Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

إعداد الخلايا السائلة ميكروويل المدعومة بالجرافين للتصوير المجهري الإلكتروني للإرسال في الموقع

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59751
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1,2,4
1Electron Devices (LEB), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Fraunhofer Institute for Integrated Systems and Device Technology (IISB), 3Institute of Micro- and Nanostructure Research (IMN) and Center for Nanoanalysis and Electron Microscopy (CENEM), Department of Materials Science and Engineering, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 4Power Electronics (LEE), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg
* These authors contributed equally

Summary

ويُقدَّم بروتوكول لإعداد الخلايا السائلة المجهرية المدعومة بالجرافين من أجل الفحص المجهري الإلكتروني للبلورات النانوية الذهبية في الموقع من محلول سلائف HAuCl4. وعلاوة على ذلك، يُقدَّم إجراء تحليلي لتحديد كمية الديناميات الملاحظة للنقش والنمو.

Abstract

يتم عرض تصنيع وإعداد الخلايا السائلة الدقيقة المدعومة بالجرافين (GSMLCs) للميكروسكوب الإلكتروني في الموقع في بروتوكول تدريجي. ويتجلى تعدد استخدامات GSMLCs في سياق دراسة حول النقش وديناميات النمو للهياكل النانوية الذهب من محلول السلائف HAuCl 4. تجمع GSMLCs بين مزايا الخلايا السائلة التقليدية القائمة على السيليكون والجرافين من خلال تقديم أعماق الآبار القابلة للاستنساخ جنبا إلى جنب مع تصنيع الخلايا السهلة والتعامل مع العينة قيد التحقيق. يتم تصنيع GSMLCs على الركيزة السيليكون واحد مما يقلل بشكل كبير من تعقيد عملية التصنيع بالمقارنة مع اثنين من رقاقة القائم على تصاميم الخلايا السائلة. هنا، لا يلزم اتخاذ خطوات عملية الترابط أو المحاذاة. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف حجم السائل المغلقة وفقا للمتطلبات التجريبية ذات الصلة ببساطة عن طريق ضبط سمك طبقة نيتريد السيليكون. وهذا يتيح الحد من انتفاخ النافذة بشكل كبير في فراغ المجهر الإلكتروني. وأخيراً، يُقدَّم تقييم كمي حديث لتتبع الجسيمات الواحدة وتكوين الدندريت في تجارب الخلايا السائلة باستخدام برمجيات مفتوحة المصدر فقط.

Introduction

تتطلب علوم المواد الحديثة والكيمياء وبيولوجيا الخلايا فهماعميقا للعمليات والآثار الدينامية الكامنة على نطاق الميكرون الفرعي. على الرغم من قوة تقنيات الفحص المجهري البصرية المتقدمة مثل تحفيز الانبعاثاتاستنفاد الفلورية المجهرية 1، تقنيات التصوير المباشر للوصول إلى مورفولوجيا مفصلة تتطلب المجهر الإلكتروني. على وجه الخصوص، في الموقع (المسح الضوئي) الإرسال الإلكترون المجهري (S) TEM وقد ثبت لإلقاء الضوء على رؤى قيمة في ديناميات العملية عن طريق تغليف السوائل في مخصصة، فراغ ضيق الخلايا2. تجارب مختلفة مثل التحقيقات الكمية لحركية تشكيل البنية النانوية والديناميكا الحرارية3،4،5،6، تصوير العينات البيولوجية7، 8 , 9 , 10 ودراسات للآليات المتعلقة بتخزين الطاقة11،12 جنبا إلى جنب مع دراسات شاملة لديناميات عملية التآكل13 أو الفيزياء nanobubble14،15، 16 قد كشف العديد من الظواهر باستخدام (S)TEM التي لم يكن من الممكن الوصول إليها باستخدام تقنيات الفحص المجهري القياسية.

وخلال العقد الماضي، تم وضع نهجين رئيسيين لتحقيق الخلايا السائلة TEM (LCTEM) في الموقع. في النهج الأول، يتم تغليف السائل في تجويف بين اثنين من الأغشية Si3N4 المنتجة عن طريق تكنولوجيا عملية Si17،في حين يتم تشكيل جيوب سائلة صغيرة في الثانية بين ورقتي الجرافين أو أكسيد الجرافين 10،18. وقد ثبت التعامل مع كل من الخلايا السائلة القائمة على السيليكون (SiLCs) والخلايا السائلة القائمة على الجرافين (GLCs)19،20،21. على الرغم من أن كلا النهجين قد شهدت تحسينات كبيرة22،23،24،25،فإنها لا تزال تفتقر في مزيج من المزايا ذات الصلة. بشكل عام، يوجد مفاضلة بين تغليف العينة في جيوب الجرافين غير المحددة في كثير من الأحيان مع حجم سائل صغير يمكّن التصوير عالي الدقة18،وأحجام الخلايا المحددة بشكل جيد مما يؤدي إلى أغشية أكثر سمكاً وطبقات سائلة، التي توفر بيئة أقرب إلى الوضع الطبيعي في السائل السائبة26 على حساب القرار2. وعلاوة على ذلك، تعتمد بعض التجارب على تدفق السائل26،27 التي لم تتحقق إلا في الهندسة المعمارية SiLC ويتطلب حامل TEM مخصص28.

