Summary
Décrit ici est un protocole pour l'immunoétiquetage direct des myofibres nécrotiques dans les cryosections de muscle. Les cellules nécrotiques sont perméables aux protéines sériques, y compris l'immunoglobuline G (IgG). Révéler l'apport d'IgG par les myofibres permet l'identification et la quantification des myofibres qui subissent une nécrose indépendamment de l'état musculaire.
Abstract
La nécrose des fibres musculaires (myonécrose) joue un rôle central dans la pathogénie de plusieurs affections musculaires, y compris les dystrophies musculaires. On s'attend à ce que les options thérapeutiques s'attaquant aux causes de la pathogénie de dystrophie musculaire soulagent la dégénérescence de muscle. Par conséquent, une méthode pour évaluer et quantifier l'étendue de la mort cellulaire dans les biopsies musculaires est nécessaire. Les méthodes conventionnelles pour observer la dégénérescence myofibre in situ sont soit mal quantitatives, soit reposent sur l'injection de colorants vitaux. Dans cet article, un protocole d'immunofluorescence est décrit qui tache les myofibers nécrotiques en ciblant l'adoption d'immunoglobuline G (IgG) par myofibers. La méthode d'utilisation d'IgG est basée sur des dispositifs cellulaires caractérisant la disparition nécrotique, y compris 1) la perte de l'intégrité de membrane de plasma avec la libération des modèles moléculaires dommages-associés et 2) l'utilisation des protéines plasmatiques. Dans les coupes murines, la co-immunoétiquetage des myofibres, des protéines de matrice extracellulaire et de la souris IgG permet d'identifier proprement et simplement les myofibres avec le destin nécrotique. Cette méthode simple convient à l'analyse quantitative et s'applique à toutes les espèces, y compris les échantillons humains, et ne nécessite pas l'injection de colorant vital. La coloration des myofibres nécrotiques par l'utilisation d'IgG peut également être jumelée à d'autres co-immunoétiquetage.
Introduction
Le muscle squelettique strié se compose principalement de fibres musculaires (myofibers), qui sont responsables de la fonction contractuelle volontaire caractéristique. Ces cellules sont des structures post-mitotiques multinuclées qui soutiennent le stress mécanique pendant la contraction. La stabilité structurale de la membrane de myofiber (sarcolemma) et de sa matrice extracellulaire sont cruciales pour l'homéostasie de tissu. Les cellules satellites constituent la population principale d'ancêtres musculaires dans le muscle squelettique mature et existent dans un état quiescent dans les muscles sains. Après la mort de myofiber, la régénération de muscle est soutenue par des cellules satellites suivant un programme myogenic qui implique l'activation de cellules de satellite, la prolifération, la différenciation, et la fusion pour former en fin de compte de nouveaux myofibers multinucleateds.
La disparition de myofiber peut se produire dans les conditions musculaires multiples, y compris le trauma mécanique, les dommages de ischémie-reperfusion, ou les dystrophies musculaires, et elle est associée à la morphologie nécrotique des cellules mortes1,2. La mort nécrotique se caractérise par la perméabilité rapide de la membrane plasmatique et la libération de contenu cellulaire dans le compartiment extracellulaire3. Elle peut résulter soit d'un processus non réglementé impliquant aucune signalisation cellulaire appropriée (c.-à-d. nécrose accidentelle), soit d'une voie intracellulaire orchestrée (c.-à-d. nécrose réglementée). Dans les myofibers, les processus réglementés4 et non réglementés5 peuvent conduire à la nécrose. Une conséquence typique de la myonécrose est la libération de modèles de molécules associés aux dommages, activant une réponse inflammatoire puissante6. La présence de macrophages est observée à environ 48 h et 72 h après une blessure7. Outre leur rôle dans le déblaiement des débris nécrotiques, ils sont également importants dans la régénération musculaire8,9.
Les dystrophies musculaires (MD) sont un groupe hétérogène de pathologies qui résultent souvent d'un défaut dans la structure de sarcolemma. La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie juvénile liée à l'X qui touche environ 1 naissance masculine sur 3 500 dans le monde10,et elle est causée par l'absence d'expression de la dystrophine au sarcolemma. La dégénérescence chronique du tissu musculaire chez les garçons DMD conduit à une faiblesse musculaire extrême et la mortalité précoce. L'inflammation résultant de la mort nécrotique améliore la cytotoxicité, et favorise la fibrose musculaire et la perte de la fonction musculaire11,12. Les traitements actuellement en essais cliniques ciblant les racines des troubles dégénératifs musculaires, tels que la thérapie génique, devraient soulager la myonécrose. Des techniques simples pour quantifier avec précision la dégénérescence musculaire sont donc nécessaires.
