Summary
Beschreven is een protocol voor het ontwikkelen van een gerichte lokale laesies bij Genomes (TILLING) populatie in kleine graangewassen met gebruik van ethyl methanesulfonaat (EMS) als een mutageen. Ook voorzien is een protocol voor mutatie detectie met behulp van de cel-1 test.
Abstract
Gerichte lokale laesies IN Genomes (TILLING) is een krachtige reverse genetics tool die chemische mutagenese en detectie van sequentie variatie in doel genen omvat. TILLING is een zeer waardevol functioneel Genomics-instrument voor genvalidering, vooral in kleine korrels waarin op transformatie gebaseerde benaderingen ernstige beperkingen hebben. Het ontwikkelen van een robuuste, gemutageniseerde populatie is de sleutel tot het bepalen van de efficiëntie van een op TILLING gebaseerd gen-valideringsonderzoek. Een TILLING populatie met een lage totale mutatiefrequentie geeft aan dat een onpraktisch grote populatie moet worden gescreend om gewenste mutaties te vinden, terwijl een hoge mutagene concentratie leidt tot een hoge sterfte in de populatie, wat leidt tot een onvoldoende aantal mutageen personen. Zodra een effectieve populatie is ontwikkeld, zijn er meerdere manieren om mutaties in een gen van belang te detecteren, en de keuze van het platform is afhankelijk van de experimentele schaal en beschikbaarheid van middelen. De cel-1 assay en agarose gel-gebaseerde aanpak voor Mutante identificatie is handig, reproduceerbaar en een minder hulpbronnen intensief platform. Het is voordelig omdat het eenvoudig is, zonder computationele kennis, en het is vooral geschikt voor validatie van een klein aantal genen met basis labapparatuur. In dit artikel worden de methoden beschreven voor de ontwikkeling van een goede TILLING populatie, met inbegrip van de bereiding van de doserings curve, mutagenese en het onderhoud van de Mutante populatie, en screening van de Mutante populatie met behulp van de PCR-gebaseerde cel-1 test .
Introduction
Puntmutaties in genomen kunnen vele nuttige doeleinden voor onderzoekers dienen. Afhankelijk van hun aard en locatie kunnen deze mutaties worden gebruikt om functies toe te wijzen aan genen of zelfs afzonderlijke domeinen van eiwitten die van belang zijn. Aan de andere kant kunnen, als bron van nieuwe genetische variatie, nuttige mutaties worden geselecteerd voor gewenste eigenschappen met behulp van fenotypscreens en verder gebruikt bij gewas verbetering. TILLING is een krachtige reverse genetics tool die chemische mutagenese en detectie van sequentie variatie in het doel gen omvat. Voor het eerst ontwikkeld in Arabidopsis1 en drosophilia melanogaster2, zijn Tilling populaties ontwikkeld en gebruikt in veel kleine graangewassen zoals Braam brood tarwe (Triticum aestivum)3, gerst (Hordeum vulgare)4, tetraploïde durumtarwe(t. dicoccoides durum)5, diploïde tarwe (t. monococcum)6 en de "D" genoom voorlopercellen van tarwe aegilops tauschii7 . Deze middelen zijn gebruikt om de rollen van genen te valideren bij het reguleren van abiotische en biotische stress tolerantie8, het reguleren van bloeitijd9, en het ontwikkelen van nutritioneel superieure gewas rassen5.
Tilling, samen met het gebruik van alkylerende mutagene agentia zoals ethyl methanesulfonaat (EMS), natrium azide, n-methyl-N-nitrosourea (mnu), en methyl methanesulfonaat (MMS), heeft voordelen ten opzichte van andere reverse genetics tools om verschillende redenen. Ten eerste kan mutagenese worden uitgevoerd op nagenoeg elke soort of variëteit van plant10 en is deze onafhankelijk van het knelpunt bij de transformatie, wat in het geval van kleine korrels11bijzonder uitdagend is. Ten tweede kan naast het genereren van Knockout-mutaties die kunnen worden verkregen door andere genvalidatiebenaderingen, een reeks missense en splicing-mutaties worden geïnduceerd, die functies van afzonderlijke domeinen van de eiwitten van belang kunnen onderscheiden12. Bovendien genereert TILLING een onsterfelijke verzameling van mutaties in het genoom; Zo kan een enkele populatie worden gebruikt voor functionele validatie van meerdere genen. Andere tools voor reverse genetica genereren daarentegen alleen middelen die specifiek zijn voor het gen in studie13. Nuttige mutaties geïdentificeerd door middel van BETEGELING kunnen worden ingezet voor fokdoeleinden en zijn niet onderworpen aan regulering, in tegenstelling tot het bewerken van genen, waarvan de niet-transgene classificatie in veel landen nog onzeker is. Dit wordt vooral relevant voor kleine granen die internationaal worden verhandeld14.