هنا، نقدم تصنيع والتعامل مع نهج الخلية السائلة لLCTEM عالية الأداء في الموقع عن طريق الخلايا السائلة الدقيقة المعتمدة من الجرافين (GSMLCs) لتحليل TEM. وترد في الشكل 1رسم تخطيطي لـ GSMLC. وقد أثبتت المراكز أن هذه المراكز قادرة على تمكين التنظير المجهري للإلكترون عالي الاستبانة (HRTEM) في الموقع، وهي ممكنة أيضاً للفحص المجهري الإلكتروني في الموقع 29. يسمح إطارها القائم على تقنية Si بالإنتاج الضخم للخلايا ذات الشكل reproducibly مع سمك سائل مصمم خصيصًا وأغشية رقيقة للغاية من رقاقة واحدة. غشاء الجرافين الذي يغطي هذه الخلايا يخفف أيضا منالاضطرابات الناجمة عن شعاع الإلكترون 8،30،31 منذ شعاع الإلكترون يمر من خلال غشاء الجرافين العلوي أولا. تسمح الطوبوغرافيا المسطحة للخلايا بأساليب تحليل تكميلية مثل التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDXS)6 دون أي آثار مظللة ناشئة عن الخلية السائلة نفسها، مما يتيح مجموعة متنوعة من الجودة العالية في الموقع تجارب الفحص المجهري للإلكترون الخلية السائلة.

Protocol

1. تصنيع قوالب الخلايا السائلة القائمة على ميكروويل

  1. إزالة المخلفات العضوية وطبقات أكسيد الأصلي من 175 ميكرومتر سميكة، واحدة بلورية، البورون مخدر (1 - 30) Ωcm، 100 مم قطرها (100) رقاقة السيليكون. تطبيق خطوة الأكسدة مع H2O2 و TMAH، تليها تراجع HF في 1 - 5٪ حل HF.
  2. أكسدة الرقاقة حرارياً في جو الأكسجين الجاف عند 800 درجة مئوية لزراعة طبقة أكسيد بسمك 11 نانومتر (الشكل2أ). 3% ديكلوريثين (DCE) يستخدم لربط التلوث المعدني.
  3. إيداع Si Si3N4 طبقة عن طريق انخفاض ضغط ترسب بخار الكيميائية (LPCVD). يحدد سمك طبقة Si3N4 عمق البئر. اختر قيمة مناسبة للتجربة المخطط لها (على سبيل المثال، 500 نانومتر) (الشكل2ب).
  4. تحديد هندسة الآبار الجانبية من خلال هيكلة الجانب الأمامي عن طريق التصوير الضوئي والنقش الأيوني التفاعلي (RIE) (الشكل2c). أبعاد مناسبة مثلا بنى دائريّة مع 2.5 [م] شعاع يرتّب في صفائف سداسيّة. اختيار مسافة جيدا بعناية (على سبيل المثال، 5 ميكرومتر)، لتجنب عدم الاستقرار في الهيكل.
  5. إيداع آخر 20 نانومتر من Si stoichiometric si3N4 بواسطة LPCVD، والتي تشكل الغشاء السفلي للخلية السائلة (الشكل2D). اتبع الإجراء الموضح أعلاه (راجع الخطوة 1.3).
  6. استخدم خطوة تصوير يُعدّة تصويرضوئي/RIE ثانية لهيكلة الجانب الخلفي الذي يحدد فيما بعد الأبعاد الهندسية لإطار LC ونوافذTEM (الشكل2e)(قطر الإطار: 3 مم).
  7. عن طريق الآلات الدقيقة السائبة في 20٪ KOH في 60 درجة مئوية، وإزالة Si في منطقة محددة مسبقا وإنشاء غشاء Si3N4 مستقل (الشكل2f).
  8. إزالة الأيونات المعدنية المتبقية في خطوة التنظيف النهائي مع 10٪ محلول حمض الهيدروكلوريك والمياه منزوعة الأيونات (DI).

2- نقل الجرافين إلى شبكات TEM

  1. الرطب الأنسجة التي يتم الحصول عليها تجاريا طبقة قليلة (6 - 8) CVD-الجرافين على PMMA يتم وضعها. تزج الجرافين المغلفة PMMA في طبق بيتري مليئة المياه DI (الشكل3a).
    ملاحظة: يمكن تحديد عدد طبقات الجرافين باستخدام التقنيات الممكنة32و33 .
  2. ضع طبقة الجرافين على ورقة فلتر واقطعها إلى قطع مناسبة لتغطية جميع الآبار المصنعة (على سبيل المثال، 4 مم²) (الشكل3ب).
  3. إعادة تزج قطع قطع في طبق بيتري (الشكل3c).
  4. استخدام شبكة TEM المغلفة مع طبقة دعم من الكربون holey لصيد القطع المنتجة من المياه DI. للقيام بذلك، الغوص بعناية الشبكة في الماء وقبض على الجرافين العائمة على السطح. عقد الشبكة مع ملاقط المضادة للشعيرات الدموية (الشكل3D،ه).
    ملاحظة: الحرص على أن موقع الجرافين من مكدس الجرافين-PMMA يبقى على رأس أثناء الإجراء بأكمله. وإلا، فإن إزالة PMMA اللاحقة رفع قبالة طبقة الجرافين.
  5. دع الملاءات تجف لبضع ساعات.
  6. إزالة طبقة حماية PMMA في حمام الأسيتون لمدة 30 دقيقة وإضافة خطوات التنظيف على التوالي عن طريق غمر في الإيثانول والمياه DI دون تجفيف العينة في ما بين. استخدام وعاء مسطح (على سبيل المثال، طبق بيتري) لتبسيط نقل العينة بعد ذلك.
  7. تجفيف العينة بعد ذلك لمدة 30 دقيقة في الظروف المحيطة.

3. إعداد عينة

  1. إعداد العينة لدمجها في GSMLC. للقيام بذلك، وإعداد حل الأسهم 1 M من خلال حل 196.915 ملغ من حمض الهيدروكلوريك4·3H2O بلورات في 0.5 لتر من المياه DI.
  2. تأخذ الكمية المطلوبة من عينة من حل الأسهم. هنا، يتم تطبيق 0.5 ميكرولتر. ويمكن القيام بذلك باستخدام حقنة أو ماصة Eppendorf.

