonuclease는 Till et al.19에 의해 수행 된 프로토콜을 사용하여 신선한 셀러리 줄기에서 추출 할 수 있으며 이전에 특성이 있는 돌연변이를 사용하여 테스트 할 수있는 Cel-1 endonuclease의 활성 및 최적 양을 테스트하는 것이 매우 중요합니다. 또는 시판되는 돌연변이 검출 키트. - Cel-1 처리 된 제품을 3.0 % 아가로즈 젤에서 100 V에서 2.5 시간 동안 실행하십시오. 더 작고 독특한 갈라진 밴드를 포함하는 우물은, 전체 길이 삼촌 밴드 이외에, 돌연변이 DNA 견본을 포함할 것입니다.
- Denconvolute 돌연변이 풀.
- 3.9단계에서 확인된 돌연변이 풀을 구성하는 개별 M2 DNA 샘플에 대해 3.6, 3.7, 3.8 및 3.9단계를 따른다.
- 돌연변이체의 zygosity를 결정하기 위하여는, 개별적인 M2 DNA를 위한 2개의 PCR (단계 3.6에서 기술된 대로)를 실행하십시오, 있는 첫번째 반응은 M2 DNA의 2.5 μL 및 2.5 μL의 야생 형 DNA를 포함하고 두 번째 반응은 M2 DNA의 단지 5 μL을 포함합니다. 돌연변이가 헤테로지구스인 경우, 두 반응 모두에서 추가적인 갈라진 밴드가 존재할 것이다. 한편, 돌연변이가 동형화골인 경우, 추가적인 절단 밴드는 첫 번째 반응에서만 발견될 것이다.
- 돌연변이의 본질을 확인하기 위하여는, 제조자의 지시에 따라 Sanger 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 확인된 돌연변이체의 PCR 제품을 순서.
4. 돌연변이 빈도 계산
참고: TILLING 집단의 돌연변이 빈도는 해당 집단의 개인에서 하나의 돌연변이가 발생하는 평균 물리적 거리를 말합니다. 예를 들어, TILLING 집단에서 1/35 kb의 돌연변이 빈도는 해당 집단의 평균 개인이 게놈에서 35kb마다 1개의 돌연변이를 가지고 있음을 의미합니다.
- TILLING 모집단의 돌연변이 빈도를 확인하려면 스크리닝된 염기의 총 수를 계산합니다.
- 선별된 염기의 총 수를 계산하려면 PCR 제품 크기에 선별된 총 인원수를 곱합니다.
- 주어진 TILLING 집단에서 1개의 돌연변이를 소유하는 물리적 영역을 산출할 다음 방정식을 사용하여 관찰된 고유 돌연변이의 수로 선별된 염기의 총 수를 나눈다.
참고: 아가로즈 겔 기반 플랫폼을 기반으로 양쪽 끝에서 50bp의 분해능 제한을 고려하려면 계산에서 제품 크기에서 100bp를 뺍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 2는 헥사플로이드 빵 밀 품종 재거, 디플로이드 밀 트리티쿰 모노코쿰6,및 밀 Aegilops 타우스키이의게놈 공여자의 투여 곡선을 나타낸다. 원하는 50% 생존율에 대한 EMS 투여량은 각각 T. 모노코쿰, Ae. 타우스키,및 T. aestivum에대해 약 0.25%, 0.6% 및 0.7%였다. 헥사플로이드 밀의 EMS 내성이 높을수록 게놈 버퍼링 용량이 있습니다. 그러나, 둘 다 diploid인에도 불구하고, T. monococcum의 EMS 내성은 Ae. tauschii의 거의 반이었습니다. 따라서, 이들 결과는 관심있는 개별 유전자형에 대한 적절한 EMS 투여량을 결정하는 것의 중요성을 강조한다.
M2 집단에서 쉽게 식별 가능한 표현형의 존재는 작은 곡물 집단에서 돌연변이 발생의 효과를 확인한다. 돌연변이 표현형은 전형적으로 알비노, 염소, 기절, 풀이 많은 사격, variegateed, 초기/늦게 꽃, 부분적으로 비옥하고, 살균을 포함합니다. 도 3은 틸링 집단에서 수득된 몇 가지 전형적인 돌연변이 표현형을 나타낸다.