Plusieurs méthodes sont couramment utilisées pour surveiller la perte de myofibre in vivo. La mesure de l'activité enzymatique de la créatine kinase (CK) dans le sang permet une quantification fiable de la nécrose continue dans les tissus musculaires et cardiaques. In situ, la coloration de l'hématoxylin et de l'éosine est la méthode la plus populaire actuellement utilisée dans le diagnostic pour évaluer le remodelage dégénérescence-régénération. Cependant, la base moléculaire de l'étiquetage des cellules mortes de h et E demeure incertaine. En outre, les modifications de couleur suggérant la mort de myofiber dans la coloration de H et E sont relativement subtiles et ne facilitent pas la quantification fiable et reproductible. Méthodes révélant la fragmentation de l'ADN, comme le terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end label (TUNEL), imparfaitement étiquette mort nécrotique3. Ils sont également mal adaptés pour surveiller la mort des cellules syncytiales telles que les myofibres. L'injection de colorants vitaux, comme le colorant bleu d'Evan (DME), représente une alternative utile pour évaluer les myofibres qui ont perdu l'intégrité du sarcolamme, mais n'est pas nécessairement pratique dans certains protocoles expérimentaux. Par exemple, la présence d'EBD dans les échantillons de sang peut affecter les résultats des mesures de CK, un test coloriable. En outre, l'utilisation intracellulaire de l'EBD rend la co-immunoétiquetage difficile. Par conséquent, une méthode alternative permettant l'étiquetage direct des myofibres subissant une nécrose est intéressante.
Le mécanisme d'action des colorants vitaux repose sur la perte de l'intégrité de la membrane plasmatique dans les myofibres nécrotiques et l'apport passif du colorant injecté. De même, les myofibres nécrotiques préservent les protéines sanguines telles que l'albumine, pour laquelle l'EBD a une forte affinité13,14, immunoglobuline G (IgG), et IgM15. La présence anormale de protéines sanguines dans les myofibres représente donc des marqueurs pratiques pour la myonécrose in situ. La coloration de ces protéines peut être une alternative pour l'utilisation de colorants vitaux.
En utilisant l'utilisation d'igG comme marqueur de myonecrosis in situ, ce protocole est employé pour évaluer la dégénérescence de muscle dans le tibialis antérieur (TA) des souris dystrophine-déficientes de mdx. Cette méthode présente des avantages significatifs par rapport aux techniques alternatives : 1) elle est reproductible et simple dans son exécution ; 2) il ne nécessite aucun traitement animal avant la collecte de muscle, tel que l'injection des colorants vitaux circulants, et 3) comme n'importe quel immunoétiquetage conventionnel, il est compatible avec le co-étiquetage.
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Protocol
Les expériences ont été menées conformément à la législation Français et communautaire européenne (numéro de licence 11-00010).
1. Préparation de gomme de Tragacanth
- Dans un bécher en verre, dissoudre 6 g de poudre de tragacanth dans 100 ml d'eau déionisée. Couvrir de papier d'aluminium et laisser reposer au moins 3 h. Parfois, remuer manuellement à l''œil d'une spatule métallique au fur et à mesure que le mélange devient visqueux.
- Laisser le mélange de tragacanth à 60 oC toute la nuit dans un bain d'eau ou au four. Scellez soigneusement le bécher pour éviter le séchage. Remuer au moins une fois avant de l'aliquiser.
- Aliquot et conserver à 4 oC jusqu'à 2 semaines.
2. Collection musculaire
REMARQUE : Pour cette expérience, une souris mâle de mdx de 4 semaines a été sacrifiée par la dislocation cervicale. Cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie et est une méthode de mise à mort sans nature conformément à la législation locale.
- Dissection du muscle antérieur de tibialis (TA)
- Après avoir rasé la jambe de souris, poser la souris sur le dos et épingler les pieds sur un panneau de liège avec des aiguilles. À l'aide de ciseaux de précision (ou d'un scalpel) et de forceps, retirez la peau de la jambe du pied jusqu'au genou pour exposer toute la longueur du tibia et du TA.
- Avec des ciseaux, faire une incision entre le tibia et Le TA. Cela facilitera la séparation du TA de l'os et fournira une adhérence facile à l'épimysium. À l'aide de forceps de précision, retirez soigneusement la couche d'épimysium de la surface du TA.