4. تحميل GSMLC

  1. شطف قالب الخلية السائلة ملفقة مع الأسيتون والإيثانول.
  2. تطبيق O المحيطة2/ N2 (20٪ / 80٪) البلازما لمدة 5 دقائق لتعزيز الرطوبة من الغشاء.
  3. الاستغناء عن 0.5 ميكرولتر من محلول العينة على القالب أو طبقة الجرافين. ضمان إجراء عمل سلس لتقليل التغيرات في التركيز بسبب التبخر.
  4. ضع شبكة TEM على طبقة Si3N4 ذات النقش الجزئي مع الجرافين الذي يواجه القالب. اضغط على شبكة TEM المغلفة بالجرافين على القالب. يجب الحرص على عدم تدمير أسفل Si3N4 غشاء.
  5. إزالة الحل الزائد مع الأنسجة لتسريع تجفيف الخلايا وبالتالي تخفيف التغيرات التركيز (الشكل4a). بعد حوالي 2- 3 دقائق، التفاعل الجرافين-Si3N4 فان دير والز ختم بما فيه الكفاية الخلية السائلة (الشكل4b). بدلا من ذلك، ترك الخلية لتجف تماما دون إزالة الحل الزائد. هذا الأخير يوفر معدل نجاح أعلى في معالجة الخلية. ومع ذلك، من المتوقع أن تكون تغيرات التركيز المستندة إلى التبخر في محلول العينة أكثر شدة عند استخدام هذا النهج.
    ملاحظة: يمكن التحقق من عملية التجفيف الناجحة مع تغيير التباين في المحيط (مقارنة الشكل 4a،b).
  6. قم بإزالة شبكة TEM بعناية باستخدام ملاقط عن طريق دفع طرف ملاقط بين الشبكة وإطار GSMLC.
    ملاحظة: حركات الطفح الجلدي قد تكسر الغشاء الأساسي. لتقليل تلف قوة القص، ابدأ من موقع الشبكة المتوازي إلى حافة الإطار الأصغر.
  7. تحقق، ما إذا كان غشاء واحد على الأقل من GSMLC لا تزال سليمة عن طريق الفحص المجهري البصري (الشكل4c). إذا تم كسر جميع الأغشية، سيكون من المستحيل LCTEM.

5. التصوير TEM وتحليل الفيديو

  1. قم بتحميل العينة إلى TEM (S) مباشرة بعد التحضير باستخدام حامل TEM قياسي.
    ملاحظة: كما هو المبلغ عنه لGLCs19،GSMLCs يمكن أن تجف مع مرور الوقت. لذلك، يجب تقليل الوقت بين التحميل والتصوير.
  2. صورة العينة مع تقنية التصوير المناسبة، اعتمادا على كل من العينة والمجهر. هنا، يتم استخدام جهاز (S)TEM يعمل في الجهد التسارع من 300 كيلوفولت. استخدام جرعة منخفضة لتقليل القطع الأثرية الناجمة عن شعاع ووقت التعرض القصير لتجنب عدم وضوح الحركة ذات الصلة34. في حالة التجارب طويلة الأجل، قم بسد الحزمة لتقليل الضرر الإشعاعي.
    ملاحظة: نظراً لدقة زمنية أفضل، يجب تفضيل TEM على العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات للتحليلات الحركية34 وخفض أيون التخفيض35. STEM، ومع ذلك، ويفضل للتحقيق في طبقات سائلة سميكة وعناصر عالية Z بسبب ارتفاع الدقة المكانية في عينات سميكة34،35.
  3. طريقة تجزئة الصورة
    1. استخدام منصة معالجة الصور المناسبة لاستخراج الميزات ذات الأهمية. لتتبع الجسيمات وتحليلها، استخدم المصدر المفتوح ImageJ-distribution FIJI36.
    2. استخدم وظيفة تحليل الجسيمات للحصول على معلومات دقيقة (المنطقة المتوقعة، barycenter) لكل جسيم في كل إطار.
      ملاحظة: تتطلب هذه الدالة صور ثنائية.
    3. ربط الجسيمات بين الإطارات مع مساعدة من البرنامج المساعد TrackMate37. بشكل افتراضي، TrackMate تبحث عن جزيئات مشرقة على خلفية داكنة، لذلك عكس الصور (في حالة BF-TEM) قبل بدء TrackMate.
    4. الجمع بين نتائج TrackMate وتحليل الجسيمات مع سيناريو مناسب باستخدام النظام الإيكولوجي مفتوح المصدر القائم على بيثون SciPy38،39.
    5. استخدام فيجي لاستخراج ملامح دقيقة من هياكل أكثر تعقيدا مثل dendrites. هنا، تحليل الجسيمات يمكن تطبيقها، وكذلك (انظر بداية الشكل 6a).
      ملاحظة: قد يكون من الممكن تحليل الميزات ذات الأهمية يدوياً.

Representative Results

بعد تحميل الخلية ، يشار إلى نقل الجرافين الناجح من خلال ظهور مظلل بشكل مختلف على الآبار تحت المجهر البصري. وهذا واضح، على سبيل المثال، في الغشاء الأيمن من الشكل 3c. كما ذكر، فمن الأهمية بمكان لإزالة بعناية TEM-الشبكة من أجل عدم كسر رقيقة Si3N4 طبقة. في حالة كسر الغشاء ، تكون البقايا المنحنية والمضيئة واضحة في المجهر البصري ، كما هو موضح في الأغشية اليسرى من الشكل 3c. بسبب مناطق العرض متعددة في تصميم GSMLC المستخدمة، يمكن استخدام الخلية طالما غشاء واحد على الأقل سليمة. يمكن استخدام الأغشية المكسورة لمحاذاة TEM دون تعريض العينة لشعاع الإلكترون.