TILLING is een eenvoudige en efficiënte genvaliderings strategie en vereist dat mutagenized populaties worden ontwikkeld voor het onderzoeken van genen van belang. Het ontwikkelen van een effectieve gemutageniseerde populatie is de sleutel tot het bepalen van de efficiëntie van een op TILLING gebaseerd gen-valideringsonderzoek. Een TILLING populatie met een lage totale mutatiefrequentie geeft aan dat een onpraktisch grote populatie moet worden gescreend op gewenste mutaties, terwijl een hoge mutagene concentratie leidt tot een hoge sterfte in de populatie en een ontoereikend aantal mutagenized personen. Zodra een goede populatie is ontwikkeld, zijn er meerdere manieren om mutaties in de genen van belang te detecteren, en de keuze van het platform is afhankelijk van de experimentele schaal en beschikbaarheid van middelen. Hele genoom sequentiëren en exoomsequencing sequencing zijn gebruikt om alle mutaties in Tilling populaties in planten met kleine genomen15,16te karakteriseren. Exome sequencing van twee TILLING populaties is uitgevoerd in brood en durumtarwe en is beschikbaar voor het publiek voor het identificeren van gewenste mutaties en het bestellen van mutant lijnen van belang17. Het is een grote openbare bron in termen van beschikbaarheid van wenselijk mutaties; in genvaliderings studies moet de wild-type lijn echter het kandidaatgen bezitten dat van belang is. Helaas is het nog steeds kosten-prohibitief om de exoomsequencing van de hele TILLING populatie te sequenties voor reverse-genetica gebaseerde validering van enkele kandidaatgenen op een andere achtergrond. Amplicon-sequencing en cel-1-gebaseerde assays zijn gebruikt bij het opsporen van mutaties in gerichte populaties in tarwe, en cel-1-assays zijn eenvoudiger, vereisen geen computationele kennis en zijn vooral geschikt voor validatie van een klein aantal genen met basis labomateriaal6,18.
In dit artikel worden beschreven methoden voor de ontwikkeling van een goede TILLING populatie, met inbegrip van de bereiding van de doserings curve, mutagenese en onderhoud van de Mutante populatie, en screening van de Mutante populatie met behulp van de PCR-gebaseerde cel-1 test . Dit protocol is al met succes geïmplementeerd in de ontwikkeling en het gebruik van mutageen populaties van Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, gerst, aegilops tauchii7, en verschillende Anderen. Inbegrepen zijn expliciete details van deze methoden, samen met nuttige tips die onderzoekers helpen bij het ontwikkelen van TILLING-populaties, het gebruik van EMS als een mutagene stof in een kleine graan plant naar keuze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de doserings curve voor effectieve mutagenese
- Week 100 zaden met het genotype van belang in de glazen kolven van 6 250 mL (100 in elke kolf) met 50 mL gedistilleerd water. Schud bij 100 rpm voor 8 uur bij kamertemperatuur (RT) voor imbibitie door de zaden.
- Bereid in een rook afzuigkap 50 mL 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0%, en 1,2% (w/v) ethylmethanesulfonaat (EMS) oplossing door respectievelijk het oplossen van 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 en 0,498 mL EMS in gedistilleerd water.
NB: EMS is vloeibaar bij RT met een dichtheid van 1,206 g/mL.
Let op: gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) tijdens het hanteren van EMS. - Giet het water uit vijf kolven en voeg 50 mL EMS-oplossing toe in elke kolf die een imbibedzaad bevat, zodat er zes verschillende behandelingen zijn met 0,0%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% en 1,2% EMS-oplossing. Schud kolven voor 16 uur bij 75 rpm en RT.
