Summary
ここで説明するプロトコルは、筋凍結切片における壊死性筋線維の直接免疫標識のためのプロトコルである。壊死細胞は、免疫グロブリンG(IgG)を含む血清タンパク質に透過性である。ミオファイバーによるIgGの取り込みを明らかにすることで、筋肉の状態に関係なく壊死を起こす筋線維の同定と定量を可能にする。
Abstract
筋線維の壊死(ミオネクロシス)は、筋ジストロフィーを含むいくつかの筋肉疾患の病因において中心的な役割を果たす。筋ジストロフィー病因の原因に対処する治療オプションは、筋肉の変性を緩和することが期待される。そのため、筋生検における細胞死の程度をアッセイおよび定量する方法が必要である。その上でミオファイバー変性を観察する従来の方法は、定量性が低いか、または重要な色素の注入に依存する。本稿では、免疫蛍光プロトコルは、ミオファイバーによる免疫グロブリンG(IgG)取り込みを標的とすることにより壊死性ミオファイバーを染色することを説明する。IgG取り込み方法は、1)損傷関連分子パターンの放出による血漿膜完全性の喪失および2)血漿タンパク質の取り込みを含む、壊死性の破壊を特徴とする細胞特徴に基づいている。マウス断面では、ミオファイバー、細胞外マトリックスタンパク質、マウスIgGの共免疫標識により、壊死性の運命を持つミオファイバーのクリーンで簡単な同定が可能になります。この簡単な方法は、定量分析に適しており、ヒトサンプルを含むすべての種に適用可能であり、重要な色素の注入を必要としません。IgG取り込みによる壊死性ミオファイバーの染色は、他の共免疫標識と対緒することもできる。
Introduction
縞状の骨格筋は、主に筋線維(筋線維)で構成され、特徴的な自発的収縮機能を担います。これらの細胞は、収縮中に発生する機械的ストレスをサポートする多核化された、有糸後の構造です。ミオファイバー膜(サルコレンマ)とその細胞外マトリックスの構造安定性は、組織恒常性のために重要である。衛星細胞は、成熟した骨格筋の主要な筋肉前駆集団を含み、健康な筋肉の静止状態に存在する。筋線維死後、筋再生は、衛星細胞の活性化、増殖、分化、融合を伴う筋細胞によって、最終的に新しい多核性ミオファイバーを形成する衛星細胞によって支持される。
ミオファイバーの消滅は、機械的外傷、虚血再灌流傷害、または筋ジストロフィーを含む複数の筋肉状態で起こり得、そして死細胞1、2の壊死形態に関連している。壊死は、形質膜の急速な透過性および細胞外コンパートメント3における細胞含有量の放出によって特徴付される。これは、適切な細胞シグナル伝達を伴う無秩序なプロセス(すなわち、偶発的壊死)、または調整された細胞内経路(すなわち、調節された壊死)のいずれかから生じ得る。ミオファイバーでは、規制された4プロセスと規制されていない5プロセスの両方が壊死につながる可能性があります。ミオネクロシスの典型的な結果は、損傷関連分子パターンの放出であり、強力な炎症反応を活性化する6。マクロファージの存在は、傷害7に続いて約48時間および72時間で観察される。壊死性残骸のクリアランスにおける彼らの役割に加えて、それらはまた、筋肉再生8、9で重要である。
筋ジストロフィー(MD)は、しばしばサルコレンマ構造の欠陥から生じる病理の異種グループである。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、世界中の3,500人の男性出生のうち約1人に影響を及ぼす若年性X結合疾患であり、サルコレンマにおけるジストロフィン発現の欠如によって引き起こされる。DMD少年の筋肉組織の慢性変性は、極端な筋力低下と早期死亡率につながる。壊死に起因する炎症は、細胞傷害性を増強し、筋線維化および筋機能の喪失を促進する11、12。現在、遺伝子治療などの筋肉変性疾患の根源を標的とした臨床試験中の治療法は、ミオネクロシスの緩和が期待されています。したがって、筋肉の変性を正確に定量する簡単な技術が必要です。
生体内のミオファイバー損失を監視するためにいくつかの方法が日常的に使用されます。血液中のクレアチンキナーゼ(CK)の酵素活性の測定は、筋肉および心臓組織における進行中の壊死の信頼性の高い定量を可能にする。現場では、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色は、変性再生リモデリングを評価するために診断に現在使用されている最も一般的な方法です。しかしながら、死細胞のH&E標識の分子基盤は不明のままである。さらに、H&E染色におけるミオファイバー死を示唆する色の改変は比較的微妙であり、信頼性が高く再現性の高い定量化を促進しない。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)などのDNA断片化を明らかにする方法は、不完全な標識壊死3。彼らはまた、ミオファイバーなどの同期細胞の死を監視するために不十分に適応されています。エヴァンの青色染料(EBD)のような重要な染料の注入は、サルコレンマの完全性を失ったミオファイバーを評価するのに有用な代替手段を表すが、一部の実験プロトコルでは必ずしも便利ではない。例えば、血液サンプル中のEBDの存在は、CK測定、比色アッセイの結果に影響を与えることができる。さらに、EBDの細胞内取り込みは、共免疫標識を困難にする。したがって、壊死を受けている筋線維の直接表示を可能にする代替方法が興味深い。