REMARQUE : À partir de cette étape, le TA peut être plus sensible au séchage, ce qui devrait être évité. - À la région de cheville, isolez le tendon de TA des autres tendons avec des forceps. Tirez doucement vers le haut du tendon De TA pour l'isoler du tibia et des muscles environnants.
- Lorsque le ventre TA est entièrement séparé, maintenez le tendon vers le haut de sorte que seule la partie proximale du muscle De TA soit attachée au genou. Couper doucement le tendon proximal aussi près que possible de l'os du genou.
- Placer le TA dans une gaze légèrement amortie avec saline pour éviter le séchage avant de geler le muscle.
- Pré-refroidir 70 à 100 ml d'isopentane dans un bécher en plastique ou en polytétrafluoroéthylène en le trempant partiellement dans de l'azote liquide. Laisser refroidir jusqu'à ce que l'isopentane au fond du bécher devienne un solide blanc.
- Sur un morceau circulaire de liège (20 mm x 11 mm x 8 mm), placez 0,5 ml de gomme tragacanth. Pré-étiqueter soigneusement l'autre côté du bouchon afin que la biopsie puisse être correctement identifiée après l'étape de congélation.
- Intégrer le TA dans la gencive avec des forceps, tendon distal. Pour permettre des sections transversales appropriées du muscle, maintenez le muscle avec son axe perpendiculaire à la surface du liège. La qualité des cryosections s'améliorera si la biopsie n'est pas complètement intégrée dans la gencive. Laisser au moins la moitié du TA (côté tendon) être découvert par la gencive.
- Trempez rapidement le bouchon avec le muscle incorporé dans la couche d'isopentane non congelée et froide. Notez que le bouchon flottera dans le liquide isopentane. Tenez l'échantillon à l'envers car le muscle doit être plongé dans l'isopentane. Laisser les échantillons dans l'isopentane pendant environ 2 minutes pour permettre un gel complet.
REMARQUE : À partir de ce stade, le TA doit rester congelé jusqu'à la cryosection. Conserver le muscle dans de la glace sèche avant d'être entreposé à long terme dans un congélateur de -80 oC.
3. Cryosectioning
- Fixer la température du cryostat à -25 oC. Maintenir la température de l'objet à environ -20 oC. Fixez l'objet dans le cryostat à l'aide d'un composé optimal de température de coupe (OCT). Couper le muscle jusqu'à atteindre le ventre musculaire, puis couper les sections de 7 à 10 m.
REMARQUE : La stabilisation de la température de l'objet nécessite au moins 10 min. - Conserver les lames de verre utilisées pour la collecte des cryosections à température ambiante (RT). Recueillir au moins deux sections sur chaque diapositive. Les sections musculaires colleront et dégeleront automatiquement au contact de la glissière de verre chaud. Retirez la glissière et gardez-la à RT.
- Laisser sécher les sections au moins 20 min à RT dans un environnement ventilé.
- Conserver les cryosections sur des lames de verre à -80 oC jusqu'à ce qu'elles soient utilisées.
4. Immunoétiquetage
- Décongeler les glissières à RT pendant au moins 15 min dans un environnement ventilé.
- Délimiter la zone des sections avec un stylo hydrophobe. Laisser sécher la barrière hydrophobe.
- Fixer le tissu avec 2% de paraformaldéhyde pendant 10 min dans une chambre humide.
- Laver les sections avec du phosphate tamponné saline (PBS) 2x pendant 5 min chacune.
- Bloquer les sections musculaires avec 10% de sérum de chèvre dilué dans PBS pendant 1 h à RT dans une chambre humide.
- Incuber les sections pendant 2 h à RT (ou pendant la nuit à 4 oC) dans une chambre humide avec les anticorps primaires dilués dans un sérum de chèvre de 5 %. Pour l'étiquetage simple d'utilisation d'IgG dans les myofibers, incubez seulement des sections avec l'anticorps de lapin à la pan-lamininin de souris.
REMARQUE : D'autres antigènes de la matrice extracellulaire peuvent être ciblés tant qu'ils fournissent l'étiquetage clair de la matrice extracellulaire environnante des myofibers. Les marqueurs pour la régénération musculaire, l'inflammation, ou d'autres paramètres peuvent être combinés tant que les anticorps ne sont pas soulevés dans un hôte de souris. Le microscope utilisé pour l'analyse devrait inclure une couleur de fluorescence supplémentaire. - Laver les sections avec PBS 3x pendant 5 min chacune.