- Decanleer de EMS-oplossing en verzamel de behandelde zaden voor elke behandeling afzonderlijk met behulp van kaasdoek. De gebruikte EMS-oplossing deactiveren door één volume EMS-inactiverende oplossing (0,1 M NaOH, 20% w/v na2S2O3) voor 24 uur toe te voegen. Behandel de verontreinigde kolven en pipetpunten ook met de EMS-inactiverende oplossing voor 24 uur.
- Was de EMS behandelde zaden onder stromend kraanwater voor 2 h. transplantatie elk zaad afzonderlijk in root trainers die potgrond bevatten.
- Kweek planten bij 20 – 25 °C onder een licht periode van 16 uur.
- Registreer gegevens over de overleving van de plant na 15 dagen transplantatie. Gebruik de volgende vergelijking om het overlevingspercentage voor elke behandeling te berekenen:
Opmerking: als de kiemkracht lager is dan 100% in de controles, moeten de nauwkeurige overlevingspercentages in alle behandelingen worden berekend na aftrek van het aantal zaden dat niet ontkieming in de controles. Een overlevingspercentage van 40% – 60% is wenselijk voor een doeltreffende mutagenese. Het kan nodig zijn om een tweede ronde van de dosering optimalisatie met een gemodificeerde concentratie volgens het voortbestaan van de behandelde zaden uit te voeren tot het bereiken van de gewenste letaliteit van 40% – 60%.
2. mutagenese en onderhoud van de Mutante populatie
- Dompel de laatste partij van ten minste 3.000 zaden die gelijkelijk verdelen (600 zaden) in flacons van 5 1.000 mL met 300 mL gedistilleerd water. Schud voor 8 uur bij 100 RPM onder RT voor imbibition.
Opmerking: de uiteindelijke grootte van de gewenste populatie zal afhangen van de mutatiefrequentie en het ploïdie niveau van het genotype, maar het is raadzaam om ten minste 3.000 zaden te gebruiken voor hexaploïden, 4.000 zaden voor tetraploïden en meer dan 7.000 zaden voor diploïden. - Bereid in een rook afzuigkap 1.500 mL van de geoptimaliseerde EMS-concentratie oplossing in gedistilleerd water.
- Giet het water uit de kolven en voeg 300 ml van de optimale concentratie van EMS-oplossing toe in elke kolf met 600 drinken zaden. Schud de kolven gedurende 16 uur bij 75 rpm en RT.
- Decaner het EMS en verzamel de behandelde zaden in kaasdoek. Inactiveren van de EMS-oplossing en behandelings containers met EMS-inactiverende oplossing zoals gedaan in stap 1,4.
- Was de EMS behandelde zaden onder stromend kraanwater voor 2 h. transplantatie elk met EMS behandelde M1 zaad afzonderlijk in root trainers.
- Kweek M1 planten (afgeleid van M0 zaden) bij 20 – 25 °c onder een licht periode van 16 uur.
Opmerking: het kan nodig zijn om de zaailingen in de twee blad fase te Verdoe-Ken gedurende 6 weken bij 4 °C, als het genotype van belang een groei gewoonte van het winter type heeft. - Laat de M1 planten zelf bestuiven en oogst de m2 zaden afzonderlijk voor elke vruchtbare m1 plant.
Opmerking: om de kans op mogelijke overkruising te vermijden, bedek de pieken van M1 planten met bestuiving zakken voor anthesis. - Plant een enkel M2 -zaad van elke m1 -plant om genetische redundantie te voorkomen.
- Verzamel weefsel van M2 planten in de twee-bladige fase in 1,1 ml van pijnigde 96 well microtubes. Verzamel ongeveer 80 mm blad weefsel van elke plant en noteer de ID van elk monster in een weefsel verzamelplan.
- Vriesdroog het blad weefsel met behulp van een lyofilisator en bewaar bij-80 °c.
- Houd de M2 planten bij 20 – 25 °c onder een licht periode van 16 uur.
- Registreer met regelmatige tussenpozen gegevens over Mutante fenotypes van de M2 -planten. De verwachte fenotypes zijn Albino, chlorina, gras shoot, gemêleerde, deels vruchtbaar, steriel, enz.