重要な色素の作用機序は、壊死性筋線維における血漿膜完全性の喪失と注入された色素の受動的な取り込みに依存する。同様に、壊死性筋線維は、アルブミンなどの血液タンパク質を取り込み、EBDが強い親和性を有する13、14、免疫グロブリンG(IgG)、およびIgM15である。したがって、ミオファイバー内の血液タンパク質の異常な存在は、その上のミオクロス症のための便利なマーカーを表します。これらのタンパク質を染色することは、重要な染料の使用のための代替手段であることができます。
IgG取り込みを上座でのミオネクロシスのマーカーとして使用することにより、このプロトコルは、mdxジストロフィン欠損マウスの脛骨前(TA)における筋肉変性を評価するために使用される。この方法は、代替技術よりも大きな利点を提示します: 1) 再現性があり、実行が簡単です。2)循環性重要色素の注入などの筋肉採取前の動物治療を必要とせず、3)従来の免疫標識として、共標識と互換性がある。
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Protocol
実験は、フランスおよび欧州共同体の法律(ライセンス番号11-00010)に従って行われました。
1. トラガカンスガムの調製
- ガラスビーカーに6gのトラガカンス粉末を100mLの脱イオン水に溶解する。ホイルで覆い、少なくとも3時間放置し、混合物が急速に粘性になると金属ヘラで手動でかき混ぜます。
- トラガカンス混合物は、水浴またはオーブンで一晩60°Cに残します。乾燥を避けるためにビーカーを慎重に密封してください。アリクォートの前に少なくとも一度かき混ぜる。
- アリコートと保存は4 °Cで最大2週間。
2. 筋肉のコレクション
注:この実験のために、4週齢の雄のmdxマウスが子宮頸部脱臼によって犠牲になった。この手順は麻酔を必要とせず、現地の法律に従って人道的な殺害方法です。
- 脛骨前筋(TA)の解剖
- マウスの脚を剃った後、背中にマウスを置き、針でコルクボードに足を固定します。精密はさみ(またはメス)と鉗子を使用して、足から膝までの脚の皮膚を取り除き、脛骨とTAの全長を露出させます。
- はさみで脛骨とTAの間に切開を行います。これは骨からのTAの分離を促進し、エピミシウムに容易なグリップを提供する。精密鉗子を使用して、TAの表面からエピミウム層を慎重に除去する。
メモ:このステップから、TAは乾燥の影響を受けやすくなるかもしれません。 - 足首領域で、TA腱を鉗子で他の腱から分離する。TA腱をそっと引き上げて脛骨や周囲の筋肉から隔離します。
- TA腹が完全に分離したら、TA筋肉の近位部分だけが膝に付着するように腱を持ち上げます。近位腱をできるだけ膝の骨に近づける。
- TAを生理線で軽く湿らせたガーゼに入れ、乾燥を避けてから筋肉を凍らせます。
- プラスチックまたはポリテトラフルオロエチレンビーカーにイソペンタンの70−100 mLを予め冷却し、液体窒素に部分的に浸漬する。ビーカーの底にあるイソペンタンが白い固体になるまで冷やします。
- 円形のコルク(20 mm x 11 mm x 8 mm)に、トラガカンスガムを~0.5 mL置きます。凍結工程後に生検を適切に識別できるように、コルクの反対側に慎重に事前ラベルを付けます。
- 鉗子、遠位腱を上げてガムにTAを埋め込みます。筋肉の適切な断面を許可するには、コルク表面に垂直な軸で筋肉を保持します。生検が完全にガムに埋め込まれていない場合、凍結切片の質は向上します。TA(腱側)の少なくとも半分がガムによって発見されることを許可する。
- すぐに未凍結、冷たいアイシペンタン層に埋め込まれた筋肉とコルクを浸します。コルクは液体アイノペンタンに浮かびますのでご注意ください。筋肉をイシペンタンに浸す必要があるので、サンプルを逆さまに保持します。完全な凍結を可能にするために、約2分間イモペンタンにサンプルを残します。
注:この段階から、TAは凍結されたままにしておかなければなりません。筋肉をドライアイスに保管してから、-80°Cの冷凍庫に長期保存してください。
3. クライオセクション
- クライオスタット温度を-25°Cに設定します。物体の温度は-20°C前後に保ちます。最適な切断温度(OCT)化合物を使用してクライオスタット内のオブジェクトを固定します。筋肉の腹に達するまで筋肉をトリミングし、7-10 μmのセクションをカットします。