돌연변이 식별을 위한 Cel-1 분석 및 아가로즈 겔 기반 접근법은 편리하고 재현 가능하며 자원 집약적인 플랫폼입니다. 도 4는 아가로즈 겔 플랫폼에서 Cel-1을 이용한 돌연변이 식별을 나타낸다. 돌연변이 DNA 차선은 절단 된 밴드의 독특한 패턴을 포함하고 있음을 주목해야한다. 4x 풀 스크리닝의 첫 번째 라운드는 노동 요구, 자원 및 시간 지출을 줄입니다. 예를 들어, 도 4A에도시된 바와 같이, 1개의 돌연변이 풀은 PCR 및 Cel-1 분석을 수행함으로써 48명의 개인을 나타내는 12개의 풀화 된 샘플 에서 확인되었다. 돌연변이 풀의 감소는 돌연변이의 zygosity를 결정하고 개별 적인 견본에 돌연변이를 추적하는 것을 도왔습니다 (그림4B,C). 도 3B는 박스 4-A4 및 박스 4-A4+ 야생형 DNA 샘플 모두에 존재하는 독특한, 갈라진 밴드로서 A4 풀에서 이형균 돌연변이의 검출을 나타낸다. 다른 한편으로는, H5 풀은 독특한, 갈라진 밴드가 상자 5-H5 + 야생형 DNA 샘플에만 존재하는 동형 균 돌연변이를 함유하였다.
그림 1: 작은 곡물 작물에서 EMS 돌연변이 를 개발하는 틸링 인구를 개발하는 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 트리티쿰 에스티움,T.모노코쿰,및 에질롭스 타우스키를포함하는 3종의 밀에서 EMS 투여곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 다양한 작은 입자 M2 틸링 집단에서 돌연변이 표현형(노란색 화살표). (A) 보리 M2 집단에서 알비노 돌연변이체, (B) 보리 M2 집단에서 염소 돌연변이체, (C) Ae. tauschii M2 집단에서 분홍색 변색을 가진 변이체, 및 (D) T. 모노코쿰에서 낮은 경운 돌연변이체 M2 인구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: Cel-1 분석및 아가로즈 겔 기반 접근법을 이용한 데톤볼루션 후 4x 풀에서 돌연변이 식별. 도시된 (A) 차선 7의 돌연변이 풀은 독특한 갈라진 밴드가 있는, (B) 이형 돌연변이 풀의 데콘볼루션, 상자 4-A4 및 Box 4-A4+ 야생형 DNA 샘플에서 독특한 갈라진 밴드가 있는 DNA Box 4의 A4 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것으로 나타났다. 및 ,(C) 동형 돌연변이체의 감소, 상자 5-H5+ 야생형 DNA 샘플에서만 독특한 절단 밴드를 가진 DNA Box 5의 H5 샘플에서 돌연변이를 검출한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 프라이머 이름 | 프라이머 시퀀스 (5'-3') | 제품 크기 |
| 밀랍 | Wx_AF | TCGCTGCATATTGC | 1022년 |
| Wx_AR | 가액그카아가가가그 | ||
| 밀랍 | Wx_BF | GCGTCGCTCCGAGGACAC | 870 |
| Wx_BR | GTCGAAGGACGTGAACC | ||
| 밀랍 | Wx_DF | CCATGGCCGTAGCTAGAC | 1124년 |
| Wx_DR | GTCGAAGGACGTGAACC |
표 1: 헥사프로이드 밀에서 왁시 유전자를 증폭시키는 프라이머.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TILLING은 유전자 검증을 위한 매우 가치 있는 역유전학 도구이며, 특히 변형 기반 접근법이 심각한 병목 현상이 있는 작은 곡물의 경우11. 높은 돌연변이 빈도로 돌연변이 집단을 개발하는 것은 기능적 유전체학 연구를 수행하는 데 중요한 단계 중 하나입니다. 강력한 TILLING 인구를 개발하는 데 가장 중요한 단계는 EMS의 최적의 농도를 결정하는 것입니다. M1에서 40%-60%의 생존율은 밀과 보리에서 EMS 돌연변이 발생의 효과에 대한 좋은 지표로 밝혀졌다 4,6,18. 살아남은 식물은 관심있는 어떤 유전자든지에 있는 돌연변이를 발견하는 것을 돕도록 괜찮은 돌연변이 주파수를 제공할 수 있습니다. 쌀에서, M1 식물의 비옥은 M1 식물의 생존외에 또 다른 결정요인이며, 다른 유전자형(20)에 따라 변화하는 것으로 보고되고 있다.