- Laat de M2 planten zichzelf bevruchten en rijpen. Afzonderlijk oogsten en de M3 zaden van de M2 planten opslaan (Figuur 1).
Opmerking: M zaden worden gebruikt voor het valideren van het fenotype in reverse genetica studies. Daarom moet M zorgvuldig worden gecatalogeerd en opgeslagen onder koele en droge omstandigheden. Als alternatief, als het zaad moet worden verhoogd in veld, hoofd rijen kunnen worden geplant voor elke M-plant, en M zaden van elke rij kunnen worden geoogst en afzonderlijk opgeslagen als de TILLING populatie resource.
3. cel-1 test voor genetische karakterisering van mutanten
- Extract DNA uit het blad weefsel van M2 met behulp van een PLANTaardige DNA-extractie Kit met een DNA-zuiveringssysteem (Zie tabel met materialen) volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Kwantificeer DNA met behulp van een spectrofotometer en Normaliseer de DNA concentraties tot 25 ng/μL met Nuclease vrij water in 96 goed blokken.
Opmerking: het is belangrijk om de kwaliteit van het DNA te controleren door het op een gel uit te voeren, omdat DNA van lage kwaliteit (smeared DNA) kan resulteren in valse negatieven in gepoolde monsters. - Creëer 4x DNA Pools door DNA te combineren van 4 96 goed blokken in één plaat, terwijl de rij-en kolom identiteit van elk monster behouden blijft. Voeg 50 μL DNA van elk afzonderlijk monster in de pool plaat, zodat elke pool plaat goed een totaal van 200 μL DNA bevat uit vier verschillende 96 goed blokken.
- Catalogus de identiteit van het gepoolde DNA in het formaat van pool plaat-rij-kolom (bijvoorbeeld pool 1 a1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1).
- Ontwerp genoom-specifieke primers [a1] voor het gen van belang met behulp van de Genome specific primers (GSP) pagina < https://probes.pw.usda.gov/GSP > met standaardinstellingen voor polyploïde soorten. Gebruik voor diploïden primer 3 < http://primer3.UT.ee/> voor het ontwerpen van primers met standaardinstellingen. Ontwerp meerdere primers, indien nodig, om de volledige coderende regio van het gen van belang te bedekken.
Opmerking: de nieuwste IWGSC-assemblage kan worden gebruikt om sequenties te verkrijgen voor het gen van interesse in tarwe met behulp van de URGI BLAST-tool < https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/BLAST >. De optimale ampliconlengte voor temp lengte is in het bereik van 800 – 1500 BP. tabel 1 toont voorbeelden van primers voor wasachtige-genen in hexaploïde tarwe. - Voer als volgt een PCR uit voor genspecifieke primers op gepoolde DNA:
- Voeg 5 μL PCR-buffer, 2 μL (elk) van 4 μM voorwaartse en omgekeerde primers, 0,1 μL van de DNA-polymerase (Zie tabel met materialen), 5 μl gepoolde DNA-template toe en verhoog vervolgens het volume met behulp van Nuclease-vrij water tot 25 μl.
- Gebruik een aanraak profiel om de PCR-reactie op een thermische cycler als volgt uit te voeren: 95 °C gedurende 1 minuut, zeven cycli van 95 °C gedurende 1 minuut, 67 °C tot 60 °C gedurende 1 minuut met temperatuurdalingen van 1 °C per cyclus en 72 °C gedurende 2 min. , gevolgd door 30 cycli van 95 °C gedurende 1 minuut, 60 °C gedurende 1 minuut, 72 °C gedurende 2 minuten en eind verlenging bij 72 °C gedurende 7 minuten.
Opmerking: boven PCR profiel werkt op tarwe DNA template voor de meeste primers ontworpen met behulp van primer 3 standaardinstellingen. In het geval van niet-specifieke versterking, moet PCR-profiel worden streng gemaakt voordat u doorgaat naar de volgende stappen.
- Genereer heteroduplexen tussen niet-overeenkomende DNA door PCR-producten in thermische cycler te gebruiken met profiel als volgt: 95 °C gedurende 2 minuten, vijf cycli van 95 °C gedurende 1 s, 95 °C tot 85 °C gedurende 1 minuut met temperatuurdalingen van 2 °C per cyclus, en 60-cycli van 85 °C tot 25 °C met dalingen van 1 °C per cyclus.