メモ:物体温度の安定化には少なくとも10分が必要です。 - 室温(RT)で凍結切片を収集するために使用するガラススライドを保ちます。各スライドに少なくとも 2 つのセクションを収集します。筋肉のセクションは自動的に暖かいガラスのスライドの接触で固執し、解凍します。スライドを取り外し、RT に保管します。
- 換気された環境でRTで少なくとも20分乾燥させるセクションを許可します。
- 使用するまで-80°Cのガラススライドにクライオセクションを保管してください。
4. 免疫標識
- 換気環境で少なくとも15分間RTでスライドを解凍します。
- 疎水性ペンでセクション領域を線分化します。疎水性バリアを乾燥させます。
- 湿気の多いチャンバーで10分間、2%パラホルムアルデヒドで組織を固定します。
- リン酸緩衝生理食塩分(PBS)2xで切片をそれぞれ5分間洗浄する。
- 湿気の多い部屋のRTで1時間PBSで希釈した10%ヤギ血清で筋肉切片をブロックします。
- 5%ヤギ血清で希釈した一次抗体を用いて湿気の多いチャンバーでRT(または4°Cで一晩)で2時間の切片をインキュベートします。ミオファイバーにおける単純なIgG取り込みラベリングの場合、マウスパンラミニンにウサギ抗体を持つ切片のみをインキュベートする。
注:細胞外マトリックスの他の抗原は、ミオファイバーの周囲の細胞外マトリックスの明確な標識を提供する限り標的化することができる。筋肉再生、炎症、または他のパラメータのマーカーは、抗体がマウス宿主で上昇しない限り組み合わせることができる。分析に使用される顕微鏡は、補助蛍光色を含むべきである。 - 各5分間、PBS 3xでセクションを洗浄します。
- ウサギIgG H&Lと緑色蛍光ヤギポリクローナル二次抗体に赤色蛍光ヤギポリクローナル二次抗体を含む切片を、湿気の多いチャンバーでRTで45分間RTにインキュベートします。
- それぞれ10分間PBS 3xで洗浄します。
- 100 ng/mL 4',6-ジアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)を含む蛍光取り付け媒体のセクションを取り付け、各スライドをカバースリップで覆います。
- イメージングする前に4°Cで一晩乾燥させます。
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Representative Results
ミオファイバーは、ラミニン含有細胞外マトリックスに囲まれている。赤色染色はミオファイバーの周辺を区切り、その同定を可能にする。IgG は緑色で表示されます。核はDAPIで染色され、顕微鏡下で青色に見られる。しかし、核はここに白で示されている(図1)。弱いIgG免疫反応性は、炎症の場合に増加することができる細胞外コンパートメントで期待される。ミオファイバー内の緑色染色はIgGの存在を反映する。
MdxマウスTAは、3週齢における急性ミオネクロシスの一過性期を特徴とし、その後非同期変性再生イベントが続く。その結果、4週齢のmdxマウスのTAは、影響の低い領域を含む異種プロファイルを表示し、同じ断面で一緒に変性および再生領域を表示することが多い(図1a)。影響を受けない/軽度に影響を受けない筋肉領域は、大きく均質な大きさの筋線維を含み、核は低密度で発見され、主に周辺またはミオファイバーの間に位置する(図1b)。IgG陽性筋線維は、一般に、このような健康または軽度の患部に存在しない。
ミオファイバー内のIgG-免疫反応性は、ミオクロスシスを示す(図1c、下部)。細胞変性の後、壊死繊維は食細胞によってクリアされる。新たに形成された筋線維は、初期段階で小さなサイズを提示し、その後、筋肉前駆者が融合し、同期細胞に寄与するように徐々に拡大する。このプロセスの間、ミオヌクレインは中央の位置にとどまる。小さく、中央核化された筋線維のクラスターは、最近再生成された筋線維を示す(図1c、上部)。
図1:mdx筋の変性からの断面におけるIgG取り込み染色の代表的な画像。(a)4週齢のmdxマウスからのTAを凍結し、ウサギ(赤)およびマウスIgG(緑色)で飼育されたパンラミニンに対する抗体を用いて免疫標識した。核はDAPI(白色)を用いて標識した。(b, c)パネルa.スケールバー= 500μmの拡大領域はこちらをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
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Discussion
筋線維壊死は、正常な筋肉の外傷性運動の一般的な結果である。それは局所的な筋肉前駆者の強力な再生能力によって十分に補償される。しかし、MDのようないくつかの筋肉の状態では、衛星細胞の再生能力は慢性ミネクロシスおよび過剰な線維化によって損なわれる。最近の知見は、筋線維が壊死の調節形態である壊死によって死ぬことを示している。より具体的には、壊性の阻害は、DMD治療のための新しい治療戦略となり得る4.筋肉変性障害における細胞死経路を調べるには、筋細胞死定量の信頼性の高い方法が必要です。このプロトコルは、壊死を受けた筋線維を標識するIgG取り込み免疫蛍光技術を記述する。