- Incuber les sections avec de la chèvre fluorescente rouge anticorps secondaires polyclonal au lapin IgG H et L et vert fluorescent chèvre polyclonal anticorps secondaires à la souris IgG H et L. Incubate à RT pendant 45 min dans une chambre humide.
- Laver avec PBS 3x pendant 10 min chacun.
- Montez les sections dans le milieu de montage fluorescent contenant 100 ng/mL 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et couvrez chaque diapositive d'un bordereau.
- Laisser sécher pendant la nuit à 4 oC avant l'imagerie.
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Representative Results
Les myofibres sont entourées d'une matrice extracellulaire contenant de la laminin. La coloration rouge délimite la périphérie des myofibres et permet leur identification. IgG est affiché en vert. Les noyaux sont tachés de DAPI et se trouvent en bleu sous le microscope. Cependant, les noyaux sont représentés en blanc ici (Figure 1). Une faible immunoréactivité IgG est prévue dans le compartiment extracellulaire, qui peut être augmenté en cas d'inflammation. La coloration verte dans les myofibres reflète la présence d'IgG.
Les AtA de souris de Mdx sont caractérisés par une phase transitoire de myonecrosis aigu à 3 semaines d'âge, suivie des événements asynchrones de dégénérescence-régénération. Par conséquent, les ATT des souris mdx de 4 semaines présentent souvent des profils hétérogènes, y compris des zones mal touchées, et des zones dégénératives et régénératrices ensemble dans la même section transversale(figure 1a). Les zones musculaires non affectées ou légèrement affectées contiennent des myofibres de grande taille homogène, et les noyaux se trouvent à faible densité et sont principalement situés à la périphérie ou entre les myofibres (figure 1b). Les myofibres IgG-positives sont généralement absentes dans de telles zones saines ou légèrement affectées.
IgG-immunoreactivité dans les myofibers indique la myonécrose (Figure 1c, partie inférieure). Après la dégénérescence cellulaire, les fibres nécrotiques sont éliminées par les phagocytes. Les myofibres nouvellement formées présentent une petite taille aux premiers stades, puis s'agrandissent progressivement au fur et à mesure que les progéniteurs musculaires fusionnent et contribuent à la cellule syncytiale. Au cours de ce processus, les myonuclei restent à la position centrale. Des grappes de petits myofibres nucléements centraux indiquent des myofibres récemment régénératrices(figure 1c, partie supérieure).
Figure 1 : Image représentative de la coloration d'apport d'IgG dans une section transversale du muscle mdx dégénérant. (a) TA d'une souris mdx de 4 semaines a été cryosectionné et immunolabelled utilisant des anticorps à la pan-laminine élevée dans le lapin (rouge) et la souris IgG (vert). Les noyaux ont été étiquetés à l'aide de DAPI (blanc). (b, c) Zones élargies du panneau a. Barre d'échelle de 500 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La nécrose de myofiber est une conséquence commune de l'exercice traumatique dans les muscles normaux. Il est bien compensé par une puissante capacité régénératrice des ancêtres musculaires locaux. Cependant, dans plusieurs conditions musculaires telles que dans les MD, la capacité régénératrice des cellules satellites est compromise par la myonécrose chronique et la fibrose excessive. Des résultats récents montrent que les fibres musculaires peuvent mourir par nécroptose, une forme réglementée de nécrose. Plus précisément, l'inhibition de la nécroptose peut devenir une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement DMD4. L'étude des voies de mort cellulaire dans les désordres de dégénérescence de muscle exige des méthodes fiables de quantification de mort de cellules de muscle. Ce protocole décrit la technique d'immunofluorescence d'immunofluorescence d'adoption d'IgG qui étiquette des myofibers qui ont subi la nécrose.
La perte de l'intégrité de la membrane plasmatique qui caractérise la nécrose conduit à la libération de molécules associées aux dommages et à l'utilisation de protéines plasmatiques telles que l'albumine, l'IgG et l'IgM15. Le mécanisme d'action de la méthode d'étiquetage de l'utilisation igG est similaire à celui des colorants vitaux tels que l'EBD. Les myofibres nécrotiques deviennent perméables et emprisonnent les protéines sanguines des colorants vitaux injectés, alors que les cellules vivantes ne le font pas. La preuve de concept de cette technique a été validée par le groupe de Kevin Campbell sur mDs15, mais reste insuffisamment diffusée.