يمكن التحقق من التغليف الناجح لحل العينة أثناء الفحص المجهري الإلكتروني. ويعرض الشكل 5 الصور المجهرية الفردية للفيديو التكميلي 1، حيث يتم تقييم انحلال مجموعة من الجسيمات النانوية ونمو بنية التقشر إحصائيا في GSMLC. وإلى جانب الحركة الناتجة عن الانجراف للصورة، تظهر حركات الجسيمات المتعامدة الفردية الصغيرة، مما يشير إلى وجود جزيئات في الحل. وعلاوة على ذلك، فإن انتشار انحلال الجسيمات يثبت وجود تفاعل كيميائي رطب لن يكون ممكنا ً بدون وجود سائل ناجح. المؤشرات النموذجية الأخرى للسوائل المغلقة هي تشكيل فقاعة الناجمة عن شعاع19 أو حركة الجسيمات. وجود جزيئات الاتحاد الافريقي في الخلايا التي ظهرت الجرافين وحدها لا يشير بشكل قاطع إلى بيئة سائلة، لأن الجسيمات يمكن أن تنبع أيضا من انخفاض الجرافين الناجم عن HAuCl440. ويمكن أيضا إجراء تقدير كمي لقمم الأكسجين للسائل المغلق عن طريق مطياف فقدان الطاقة الإلكترونية (EELS) للتحقق من البيئة السائلة41.

من أجل الحصول على رؤى في نمو الجسيمات وحركية الانحلال، من المهم التحقيق في كل جسيم على حدة بدلا من تحليل تطور متوسط المعلمات42. ومن الأهمية بمكان أيضا استبعاد الجسيمات عند حواف الإطار التي يتم التقاطها جزئيا فقط من قبل الكاميرا لأن تغييرات الموقف المرتبطة بتأثير الانجراف من هذه الجسيمات قد يكون مخطئا كعمليات النمو أو الانحلال. ويعتقد أن النقش ناجم عن الأنواع التأكسدية التي تولدها شعاع الإلكترون الناجم عن التحليل الإشعاعي43. ومن أجل الحصول على إحصاءات كافية، يلزم تتبع الجسيمات الفردية الحسابية. من خلال تقدير أس النمو α من اختلاف نصف القطر المكافئ للجسيمات الفردية مع مرور الوقت، يمكن الحصول على معلومات عن حركية التفاعل الكامنة. للقيام بذلك، فمن الممكن إدخال دائرة نصف قطرها مكافئة على أساس منطقةالجسيمات المتوقعة، حتى لو لم تكن جميع الجسيمات كروية تماما 6،44. ويبين الشكل 5ب تتبع الرادي المكافئ مع مرور الوقت لستة جسيمات تمثيلية تم إبرازها في الشكل 5أ. ويبين الشكل 5(ج) توزيع α استناداً إلى 73 جسيمات منحلة من هذه الدراسة. ولا يُنظر إلا للجسيمات التي يفسر فيها النموذج اللامتري انخفاض نصف القطر إلى ما لا يقل عن 50 في المائة (معامل التحديد المعدل).