- Voeg 2,5 μL zelfgemaakte cel-1-endonuclease toe aan de heteroduplexed PCR-producten en inincuberen voor 45 min bij 45 °C. Beëindig de cel-1-reactie door toevoeging van 2,5 μL van 0,5 M EDTA (pH 8,0).
Opmerking: cel-1-endonuclease kan worden geëxtraheerd uit verse Selderij stengels met behulp van het protocol uitgevoerd door till et al.19 het is zeer belangrijk om de activiteit en de optimale hoeveelheid cel-1-endonuclease te testen, die kan worden getest met behulp van eerder gekarakteriseerde mutanten of een in de handel verkrijgbare mutatie detectiekit. - Voer de cel-1 behandelde producten uit op een 3,0% agarose gel bij 100 V voor 2,5 h. De putten met kleinere en unieke gecleaved band (en), naast de volledige uncleaved bands, zullen het Mutante DNA monster bevatten.
- Denconvolute Mutant zwembaden.
- Volg de stappen 3,6, 3,7, 3,8 en 3,9 voor individuele M2 DNA-monsters die de Mutant Pools vormen die in stap 3,9 zijn geïdentificeerd.
- Om de zygositeit van mutanten te bepalen, voert u twee PCR (zoals beschreven in stap 3,6) uit voor individueel M2 -DNA, waarbij de eerste reactie 2,5 ΜL van m2 -DNA en 2,5 ΜL wild-type DNA bevat en de tweede reactie slechts 5 μL m2 -DNA bevat. Als de mutatie heterozygoot is, zal in beide reacties een extra gespleten band aanwezig zijn. Aan de andere kant zullen er alleen in de eerste reactie extra gespleten banden worden gevonden als de Mutant homozygoot is.
- Om de aard van de mutatie te identificeren, volg de PCR-producten van de bevestigde mutanten met behulp van een Sanger-sequencing platform volgens de instructies van de fabrikant.
4. berekening van de mutatiefrequentie
Opmerking: mutatiefrequentie van een TILLING populatie verwijst naar de gemiddelde fysieke afstand waarin één mutatie voorkomt bij de individuen van die populatie. Een mutatiefrequentie van 1/35 kB in een kantel populatie betekent bijvoorbeeld dat een gemiddelde persoon van die populatie 1 mutatie per elke 35 kB in het genoom bezit.
- Om de mutatiefrequentie van een kantel populatie te bepalen, berekent u het totale aantal gescreende basen.
- Om het totale aantal gescreende basen te berekenen, vermenigvuldigt u de PCR-product grootte met het totale aantal gescreende personen.
- Verdeel het totale aantal basen dat wordt afgeschermd door het aantal unieke mutaties waargenomen met behulp van de volgende vergelijking, die de fysieke regio zal opleveren die 1 Mutatie in de gegeven TILLING populatie bezit:
Opmerking: om rekening te houden met de beperking in de resolutie van 50 BP aan beide uiteinden op basis van een op agarose gel gebaseerd platform, trekt u 100 BP af van de product grootte in de berekening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont de doserings curve van Braam brood tarwe cultivar Jagger, diploïde tarwe Triticum monococcum6, en een genoom donor van tarwe aegilops tauschii7. De EMS doses voor gewenste 50% overlevingskansen waren ongeveer 0,25%, 0,6% en 0,7% voor t. monococcum, AE. tauschii, en t. aestivum, respectievelijk. De hogere EMS-tolerantie van Braam tarwe is te wijten aan de genoom buffercapaciteit. Echter, ondanks het feit dat beide diploïde, EMS tolerantie van T. monococcum was bijna de helft van die van AE. tauschii. Daarom onderstrepen deze resultaten het belang van het bepalen van de juiste EMS-dosis voor individuele genotypen van belang.
De aanwezigheid van gemakkelijk identificeerbare fenotypes in de M2 populatie bevestigt de effectiviteit van mutagenese bij kleine graan populaties. De Mutante fenotypes omvatten meestal Albino, chlorina, onvolted, gras shoot, gemêleerde, vroege/late bloei, deels vruchtbaar en steriel. Figuur 3 toont een aantal typische Mutante fenotypes verkregen bij de Tilling populaties.