La figure 1 fournit des résultats typiques de l'étiquetage d'utilisation d'IgG dans les muscles dystrophiques affectés par la myonécrose. Avec un immunoétiquetage comprenant seulement trois couleurs (IgG en vert, matrice extracellulaire en rouge et noyaux en bleu/blanc). Plusieurs paramètres importants de l'histologie musculaire peuvent être quantifiés, y compris le nombre et la taille des myofibres et l'étendue de la myonécrose, exprimé soit par le pourcentage d'étiquetage dans la zone transversale ou le pourcentage de myofibres nécrotiques. Une estimation juste de la régénération peut également être déterminée avec cette coloration. En effet, la présence de myofibres nucléements central(figure 1c, partie supérieure) reflète la régénération locale et donc passé l'événement dégénérant. À titre de comparaison, les tissus musculaires sains sont présentés à la figure 1b. Il convient de noter que la nucléation centrale dans les myofibres nouvellement formées dure plusieurs semaines chez les myofibres régénérées de souris adultes. Cependant, le repositionnement nucléaire se produit beaucoup plus rapidement avant l'âge de soudage chez les souris16.
Ce type de résultat peut être facilement enrichi par l'ajout d'un autre étiquetage révélé par une autre couleur. Par exemple, la nature et le phénotype des cellules infiltrantes peuvent être examinés plus en profondeur à l'aide de marqueurs appropriés. Les anticorps dirigés contre cD68 étiqueteront de préférence les populations de macrophages, quel que soit leur statut inflammatoire4,9. Si nécessaire, le statut inflammatoire de ces cellules peut être étudié plus en détail17.
Comme toute coloration fluorescente conventionnelle, la qualité du muscle est cruciale. Les biopsies musculaires et les cryosections doivent être conservées dans la glace sèche en tout temps et pour un stockage à long terme à -80 oC jusqu'à leur utilisation. L'entreposage à -20 oC doit être évité car il pourrait affecter la préservation des tissus. Les cycles de gel-dégel des échantillons doivent également être strictement évités.
Cette technique présente des avantages significatifs par rapport aux techniques les plus populaires, telles que les taches EBD et H-E. Il est simple et flexible et ne nécessite que du matériel immunoétiquetage conventionnel et un microscope fluorescent. La flexibilité est offerte en ce qui concerne le choix de la couleur fluorophore associée à l'IgG en fonction des besoins expérimentaux, ainsi que la performance de la co-immunoétiquetage contre d'autres antigènes. À titre de comparaison, la tache de H et E et l'EBD ne peuvent être révélées que dans la même couleur et ne peuvent être associées à d'autres étiquetages pour évaluer des paramètres importants tels que l'emplacement de la myofibre ou l'étendue et la nature des cellules inflammatoires s'infiltrer. La méthode EBD nécessite l'injection de colorant des animaux autour de 24 h avant la récolte des muscles, tandis que la méthode d'apres IgG peut être effectuée dans tous les échantillons, y compris les humains. Toute la musculature des animaux injectés par EBD contient le colorant qui peut éventuellement affecter une analyse plus approfondie comme l'immunoétiquetage fluorescent des muscles ou l'analyse colorimétrique du sang CK.
Déterminer la quantification précise de la myonécrose implique de préférence un marqueur fiable de type cellulaire. Ici, la nature des cellules peut être évaluée avec le destin nécrotique en co-étiquetant IgG avec le compartiment extracellulaire entourant les myofibres. Dans la figure 1, les myofibres ont été identifiées à l'aide d'anticorps dirigés contre les protéines de la matrice extracellulaire environnante comme la lamininine. D'autres composants tels que le collagène peuvent également être tachés. Cependant, les anticorps contre les protéines appartenant au sarcolamme doivent être évités. D'après notre expérience, leur immunoréactivité disparaît rapidement à la suite d'une nécrose de la fibre.
L'immunoétiquetage de l'utilisation d'IgG dans les myofibers est une méthode simple et fiable pour tacher spécifiquement les fibres musculaires nécrotiques. Il peut être exécuté facilement et systématiquement et s'applique aux échantillons susceptibles de tacher l'immunofluorescence classique. Compte tenu de sa spécificité et de l'absence générale de contre-indications, il est recommandé d'utiliser comme étalon d'or pour l'évaluation de la myonécrose, quelle que soit la nature de la blessure nécrotique.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Association Française contre les Myopathies avec le programme Translamuscle. Les auteurs remercient le Dr Perla Reyes-Fernandez et le Dr Matthew Borok pour leur lecture attentive du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
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