وعلاوة على ذلك، يظهر هيكل dendrite بسرعة بعد حوالي 42 ق في نفس جيدا يصور في الشكل 6a. تشكيل Dendrite هو آخر نموذجي، عملية موثقة بشكل جيد في الخلايا السائلة45،46. ولتحديد حجم نمو الدندري، يتم تحليل الخطوط العريضة الهيكلية (انظر الشكل 6أ). تطور دائرة نصف قطر الطرف والسرعة مع مرور الوقت (انظر الشكل 6b،c)يكشف عن العلاقة الزائدة المتوقعة47 (الشكل6د). يحدث نمو الدندرية بسبب التشبع الفائق المحلي لأيونات الاتحاد الافريقي بسبب النقش الجسيمات المذكورة أعلاه. في الشكل 5a، من الواضح أن الجسيمات لا تزال تذوب في حين أن النظام المشبعة بالإفراط يرتاح إلى نمو الدندرية. قد يكون هذا بسبب الاختلافات التركيز المحلي في كل من أيونات الاتحاد الافريقي والأنواع التأكسدية نتيجة لزوجة عالية من السائل في GSMLC التي لوحظت قبل6. غير أن إجراء مناقشة مفصلة لهذه الظاهرة يتجاوز نطاق هذا العمل.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لـ GSMLC: مخططات بنية خلية سائلة ميكروويل مدعومة بالجرافين. أعيد طبعها من 6https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 . ومن المقرر توجيه المزيد من الأذونات إلى الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصنيع إطارات GSMLC. يتم رسم عملية تصنيع إطارات GSMLC تخطيطية تخطيطيًا. (أ) أكسدة رقاقة سي بعد التنظيف. )ب( LPCVD من Si3N4. (ج) الجانب الأمامي Si3N4 النقش عن طريق التصوير الضوئي وRIE لتحديد حجم الخلية. (د) ترسب Si3N4 لتشكيل نافذة الخلية السفلى. (هـ) الطباعة الحجرية الخلفية والعصر الحجري الدولي. (و) الآلات الدقيقة السائبة مع KOH لإنشاء غشاء Si3N4 الذي يحتوي على ميكروويل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نقل طبقة قليلة CVD-الجرافين مع طبقة حماية PMMA على شبكة TEM. يتم عرض نقل طبقة قليلة CVD-الجرافين على PMMA على الجزء العلوي من شبكة TEM المغلفة بالكربون holey. (أ) غمر الجرافين CVD قليل الطبقة على PMMA في طبق بيتري مملوء بمياه DI. (ب) يتم تقسيم كومة الجرافين/PMMA المنقولة على ورقة فلتر إلى قطع مناسبة لتغطية إطارات GSMLC. (ج) إعادة غمر قطعة الجرافين/PMMA المقطوعة. (د) نقل طبقة الجرافين/PMMA إلى شبكة TEM المغلفة بالكربون (ه) كومة الجرافين/PMMA بعد نقلها بنجاح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: إزالة أعلى شبكة TEM. يتم توثيق عملية التجفيف من GSMLC محملة مع مساعدة من المجهر البصري. (أ) توضع شبكة TEM المغلفة بالجرافين فوق نظام GSMLC مباشرة بعد التحميل. تظهر طبقة الجرافين كمستطيل فيروزي يغطي جميع مناطق العرض الثلاثة. يتم رسم الخطوط العريضة لها تقريبا من قبل المستطيل الأسود. (ب) يتضح الغشاء الملتصق تماماتقريبا بالتغير في التباين بين الرطب (الظلام، مقارنة مع (أ)) والمنطقة الملتصقة (الفيروز) بعد دقيقتين تقريبا. (ج) يظهر نظام GSMLC بعد رفع شبكة TEM، مما يكشف عن غشاءين مكسورين (اليسار والوسط)، وغشاء واحد مع microwells محملة بنجاح ومختومة (يمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التطوير التمثيلي لرادي الجسيمات النانوية. وقد تم تتبع تطور نصف قطرها من 183 جسيمات فردية. (أ) تسلسل الصور المأخوذ من الفيديو التكميلي 1. يتم تسليط الضوء على ستة جزيئات تمثيلية. تتوافق الدوائر الملونة مع نصف القطر المكافئ الذي تم الحصول عليه. (ب) الرسم اللوغاريتمي للجسيمات الرادي. (ج) الرسم البياني لـ 73 جسيمات حيث تم تحديد الأس اللامتري السالب α باستخدام روتين آلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: ديناميات دندريت: يتم تحليل دائرة نصف قطرها طرف من خمسة فروع dendrite. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري المعني. (أ) تسلسل الصور المأخوذ من الفيديو التكميلي 1 الذي يُظهر الدندريت الناشئ، الذي يظهر بعد حوالي 42 ق. يظهر الدخول في الصورة الصحيحة ملامح dendrite المتطورة. هنا، الخطوط العريضة الوردية تتوافق مع 42.09 s، الأحمر إلى 42.7 ق، والأرجواني إلى 43.3 ق(ب) تطوير نصف قطر الطرف (المتوسط) مع مرور الوقت. (ج) متوسط سرعة الطرف المرسوم مع مرور الوقت. (د) متوسط طول دائرة البقشيش المعلّقة في المتوسط مقابل متوسط سرعة الطرف، مما يكشف عن تبعية مفرطة (منحنى برتقالي). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: صورة SEM لـ GSMLC المحملة: يتم عرض صورة SEM تمثيلية تم الحصول عليها في وضع هيئة العلوم والتكنولوجيا في وضع STEM في SEM من GSMLC محملة في الجهد المنخفض التسارع (29 كيلوفولت). وإلى جانب الآبار الدقيقة الواسعة البالغة 5 م، فإن شبكتين من الكربون الدائري المتداخلة جزئياً (قطر2 ميكرومتر) النابعة من نقل الجرافين المنوّح أعلاه ظاهرة للعيان. وتنبع شبكة الكربون الأولى من عملية نقل غير ناجحة للجرافين. ومن الواضح أن تظليل الغشاء يبقى ثابتا في الغالب على منطقة البئر، ولكن سواد قليلا نحو مركز البئر. وهذا يفسر الضعف، وانتفاخ سلبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي 1: فيديو في الموقع يظهر النتائج التمثيلية لخلية سائلة مشرقة حقل TEM دراسة النقش من الجسيمات النانوية Au والنمو اللاحق لهيكل dendrite الناجمة عن التشبع الفائق للمحلول عينة المحيطة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

وعلى النقيض من الخلايا السائلة المتاحة تجارياً، تتمتع الشركات ذات المعدات المخصصة للخلايا ذات المعدات المصممة خصيصاً بميزة أنها يمكن تصميمها لتتناسب مع حاملي TEM المتاحين بسهولة ولا تتطلب حامل خلية سائلة غالي الثمن ومخصص او مزود بـ TEM.

الهندسة المعمارية GSMLC أظهرت هنا يجمع بين جوانب من SiLCs وGLCs التي يمكن أن تؤدي إلى مزايا فريدة من نوعها. من ناحية، تسمح SiLCs لتحديد دقيق لموقف الخلية وشكلها، ولكنها تتطلب أغشية Si3N4 سميكة نسبيا للحد من آثار انتفاخ مع الحد في نهاية المطاف من القرار القابل للتحقيق. من ناحية أخرى، تظهر GLCs جدران غشاء رقيقة بشكل استثنائي تتكون من الجرافين، ومع ذلك تعاني من أحجام الجيب العشوائي والمواقف. من خلال الجمع بين هذين النهجين غشاء عن طريق GSMLCs، يمكن تجاوز الحد من الدقة الناجمة عن حدود الخلية35. كما يتم تصنيع هيكل جيدا مباشرة في طبقة Si3N4، يمكن بناء غشاء Si3N4 الفعلي حتى أصغر مما كانت عليه في SiLCs، وتبسيط تحليلات HRTEM التي تم عرضها بالفعل في GSMLCs6 . ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن HRTEM بشكل عام هو ممكن مع SiLCs وكذلك48. وعلاوة على ذلك، يمكن تحقيق مناطق مشاهدة كبيرة دون انتفاخ النافذة الشديدة بسبب مناطق الغشاء الصغيرة من غرف العينة الفردية. وبالتالي، يمكن استبعاد زيادة سمك الانتفاخ ذات الصلة35 إلى حد كبير، كما هو مبين من قبل الدوقات وآخرون49. ويتضح ذلك في الشكل7، حيث يتم عرض صورة منسقة ذات زاوية عالية في مجال الحلقي المظلم (HAADF) من الـ 2000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 تم الحصول على هذه الصورة باستخدام نظام ثنائي الحزمة. منذ سطوع الصورة المكتسبة في هذا الإعداد يرتبط مباشرة إلى سمك العينة، فمن الواضح أن microwells مختومة تظهر انتفاخ سلبي صغير فقط. وقد أظهرت كيلي وآخرون24 أن الانتفاخ السلبي والتجفيف الجزئي للبئر الظاهرة في الشكل 7 يعتمد على قطر البئر. الحد من قطر البئر هو بالتالي نهج عملي لتجانس سمك السائل أكثر من ذلك.