壊死を特徴付ける血漿膜完全性の喪失は、損傷関連分子パターンの放出およびアルブミン、IgGおよびIgM15のような血漿タンパク質の取り込みにつながる。IgG取り込みラベリング法の作用機序は、EBDなどの重要な染料の作用機と類似している。壊死性筋線維は透過性になり、注射された重要な色素の血液タンパク質を捕捉しますが、生きている細胞は透過性を持っていません。この技術の概念実証は、ケビン・キャンベルのグループによってMD15で検証されましたが、まだ十分に普及されていません。
図1は、ミオネクロシスの影響を受けるジストロフィー性筋肉におけるIgG取り込みラベリングの典型的な結果を提供する。3色のみを含む1つの免疫標識(緑色のIgG、赤の細胞外マトリックス、青/白の核)を含む。筋ヒストロジーのいくつかの重要なパラメータは、筋線維の数と大きさおよびミオクロシスの程度を含め、断面領域における標識の割合または壊死性筋線維の割合のいずれかによって表される定量化することができる。再生の公正な推定は、この染色によっても決定することができる。実際、一元有核のミオファイバー(図1c、上部)の存在は局所再生を反映し、したがって変性事象を通過する。比較のために、健康な筋肉組織は図1bに提示される。注目すべき点は、新たに形成された筋線維における中心核形成は、成人マウスの再生された筋線維において数週間続く。しかしながら、核再配置は、マウス16における遠距離年齢の前に有意に速く起こる。
このタイプの結果は、別の色によって明らかにされた別のラベリングを追加することによって容易に情報を付け得る。例えば、浸潤細胞の性質および表現型は、適切なマーカーを用いてさらに調べられ得る。CD68に対する抗体は、炎症状態4、9に関係なく、マクロファージ集団を優先的に標識する。必要に応じて、これらの細胞の炎症状態をさらに調査することができる17。
従来の蛍光染色として、筋肉の質は非常に重要です。筋肉生検および凍結切片は、常にドライアイスに保持し、使用するまで-80°Cで長期保存する必要があります。-20°Cでの保存は、組織の保存に影響を与える可能性があるので避けるべきです。サンプルの凍結解凍サイクルも厳密に避けるべきです。
この技術は、EBDやH&E染色などの最も一般的な技術よりも大きな利点があります。シンプルで柔軟性があり、従来の免疫標識材料と蛍光顕微鏡のみが必要です。実験的な必要性に応じてIgGに関連する蛍光色の選択に関する柔軟性、ならびにさらなる抗原に対する共免疫標識の性能に関して提供される。比較として、H&E染色とEBDは同じ色でのみ明らかにすることができ、ミオファイバーの位置や炎症性細胞の浸潤の程度および性質などの重要なパラメータを評価するために他のラベリングに関連付けることはできません。EBD法は、筋肉を収穫する前に約24時間の動物の色素注入を必要とし、IgG取り込み方法は、ヒトを含む任意のサンプルで行うことができる。EBD注射動物の全体の筋肉には、筋肉の蛍光免疫標識や血液CK比色アッセイなどのさらなる分析に影響を与える可能性のある色素が含まれています。
ミロンクロスシスの正確な定量を決定することは、優先的に細胞型の信頼できるマーカーを意味する。ここで、細胞の性質は、Myofiberを取り巻く細胞外コンパートメントとIgGを共標識することにより壊死的運命と共に評価することができる。図1では、ミオファイバーをラミニンなどの周囲の細胞外マトリックスのタンパク質に対する抗体を用いて同定した。コラーゲンなどの他の成分も染色することができる。しかし、サルコレンマに属するタンパク質に対する抗体は避けるべきである。私たちの経験では、彼らの免疫反応性は、繊維の壊死に続いて速やかに消失します。
ミオファイバー内のIgG取り込みの免疫標識は、特に壊死性筋線維を染色するシンプルで信頼性の高い方法です。それは容易で、定期的に行うことができ、古典的な免疫蛍光染色に適したサンプルに適用可能である。その特異性と一般的な反抗の欠如を考慮して、壊死傷害の性質に関係なく、骨髄症評価のための金本位として使用することをお勧めします。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品は、トランスラマッスル・プログラムとの協会フランセーズ・コントレ・レ・ミオパシーによってサポートされました。著者たちは、ペルラ・レイエス=フェルナンデス博士とマシュー・ボロク博士が原稿を注意深く読んでくれたことに感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
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