헥사플로이드 빵 밀과 테트라펠로이드 듀럼 밀은 다각형 으로 인해 대부분의 유전자에 대해 각 게놈에 동종 알레알을 가지고 돌연변이로 인한 중요한 유전자의 기능 상실을 보상합니다. 이를 게놈 버퍼링이라고 합니다. 따라서, polyploids는 게놈 버퍼링21,22때문에 디플로이드에 비해 EMS 복용량의 상부를 견딜 수 있습니다. 그러나, 돌연변이원에게 다른 디플로이드 종의 내성이 변화하고 유전 적 배경의 다양성에 의해 조절 될 수 있다는 것을 알려져있다. 예를 들어, Ae. tauschii는 0.6% EMS에서 55%의 생존율을 보였고, 반면 T. 모노코쿰은 0.24% EMS로 51%의 비율을 보였습니다. 또한, 후자의 종에서 어떤 높은 농도과도한 식물 죽음으로 이어졌다 6,7. 우리는 이전에 헥사 플로이드에서도 다른 품종이 다른 돌연변이 원 농도를 견딜 수 있음을 경험했습니다 (데이터가 표시되지 않음). 더욱이, EMS 내성은 다른 쌀 유전자형20사이에서 현저하게 변화한다. 따라서, 관심의 개별 유전자형에 대 한 복용량 곡선을 얻기 위해 매우 좋습니다.
돌연변이 발생의 효능을 분석하기 위해, 표현형 돌연변이의 여러 유형은 틸링 인구7,23,24의성숙에 모종 단계에서 볼 수 있어야합니다. 주의해야 할 현상형 돌연변이에는 염소, 알비노, 다양한 잎, 기절, 넓고 좁은 잎, 낮은 / 높은 경작, 초기 / 늦은 꽃, 부분적으로 비옥한 및 멸균이 포함됩니다. 야생형 표현형으로부터의 임의의 편차는 잠재적인 표현형 돌연변이를 나타낸다.
G와 C는 EMS 돌연변이 발생의 1 차적인 표적 잔기이기 때문에, GC 함량에 따라 유전자의 돌연변이 주파수에 편향이 있을 것이다. GC 함량이 높은 영역은 높은 돌연변이 주파수를 산출하는 반면, GC 함량이 낮은 영역은 낮은 돌연변이 주파수를 산출합니다. TILLING 집단의 정확한 돌연변이 빈도를 계산하기 위해, 따라서 다양한 GC 함량을 갖는 2~3개의 유전자의 평균을 얻거나50% GC 함량(13)으로 돌연변이의 속도를 정상화하는 것이 제안된다.
여기서 설명된 Cel-1 분석 및 아가로즈 겔 기반 프로토콜은 값비싼 계측 또는 복잡한 분석이 필요하지 않은 간단한 방법이다. 그러나,이 방법은 몇 가지 유전자에서 돌연변이 검출에 적합하고 효율적이라는 점에 유의해야합니다. 더 큰 유전자 세트에서 돌연변이를 스크리닝하는 경우, 멀티플렉스 앰플리온 시퀀싱 방법이3,24. 다중 앰플리코 시퀀싱 방법에 대한 자세한 프로토콜의 경우, 독자는 Tsai 등25시 서열 분석 기술의 발전과 시퀀싱 비용 절감, 엑소메 포획과 같은 플랫폼이 돌연변이를 특성화하는 데 사용되어 왔습니다. 전체 밀 틸링 인구17에서전체 게놈. 작은 게놈을 가진 식물의 경우, 틸링 집단에 있는 모든 개별의 전체 게놈조차15,16순서가 될 수 있다. 그러나, 주어진 TILLING 인구의 개별에 있는 모든 돌연변이를 검열하는 비용은 특정 목적을 위해 개발된 인구를 위한 전체 게놈 순서를 고가로 능력을 발휘합니다. 따라서, 정규 분자 생물학 계측을 가진 어떤 실험실든지에 있는 후보 유전자의 한정된 수에 대한 역유전학 기지를 둔 검증을 능력을 발휘하기 위하여, Cel-1 기지를 둔 분석사는 선택의 괜찮은 방법입니다. 그럼에도 불구하고, 돌연변이의 검출을 위한 플랫폼의 선택은 게놈을 통하여 다중 돌연변이를 항구하는 TILLING 인구를 개발하는 이차적입니다. 따라서, 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 높은 돌연변이 주파수를 가진 강력한 틸링 집단의 개발이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 농무부 국립 식품 농업 연구소에 의해 지원되었다, 해치 프로젝트 1016879 및 MAES 그랜트 No. 2956952를 통해 메릴랜드 농업 실험 역.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R.
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L.