De cel-1 assay en agarose gel-gebaseerde aanpak voor Mutante identificatie is handig, reproduceerbaar en minder hulpbronnen intensief platform. Figuur 4 toont een gemuteerde identificatie met cel-1 op agarose-gelplatformen. Opgemerkt moet worden dat mutant DNA Lanes unieke patronen van gesplitst band bevatten. De eerste ronde van 4x zwembad screening vermindert arbeids behoeften, middelen en tijd uitgaven. Zoals weergegeven in figuur 4a, werd een mutant pool bijvoorbeeld geïdentificeerd uit 12 gepoolde monsters die 48 individuen vertegenwoordigden door PCR en de cel-1 test uit te voeren. De deconvolutie van Mutante Pools bepaalden de zygositeit van de mutatie en hielpen bij het volgen van de mutatie tot individuele monsters (figuur 4b,C). Figuur 3b toont de detectie van heterozygoot mutaties in de A4-groep, aangezien unieke, gesplitst bands aanwezig zijn in zowel Box 4-A4 als Box 4-A4 + wild-type DNA-samples. Aan de andere kant bevatte de H5-groep homozygoot mutaties, omdat unieke, gecleaved bands alleen aanwezig zijn in het vak 5-H5 + wild-type DNA-monster.
Figuur 1: schematische ontwikkeling van met EMS gemutageniseerde TILLING populaties in kleine graangewassen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: EMS-doserings curve in drie verschillende soorten tarwe, waaronder Triticum aestivum, T. monococcumen aegilops tauschii. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Mutante fenotypes (gele pijlen) in verschillende Tilling populaties van kleine korrel M2 . A) een albino mutant in een populatie van gerst m2, (B) chloorina mutant in een populatie van gerst m2, (C) bonte mutant met roze verkleuring in een AE. Tauschii m2 populatie, en (D) low tillering mutant in een T. monococcum M2 bevolking. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Mutant identificatie in 4x Pools na deconvolutie met behulp van de cel-1 assay en agarose gel-gebaseerde aanpak. Getoonde is de (a) Mutant pool in Lane 7 met unieke gecleaved bands, (B) deconvolutie van de heterozygoot Mutant pool, het opsporen van de mutatie in de A4 sample van DNA Box 4 met unieke gespleten bands in vak 4-A4 en vak 4-A4 + wild-type DNA-samples , en (C) deconvolutie van de homozygoot Mutant, waarbij de mutatie in het H5-monster van DNA-Box 5 met unieke gecleaved bands alleen in het vak 5-H5 + wild-type DNA-monster wordt gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Gen | Naam primer | Primer sequentie (5 '-3 ') | Product grootte |
| Wasachtige | Wx_AF | TCGCTCTGCATATCAATTTTGC | 1022 |
| Wx_AR | GGAACTGGCAAGAAGGACTG | ||
| Wasachtige | Wx_BF | Een van de meest gekaarde | 870 |
| Wx_BR | GTCGAAGGACGACTTGAACC | ||
| Wasachtige | Wx_DF | CCATGGCCGTAAGCTAGAC | 1124 |
| Wx_DR | GTCGAAGGACGACTTGAACC |
Tabel 1: primers voor het versterken van wasachtige-genen in hexaploïde tarwe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TILLING is een zeer waardevol reverse genetics tool voor genvalidering, vooral voor kleine granen waar op transformatie gebaseerde benaderingen ernstige knelpunten hebben11. Het ontwikkelen van een mutagene populatie met een hoge mutatiefrequentie is een van de kritische stappen in het uitvoeren van functionele genomics studies. De belangrijkste stap in de ontwikkeling van een robuuste TILLING-populatie is het bepalen van de optimale concentratie van EMS. De overlevings ratio van 40%-60% in de M1 bleek een goede indicator voor de effectiviteit van EMS-mutagenese in tarwe en gerst4,6,18. De overgebleven planten kunnen fatsoenlijke mutatie frequenties bieden om mutaties in elk gen van interesse te helpen ontdekken. In rijst is de vruchtbaarheid van de m1 -plant een andere determinant, naast overleving van M1 -planten, en wordt gerapporteerd om te variëren tussen verschillende genotypen20.