نظرا لشكل جيب التوازن من GLCs، سمك السائل هو أيضا بقوة الموقع تعتمد35. SiLCs تتبع تصميم اثنين من الأغشية الناجمة عن رقاقات سي مختلفة. عن طريق استبدال أعلى Si3N4 غشاء مع الجرافين، يتم تبسيط تصنيع الخلايا السائلة. وهذا يعني أنه يمكن تجنب التملص المحتمل من اثنين من رقاقات Si المستعبدين خلال خطوات النقش الرطب اللاحقة ويتم حذف محاذاة قطعتين رقاقة أثناء تحميل الخلية. السطح المسطح على جانب واحد من هذه البنية الخلية تمكن أساليب التحليل التكميلية في الموقع مثل تحليل EDXS للعينة6، والتي تقتصر في الهندسة المعمارية SiLC التقليدية عن طريق تظليل الآثار في حواف Si حاد50 .

ختم microwells prepatterned مع الجرافين على كل من أسفل وأعلى موقع بئر وقد ثبت قبل24،25. تطبيق اثنين من أغشية الجرافين قد تعزز القرار قابل للتحقيق. غير أن نقل الجرافين بشقين من شأنه أن يزيد من تعقيد عملية الإعداد؛ خاصة وأن هذا قد ثبت أن تكون الخطوة إعداد الأكثر حساسية (انظر أدناه). وعلاوة على ذلك، من المتوقع أن يكون انتفاخ الغشاء المذكور أعلاه أكثر أهمية في حالة اثنين من أغشية الجرافين، لأن الجرافين أكثر مرونة بكثير من طبقة Si3N4. في تلك البنى، تم بناء microwells باستخدام شعاع أيون ية مركزة متتابعة (FIB) طحن. في حين أن هذا النهج قد ثبت أن تسفر عن نتائج عالية الجودة، FIB طحن معقدة ومكلفة تقنية إنتاج الخلايا. ومع ذلك، فإن استخدام تقنيات التبذير المتوازية بشكل كبير في صناعة أشباه الموصلات في الوقت الحاضر مثل التصوير بالمنظار النانوي أو التصوير الضوئي، له ميزة رئيسية تتمثل في السرعة والرخيصة وقابلة للتطوير من أجل الإنتاج الضخم.

وتجدر الإشارة إلى أن النهج المعروض هنا لا يسمح بتشغيل تدفق السائل، وهو ما يمكن تحقيقه من خلال تصاميم أخرى28. منذ التحميل وحجم السائل قابلة للمقارنة لGSMLCs وGLCs، يمكن تجنب تلوث فراغ عالية بسبب تمزق الغشاء19. وهذا يلغي الحاجة إلى فحص ختم مرهقة. وعلى الرغم من أن مزايا البلدان النامية والبلدان النامية غير الالحكومية الدولية قد تم الجمع بينها، فإن مساوئ كلا النهجين لا تزال موجودة في البلدان التي تستخدمها البلدان النامية غير الذلكبيا. تصنيع الخلايا يتطلب بنية تحتية غرفة نظيفة لتكنولوجيا السيليكون، والتي ليست موجودة بالضرورة في مختبرات TEM. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تحميل السائل ليست تافهة. وهو يتطلب تدريبا مخصصا، على غرار خلايا الجرافين. غير أن هذا ينطبق أيضا على النظم المتاحة تجاريا. هنا، فإن الخطوة الأكثر حساسية إعداد هو إزالة شبكة TEM بعد نقل الجرافين لأن حركات الطفح الجلدي أو التوتر من المرجح أن كسر طبقة Si3N4. نوافذ غشاء زائدة عن الحاجة، ومع ذلك، تعزيز فرص الحفاظ على منطقة غشاء واحد على الأقل. ونتيجة لذلك، فإن العائد (كمية رقائق GSMLC قابلة للتشغيل) التي حققها أحد التجارب المدربة هو ثلاثة من أصل أربعة6، وبالتالي يتجاوز العائد الذي تحقق مع الخلايا القائمة على الجرافين (واحد إلى اثنين من أصل أربعة)19.

كما هو الحال مع GLCs، ويستند تغليف السائل في GSMLCs على التفاعلات فان دير والز18. وبالتالي، يمكن أن يؤدي تلوث الواجهة إلى خفض معدل النجاح في معالجة GSMLCs19. وعلاوة على ذلك، اعتمادا على ثابت Hamaker من المرحلة السائلة التي يجب تغليفها، وخصائص التبول أثناء إجراء التحميل (وبالتالي العائد قابلللتحقيق) قد تختلف51 وبالتالي يمكن أن تكون معقدة إعداد. وتبين تجربتنا أن هذا هو الحال إذا كانت الأنواع الأمفيلية موجودة، على سبيل المثال.

تتيح بنية GSMLC تكوينًا مرنًا للأعماق البئرية، مما يسمح بالتكيف مع مختلف المتطلبات التجريبية. وعلاوة على ذلك، فإن الهندسة المعمارية مناسبة للتحقيقات التصوير المقطعي الإلكتروني على مدى نطاق واسع من زاوية الميل من ± 75 درجة، والتي من شأنها أن تسمح أيضا للتصوير المقطعي الإلكترون في الموقع 52. ولذلك، يمكن أيضا في الموقع وبعد الوفاة التصوير المقطعي للعينة في السائل مع GSMLCs.

Disclosures

ليس لدينا ما نكشف عنه

Acknowledgments

نشكر تيلو شموتزلر على إعداد حل HAuCl 4. وعلاوة على ذلك، نشكر ر. كريستيان مارتنز على قراءة البراهين. الدعم المالي من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) عن طريق مجموعة التدريب البحثي GRK 1896 "فيالموقع المجهري مع الإلكترونات والأشعة السينية وتحقيقات المسح الضوئي" ومن خلال مجموعة التميز EXC 315/2 EAM "هندسة المواد المتقدمة" هو اعترف بامتنان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals 50488858 VLSI
Deionized water own production
Dumont Anti-Capillary tweezers Carl Roth GmbH + Co. KG LH72.1 0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed
Ethanol VWR Chemicals 85651.360 VLSI
FIJI Is Just ImageJ FIJI.sc Version 1.51
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids Plano GmbH S173-8 R 2/2 Au 300 mesh
HAuCl4 · 3 H2O crystal Alfa Aesar 36400.06 5 g
Jupyter Notebook Project Jupyter Version 5.7.2
Matplotlib-Package John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team Version 3.0.2
NumPy-Package NumPy developers Version 1.15.4
Pandas-Package AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team Version 0.23.4
Python Python Software Foundation Version 3.7
Scipy-Package SciPy developers Version 1.1.0
Seaborn-Package Michael Waskom Version 0.9.0
Si wafer Siegert Wafer GmbH Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished
single tilt TEM holder Philips Ensure that cell fits
Transmission Electron Microscope Philips CM 30 (S)TEM 300 kV
Trivial Transfer Graphene ACS Material TTG60011 PMMA-covered, 6 -- 8 MLs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
  2. Ross, F. M. Liquid Cell Electron Microscopy. , Cambridge University Press. (2016).
  3. Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (4), 2574-2581 (2015).
  4. Tao, J., Nielsen, M. H., Yoreo, J. J. de Nucleation and phase transformation pathways in electrolyte solutions investigated by in situ microscopy techniques. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 34, 74-88 (2018).
  5. Jin, B., Sushko, M. L., Liu, Z., Jin, C., Tang, R. In Situ Liquid Cell TEM Reveals Bridge-Induced Contact and Fusion of Au Nanocrystals in Aqueous Solution. Nano Letters. 18 (10), 6551-6556 (2018).
  6. Hutzler, A., et al. Unravelling the mechanisms of gold-silver core-shell nanostructure formation by in situ TEM using an advanced liquid cell design. Nano Letters. 18 (11), 7222-7229 (2018).
  7. Moser, T. H., et al. The role of electron irradiation history in liquid cell transmission electron microscopy. Science Advances. 4 (4), eaaq1202 (2018).
  8. Keskin, S., Jonge, N. de Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  9. Firlar, E., et al. Investigation of the magnetosome biomineralization in magnetotactic bacteria using graphene liquid cell - transmission electron microscopy. Nanoscale. 11 (2), 698-705 (2019).
  10. Mohanty, N., Fahrenholtz, M., Nagaraja, A., Boyle, D., Berry, V. Impermeable graphenic encasement of bacteria. Nano letters. 11 (3), 1270-1275 (2011).
  11. Gu, M., et al. Demonstration of an electrochemical liquid cell for operando transmission electron microscopy observation of the lithiation/delithiation behavior of Si nanowire battery anodes. Nano Letters. 13 (12), 6106-6112 (2013).
  12. Lutz, L., et al. Operando Monitoring of the Solution-Mediated Discharge and Charge Processes in a Na-O2 Battery Using Liquid-Electrochemical Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18 (2), 1280-1289 (2018).
  13. Chee, S. W., et al. Studying localized corrosion using liquid cell transmission electron microscopy. Chemical Communications. 51 (1), Cambridge, England. 168-171 (2015).
  14. Grogan, J. M., Schneider, N. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Bubble and pattern formation in liquid induced by an electron beam. Nano Letters. 14 (1), 359-364 (2014).
  15. Tomo, Y., Li, Q. -Y., Ikuta, T., Takata, Y., Takahashi, K. Unexpected Homogeneous Bubble Nucleation Near a Solid-Liquid Interface. The Journal of Physical Chemistry. 122 (50), 28712-28716 (2018).
  16. Shin, D., et al. Growth dynamics and gas transport mechanism of nanobubbles in graphene liquid cells. Nature Communications. 6, 6068 (2015).
  17. Zheng, H., Claridge, S. A., Minor, A. M., Alivisatos, A. P., Dahmen, U. Nanocrystal diffusion in a liquid thin film observed by in situ transmission electron microscopy. Nano Letters. 9 (6), 2460-2465 (2009).
  18. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 61-64 (2012).
  19. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  20. Niu, K. -Y., Liao, H. -G., Zheng, H. Revealing dynamic processes of materials in liquids using liquid cell transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (70), (2012).
  21. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
  22. Huang, T. -W., et al. Self-aligned wet-cell for hydrated microbiology observation in TEM. Lab on a chip. 12 (2), 340-347 (2012).
  23. Dukes, M. J., Moering, J., Damiano, J. Optimization of Liquid Cell Transmission Electron Microscopy for Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (S1), 304-305 (2018).