Hexaploid brood tarwe en tetraploïde durumtarwe, vanwege hun polypoidy, hebben een homoeoalleles in elk genoom voor de meeste genen, wat het verlies van functie van belangrijke genen als gevolg van mutaties compenseert. Dit staat bekend als genoom buffering. Zo kunnen polyploïden hogere niveaus van EMS-doses tolereren in vergelijking met diploïden als gevolg van genoom buffering21,22. Het is echter bekend dat tolerantie van verschillende diploïde soorten aan mutagene agentia varieert en kan worden gereguleerd door diversiteit in genetische achtergronden. AE. tauschii toonde bijvoorbeeld een overlevingspercentage van 55% bij 0,6% EMS, terwijl T. monococcum een percentage van 51% toonde met 0,24% EMS; Bovendien leidde elke hogere concentratie in deze laatste soort tot een overmatige planten dood op6,7. We hebben eerder meegemaakt dat zelfs in hexaploids verschillende cultivars verschillende mutagene concentraties tolereren (gegevens niet weergegeven). Bovendien varieert EMS-tolerantie aanzienlijk tussen verschillende rijst genotypen20. Daarom is het sterk aanbevolen om doserings curves te verkrijgen voor individueel genotype van belang.
Om de werkzaamheid van mutagenese te analyseren, moeten verschillende soorten fenotypische mutanten zichtbaar zijn vanaf de kiem fase tot de looptijd van een kantel populatie van7,23,24. De fenotypische mutanten op te merken zijn chloorina, albino's, bonte bladeren, onvolmaakt, breed/smal blad, laag/hoog tillering, vroeg/laatbloeiend, deels vruchtbaar en steriel. Elke afwijking van het wild type fenotype vertegenwoordigt een potentiële fenotypische mutant.
Aangezien G en C de primaire doel residuen van EMS-mutagenese zijn, zal er sprake zijn van vooroordelen in de mutatie frequenties van genen, afhankelijk van het GC-gehalte. Een regio met een hoger GC-gehalte zal een hoge mutatiefrequentie opleveren, terwijl een regio met een laag GC-gehalte een lage mutatiefrequentie oplevert. Om de juiste mutatiefrequentie van een kantel populatie te berekenen, wordt daarom voorgesteld om een gemiddelde van twee tot drie genen te verkrijgen met wisselend GC-gehalte of de mutatie snelheid te normaliseren tot een 50% GC-inhoud13.
De cel-1 assay en agarose gel-gebaseerde protocol beschreven hier zijn eenvoudige methoden die geen dure instrumentatie of complexe analyse vereisen. Echter, opgemerkt moet worden dat deze methode is alleen geschikt en efficiënt voor mutatie detectie in een paar genen. Voor het screenen van mutaties in een grotere verzameling van genen, wordt multiplex ampliconlengte voor temp sequencing methode aanbevolen3,24. Voor een gedetailleerd protocol over meerdere ampliconlengte voor temp sequencing methode, kunnen lezers verwijzen naar Tsai et al.25 met vooruitgang in sequencing technologie en lagere kosten van sequencing, platforms zoals exoomsequencing Capture zijn gebruikt bij het karakteriseren van mutaties over een hele genoom in de hele tarwe TILLING populatie17. Voor planten met kleine genomen kunnen zelfs hele genomen van alle individuen in de Tilling populatie worden gesequentieerd15,16. De kosten van het screenen van alle mutaties in de individuen van een bepaalde TILLING-populatie maken het echter duur om whole-genoom volgordebepaling uit te voeren voor een populatie die voor specifieke doeleinden is ontwikkeld. Daarom, voor het uitvoeren van reverse-genetica gebaseerde validatie voor een beperkt aantal kandidaatgenen in een laboratorium met reguliere moleculaire biologie instrumentatie, is cel-1 gebaseerde assays een fatsoenlijke methode van keuze. Niettemin is de keuze van het platform voor het opsporen van mutaties ondergeschikt aan het ontwikkelen van een kantel populatie die meerdere mutaties in het genoom verveelt. Daarom is de meest kritieke stap in het protocol de ontwikkeling van een robuuste TILLING populatie met een hoge mutatiefrequentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1016879 en Maryland Agricultural experiment station via MAES Grant No. 2956952.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R.
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L.