  24. Kelly, D. J., et al. Nanometer Resolution Elemental Mapping in Graphene-Based TEM Liquid Cells. Nano letters. 18 (2), 1168-1174 (2018).
  25. Rasool, H., Dunn, G., Fathalizadeh, A., Zettl, A. Graphene-sealed Si/SiN cavities for high-resolution in situ electron microscopy of nano-confined solutions. Physica Status Solidi (b). 253 (12), 2351-2354 (2016).
  26. Kröger, R., Verch, A. Liquid Cell Transmission Electron Microscopy and the Impact of Confinement on the Precipitation from Supersaturated Solutions. Minerals. 8 (1), 21 (2018).
  27. Stawski, T. M., et al. "On demand" triggered crystallization of CaCO3 from solute precursor species stabilized by the water-in-oil microemulsion. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (20), 13825-13835 (2018).
  28. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. Journal of Microscopy. 242 (2), 117-123 (2011).
  29. Hutzler, A., Branscheid, R., Jank, M. P. M., Frey, L., Spiecker, E. Graphene-supported microwell liquid cell for in situ studies in TEM and SEM European Microscopy Congress 2016: Proceedings. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. 209-210 (2016).
  30. Jiang, N. Note on in situ (scanning) transmission electron microscopy study of liquid samples. Ultramicroscopy. 179, 81-83 (2017).
  31. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  32. Hutzler, A., et al. Large-Area Layer Counting of Two-Dimensional Materials Evaluating the Wavelength Shift in Visible-Reflectance Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (14), 9192-9201 (2019).
  33. Hutzler, A., Matthus, C. D., Rommel, M., Frey, L. Generalized approach to design multi-layer stacks for enhanced optical detectability of ultrathin layers. Applied Physics Letters. 110 (2), 21909 (2017).
  34. Zhu, G., Reiner, H., Cölfen, H., de Yoreo, J. J. Addressing some of the technical challenges associated with liquid phase S/TEM studies of particle nucleation, growth and assembly. Micron. 118, 35-42 (2019).
  35. de Jonge, N., Houben, L., Dunin-Borkowski, R. E., Ross, F. M. Resolution and aberration correction in liquid cell transmission electron microscopy. Nature Reviews Materials. 4 (1), 61 (2019).
  36. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
  37. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  38. Oliphant, T. E. Python for Scientific Computing. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 10-20 (2007).
  39. Millman, K. J., Aivazis, M. Python for Scientists and Engineers. Computing in Science & Engineering. 13 (2), 9-12 (2011).
  40. Zaniewski, A. M., Trimble, C. J., Nemanich, R. J. Modifying the chemistry of graphene with substrate selection: A study of gold nanoparticle formation. Applied Physics Letters. 106 (12), 123104 (2015).
  41. Holtz, M. E., Yu, Y., Gao, J., Abruña, H. D., Muller, D. A. In situ electron energy-loss spectroscopy in liquids. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 1027-1035 (2013).
  42. Wang, M., Park, C., Woehl, T. J. Quantifying the Nucleation and Growth Kinetics of Electron Beam Nanochemistry with Liquid Cell Scanning Transmission Electron Microscopy. Chemistry of Materials. 30 (21), 7727-7736 (2018).
  43. Woehl, T. J., Abellan, P. Defining the radiation chemistry during liquid cell electron microscopy to enable visualization of nanomaterial growth and degradation dynamics. Journal of Microscopy. 265 (2), 135-147 (2017).
  44. Ngo, T., Yang, H. Toward Ending the Guessing Game: Study of the Formation of Nanostructures Using In Situ Liquid Transmission Electron Microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (24), 5051-5061 (2015).
  45. Kraus, T., de Jonge, N. Dendritic gold nanowire growth observed in liquid with transmission electron microscopy. Langmuir. 29 (26), 8427-8432 (2013).
  46. Hauwiller, M. R., et al. Dynamics of Nanoscale Dendrite Formation in Solution Growth Revealed Through in Situ Liquid Cell Electron Microscopy. Nano Letters. 18 (10), 6427-6433 (2018).
  47. Glicksman, M. E. Dendritic Growth. Handbook of Crystal Growth. Nishinga, T., Kuech, T. F., Rudolph, P. , Elsevier. Amsterdam. 669-722 (2015).
  48. Li, D., et al. Direction-specific interactions control crystal growth by oriented attachment. Science. 336 (6084), 1014-1018 (2012).
  49. Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 338-345 (2014).
  50. Zaluzec, N. J., Burke, M. G., Haigh, S. J., Kulzick, M. A. X-ray energy-dispersive spectrometry during in situ liquid cell studies using an analytical electron microscope. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 323-329 (2014).
  51. Bonn, D., Eggers, J., Indekeu, J., Meunier, J., Rolley, E. Wetting and spreading. Reviews of Modern Physics. 81 (2), 739 (2009).
  52. Karakulina, O. M., Demortière, A., Dachraoui, W., Abakumov, A. M., Hadermann, J. In Situ Electron Diffraction Tomography Using a Liquid-Electrochemical Transmission Electron Microscopy Cell for Crystal Structure Determination of Cathode Materials for Li-Ion batteries. Nano Letters. , (2018).

Tags

الكيمياء، العدد 149، الخلية السائلة، في الموقع TEM، الجسيمات النانوية، التوليف، النقش، النمو، الذهب، الحركية، الجرافين، dendrite، تتبع الجسيمات واحدة
إعداد الخلايا السائلة ميكروويل المدعومة بالجرافين للتصوير المجهري الإلكتروني للإرسال <em>في الموقع</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hutzler, A., Fritsch, B., Jank, M.… More

Hutzler, A., Fritsch, B., Jank, M. P. M., Branscheid, R., Spiecker, E., März, M. Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (149), e59751, doi:10.3791/59751 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter