Summary
Beskrevet her er en protokoll for direkte immunolabelling av nekrotisk myofibers i muskel cryosections. Nekrotisk celler er gjennomtrengelig for serumproteiner, inkludert immunglobulin G (IgG). Avslører opptaket av IgG ved myofibers tillater identifisering og kvantifisering av myofibers som gjennomgår nekrose uavhengig av muskel tilstand.
Abstract
Nekrose av muskelfibre (myonecrosis) spiller en sentral rolle i patogenesen av flere muskel forhold, inkludert muskel dystrofi. Terapeutiske alternativer adressering årsakene til muskel dystrofi patogenesen er ventet å lindre muskel degenerasjon. Derfor en metode for å analysen og kvantifisere omfanget av cellen død i muskel biopsier er nødvendig. Konvensjonelle metoder for å observere myofiber degenerasjon in situ er enten dårlig kvantitative eller stole på injeksjon av vitale fargestoffer. I denne artikkelen er en immunofluorescence protokoll beskrevet som flekker nekrotisk myofibers ved å målrette immunglobulin G (IgG) opptak av myofibers. IgG opptaket metoden er basert på celle funksjoner karakteriserer nekrotisk bortgang, inkludert 1) tap av plasma membran integritet med utgivelsen av skade-tilknyttede molekylære mønstre og 2) opptaket av plasmaproteiner. I murine tverrsnitt, immunolabelling av myofibers, ekstracellulære matrise proteiner, og mus IgG tillater ren og grei identifisering av myofibers med nekrotisk skjebne. Denne enkle metoden er egnet for kvantitativ analyse og gjelder for alle arter, inkludert menneskelige prøver, og krever ikke injeksjon av vitale fargestoff. Farging av nekrotisk myofibers av IgG-opptak kan også pares med andre co-immunolabelling.
Introduction
Striated Skjelettmuskel består hovedsakelig av muskelfibre (myofibers), som er ansvarlig for den karakteristiske frivillige kontraktile funksjon. Disse cellene er multinucleated, post-mitotisk strukturer som støtter mekanisk stress oppstår under sammentrekning. Strukturell stabilitet av myofiber membran (sarcolemma) og dens ekstracellulære matrise er avgjørende for vev homeostase. Satellitt celler utgjør den viktigste muskelen Stam befolkningen i modne skjelettlidelser muskel og finnes i en Quiescent tilstand i sunne muskler. Etter myofiber død, muskel regenerering støttes av satellitt celler etter en myogenic program som involverer satellitt celle aktivering, spredning, differensiering, og fusjon til slutt danne nye multinucleated myofibers.
Myofiber død kan forekomme i flere muskel forhold, inkludert mekaniske traumer, iskemi-reperfusion skader, eller muskuløse dystrofi, og det er forbundet med nekrotisk morfologi av døde celler1,2. Nekrotisk død er karakterisert ved rask permeabilitet av plasma membranen og frigjøring av celleinnhold i ekstracellulære kupé3. Det kan skyldes enten en uregulert prosess som involverer ingen skikkelig celle signal (dvs. utilsiktet nekrose), eller en orkestrert intracellulære veien (dvs. regulert nekrose). I myofibers, både regulert4 og uregulert5 prosesser kan føre til nekrose. En typisk konsekvens av myonecrosis er utgivelsen av skade-forbundet molekyl mønstre, aktivere en kraftig inflammatorisk respons6. Tilstedeværelsen av makrofager er observert på rundt 48 h og 72 h etter skade7. Foruten deres rolle i clearance av nekrotisk rusk, de er også viktig i muskel regenerering8,9.
Muskuløse dystrofi (MDs) er en heterogen gruppe av patologi som ofte skyldes en defekt i sarcolemma struktur. Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en juvenil X-koblet sykdom som berører ca 1 av hver 3 500 mannlige fødsler over hele verden10, og det er forårsaket av fraværet av dystrofingenet uttrykk på sarcolemma. Kronisk degenerasjon av muskel vev i DMD gutter fører til ekstrem muskelsvakhet og tidlig dødelighet. Betennelse som følge av nekrotisk død forbedrer cytotoksisitet, og fremmer muskel fibrose og tap av muskel funksjon11,12. Behandlinger for tiden i kliniske studier rettet mot røttene av muskel degenerative lidelser, som genterapi, forventes å lindre myonecrosis. Enkle teknikker for å nøyaktig kvantifisere muskel degenerasjon er derfor nødvendig.
Flere metoder brukes rutinemessig til å overvåke myofiber tap in vivo. Målingen av enzymatisk aktivitet av kreatin kinase (CK) i blodet gir pålitelig kvantifisering av pågående nekrose i muskler og hjerte vev. In situ, den haematoxylin og eosin (H & E) farging er den mest populære metoden i dag brukes i diagnosen for å vurdere degenerasjon-regenerering Remodelling. Imidlertid er det molekylære grunnlaget for H & E merking av døde celler uklart. Videre farge modifikasjoner antyder myofiber død i H & E flekker er relativt subtile og ikke rette for pålitelig og reproduserbar kvantifisering. Metoder avslørende DNA fragmentering, slik som Terminal deoksynukleotidyltransferase glutamyltransferase dUTP Nick end merking (TUNEL), ufullkomment Label nekrotisk død3. De er også dårlig tilpasset for å overvåke dødsfallet til syncytial celler som myofibers. Injeksjon av vitale fargestoffer, slik som Evan ' s blå fargestoff (EBD), representerer et nyttig alternativ for å vurdere myofibers som har mistet integriteten til sarcolemma, men er ikke nødvendigvis praktisk i noen eksperimentelle protokoller. For eksempel kan tilstedeværelsen av EBD i blodprøver påvirke resultatene av CK målinger, et fargemetrisk analysen. Videre gjør intracellulære opptak av EBD immunolabelling utfordrende. Derfor, en alternativ metode som tillater direkte merking av myofibers gjennomgår nekrose er av interesse.
Virkningsmekanismen av vitale fargestoffer er avhengig av tap av plasma membran integritet i nekrotisk myofibers og passiv opptak av injisert fargestoff. Tilsvarende nekrotisk myofibers opptak Blodproteiner som albumin, der EBD har en sterk affinitet13,14, immunglobulin G (IgG), og IgM15. Den unormale forekomsten av Blodproteiner i myofibers representerer derfor praktiske markører for myonecrosis in situ. Farging av disse proteinene kan være et alternativ for bruk av vitale fargestoffer.
Ved å bruke IgG opptak som en markør for myonecrosis in situ, denne protokollen brukes til å vurdere muskel degenerasjon i tibialispuls fremre (TA) av MDX dystrofingenet-mangelfull mus. Denne metoden presenterer betydelige fordeler fremfor alternative teknikker: 1) det er reproduserbar og enkel i utførelsen sin; 2) det krever ingen dyr behandling før muskel oppsamling, slik som injeksjon av sirkulerende vitale fargestoffer, og 3) som enhver konvensjonell immunolabelling, den er kompatibel med co-merking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter ble utført i samsvar med den franske og europeiske fellesskapslovgivningen (lisensnummer 11-00010).
1. Tragacanth tannkjøtt forberedelse
- I et glass beger, oppløse 6 g tragacanth pulver i 100 mL deionisert vann. Dekk med folie og la stå i minst 3 h. noen ganger røre manuelt med en metallspatel som blandingen raskt blir tyktflytende.
- La tragacanth blandingen ved 60 ° c over natten i et vannbad eller i ovnen. Forsiktig forsegle begeret for å unngå tørking. Rør minst en gang før aliquoting.
- Alikvot og oppbevares ved 4 ° c i opptil 2 uker.
2. Muscle samling
Merk: for dette eksperimentet, en 4-ukers-gammel mannlig MDX mus ble ofret av cervical forvridning. Denne prosedyren krever ikke anestesi og er en human Killing metode i samsvar med lokal lovgivning.
- Disseksjon av tibialispuls fremre (TA) muskel
- Etter barbering musa beinet, Legg musen på ryggen og PIN føttene på en corkboard med nåler. Ved hjelp av presisjon saks (eller en skalpell) og tang, fjerne benet huden fra foten opp til kneet for å avdekke hele lengden av Tibia og TA.
- Med saks, gjør et snitt mellom Tibia og TA. Dette vil lette separasjon av TA fra benet og gir et enkelt grep til epimysium. Ved hjelp av presisjon tang, forsiktig fjerne epimysium laget fra overflaten av TA.
Merk: fra dette trinnet, kan TA være mer utsatt for tørking, som bør unngås. - På ankelen regionen, isolere TA sene fra andre sener med tang. Trekk forsiktig opp TA sene for å isolere den fra Tibia og omkringliggende musklene.
- Når TA magen er helt separert, hold senen opp slik at bare den proksimale delen av TA muskelen er festet til kneet. Forsiktig bryte proksimale sene så nært som mulig til kneet beinet.
- Plasser TA i et gasbind som er lett fuktet med saltvann for å unngå tørking før frysing av muskelen.
- Pre-Cool 70 − 100 mL isopentane i et plast eller polytetrafluoretylen beger ved å delvis dyppe den i flytende nitrogen. La den avkjøles til isopentane på bunnen av begeret blir en hvit solid.
- På en sirkulær stykke kork (20 mm x 11 mm x 8 mm), plass ~ 0,5 mL tragacanth tyggegummi. Nøye pre-Label den andre siden av korken, slik at biopsi kan være riktig identifisert etter frysing trinn.
- Bygg inn TA i tannkjøttet med tang, som kan For å tillate riktig tverrsnitt av muskelen, hold muskelen med sin akse vinkelrett på kork overflaten. Kvaliteten på cryosections vil øke hvis biopsi ikke er helt innebygd i tannkjøttet. Tillat minst halvparten av TA (sene side) å bli avdekket av tyggegummi.
- Raskt dyppe korken med den innebygde muskelen i frosne, kaldt isopentane lag. Merk at korken vil flyte i væsken isopentane. Hold prøven opp ned som muskelen må dyppet i isopentane. La prøvene i isopentane for ca 2 min for å tillate fullstendig frysing.
Merk: fra dette stadiet må TA være frosset til cryosection. Oppbevar muskelen i tørr is før langtidslagring i en-80 ° c fryser.
3. kryosnitt
- Still inn den kryostaten temperaturen ved-25 ° c. Hold objekt temperaturen på rundt-20 ° c. Fest objektet i kryostaten ved hjelp av optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte. Trim muskelen til nå muskelen magen deretter kuttet 7 − 10 μm seksjoner.
Merk: stabilisering av objekt temperaturen krever minst 10 min. - Hold glass lysbilder brukes til å samle cryosections ved romtemperatur (RT). Samle minst to inndelinger på hvert lysbilde. Muskelen delene vil automatisk stikke og tine ved kontakt av den varme glass Slide. Fjern lysbildet og oppbevar det på RT.
- La delene tørke minst 20 min ved RT i et ventilert miljø.
- Oppbevar cryosections på glass lysbilder ved-80 ° c til bruk.
4. Immunolabelling
- Tin lysbildene på RT i minst 15 minutter i et ventilert miljø.
- Avgrense seksjonene området med en hydrofobe penn. La hydrofobe barriere tørke.
- Fest vevet med 2% paraformaldehyde i 10 min i et fuktig kammer.
- Vask delene med fosfat bufret saltvann (PBS) 2x i 5 minutter hver.
- Blokker muskel seksjoner med 10% geit serum fortynnet i PBS for 1 time ved RT i et fuktig kammer.
- Ruge seksjonene for 2 h ved RT (eller over natten ved 4 ° c) i et fuktig kammer med den primære antistoffer fortynnet i 5% geit serum. For enkel IgG-opptak merking i myofibers, bare ruge seksjoner med kanin antistoff til mus Pan-laminin.
Merk: andre antigener av ekstracellulære matrise kan være målrettet så lenge de gir klar merking av den omkringliggende ekstracellulære matrise av myofibers. Markører for muskel regenerering, betennelse, eller andre parametre kan kombineres så lenge Antistoffene ikke er reist i en mus vert. Mikroskopet som brukes for analysen, bør inneholde en supplerende fluorescens farge. - Vask delene med PBS 3x i 5 minutter hver.
- Ruge seksjonene med rød fluorescerende geit polyklonale sekundært antistoff mot kanin IgG H & L og grønn fluorescerende geit polyklonale sekundært antistoff til mus IgG H & L. ruge ved RT for 45 min i et fuktig kammer.
- Vask med PBS 3x i 10 minutter hver.
- Monter seksjonene i fluorescerende montering medium som inneholder 100 ng/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og dekker hvert lysbilde med en dekkglass.
- Tillat tørking over natten ved 4 ° c før bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myofibers er omgitt av en laminin-inneholdende ekstracellulære matrise. Rød farging avgrenser myofibers periferi og gir mulighet for deres identifikasjon. IgG er vist i grønt. Kjerner er farget med DAPI og er funnet blå under mikroskopet. Men kjerner er vist i hvitt her (figur 1). En svak IgG-immunoreactivity forventes i ekstracellulære rommet, som kan økes i tilfelle betennelse. Grønne flekker innenfor myofibers reflekterer tilstedeværelsen av IgG.
MDX-mus TAs er preget av en forbigående fase av akutt myonecrosis på 3 ukers alder, etterfulgt av asynkron degenerasjon-regenerering hendelser. Som en konsekvens viser TAs fra 4-ukers-gamle MDX-mus ofte heterogene profiler inkludert dårlig rammede områder, og degenereres og regenererende områder sammen i samme tverrsnitt (figur 1a). Upåvirket/mildt påvirket muskel områder inneholder myofibers med stor og homogen størrelse, og kjerner er funnet ved lav tetthet og er i hovedsak plassert i periferien eller mellom myofibers (figur 1b). IgG-positive myofibers er vanligvis fraværende i slike sunne eller mildt berørte områder.
IgG-immunoreactivity innenfor myofibers indikerer myonecrosis (figur 1c, nedre del). Etter celle degenerasjon er nekrotisk fibre ryddet ut av phagocytes. Nyopprettede myofibers presentere liten størrelse på tidlige stadier, og deretter gradvis forstørre som muskel forfedre sikring og bidra til syncytial cellen. I løpet av denne prosessen forblir myonuclei i den sentrale posisjonen. Klynger av små, sentralt kjerne myofibers indikerer nylig regenererende myofibers (figur 1c, øvre del).
Figur 1: representative bilde av IgG opptak farging i et tverrsnitt fra degenereres MDX muskel. (a) ta fra en 4-ukers-gammel MDX mus ble cryosectioned og immunolabelled bruker antistoffer for å panorere-laminin oppvokst i kanin (rød) og mus IgG (grønn). Kjerner ble merket med DAPI (hvit). (b, c) Forstørrede områder i panelet a. Scale bar = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myofiber nekrose er en vanlig konsekvens av traumatisk trening i normale muskler. Det er godt kompensert av en kraftig regenererende kapasitet på den lokale muskel forfedre. Men, i flere muskel forhold som i MDs, regenererende kapasitet av satellitt celler er kompromittert av kroniske myonecrosis og overdreven fibrose. Nylige funn viser at muskelfibre kan dø av necroptosis, en regulert form for nekrose. Mer spesifikt kan hemming av necroptosis bli en ny terapeutisk strategi for DMD behandling4. Gransker celle død trasé i muskel degenerasjon lidelser krever pålitelige metoder for muskel celle død kvantifisering. Denne protokollen beskriver IgG opptaket immunofluorescence teknikk som merker myofibers som gjennomgikk nekrose.
Tapet av plasma membran integritet som karakteriserer nekrose fører til utgivelsen av skade-tilknyttede molekyler mønstre og opptak av plasmaproteiner som albumin, IgG og IgM15. Virkningsmekanismen av IgG-opptaket merking metoden er lik som vitale fargestoffer som EBD. Nekrotisk myofibers blir gjennomtrengelig og felle Blodproteiner av injisert vitale fargestoffer, mens levende celler ikke. Proof-of-konseptet av denne teknikken har blitt validert av Kevin Campbell ' s gruppe på MDs15 , men er fortsatt utilstrekkelig spres.
Figur 1 gir typiske resultater for merking av IgG-opptak i dystrophic muskler som påvirkes av myonecrosis. Med en immunolabelling inkludert bare tre farger (IgG i grønt, ekstracellulære matrise i rødt og kjerner i blått/hvitt). Flere viktige parametre for muskel histologi kan være kvantifisert, inkludert antall og størrelsen på myofibers og omfanget av myonecrosis, uttrykt enten ved prosentandelen av merking i tverrsnitt eller prosentandel av nekrotisk myofibers. En rettferdig estimering av regenerering kan også bestemmes med denne farging. Faktisk, tilstedeværelsen av sentralt kjerne myofibers (figur 1c, øvre del) reflekterer lokal regenerering og dermed forbi degenereres hendelsen. Til sammenligning er sunt muskel vev presentert i figur 1b. Av notatet varer sentral kjernedannelse i nyopprettede myofibers i flere uker i den fornyet myofibers av voksne mus. Men, kjernefysisk omplassering skjer betydelig raskere før avvenning alder i mus16.
Denne typen resultat kan lett beriket ved å legge en annen merking avslørt av en annen farge. For eksempel kan arten og fenotype av de infiltrere cellene undersøkes ytterligere ved hjelp av egnede markører. Antistoffer rettet mot CD68 vil fortrinnsvis merke macrophage populasjoner, uavhengig av deres inflammatorisk status4,9. Om nødvendig kan den inflammatoriske status av disse cellene bli ytterligere undersøkt17.
Som noen konvensjonelle fluorescerende flekker, er kvaliteten på muskelen avgjørende. Muskel biopsier og cryosections bør oppbevares i tørt is til enhver tid og for langtidslagring ved-80 ° c til bruk. Lagring ved-20 ° c bør unngås, da det kan påvirke vevs bevaring. Freeze-tine sykluser av prøvene bør også unngås strengt.
Denne teknikken har betydelige fordeler i forhold til de mest populære teknikkene, som for eksempel EBD og H & E flekker. Det er enkelt og fleksibelt og krever bare konvensjonelt immunolabelling materiale og et fluorescerende mikroskop. Fleksibilitet tilbys når det gjelder valg av fluoroforen farge assosiert med IgG i henhold til eksperimentelle behov, samt om utførelsen av co-immunolabelling mot ytterligere antigener. Som en sammenligning kan H & E flekk og EBD bare avsløres i samme farge og kan ikke knyttes til annen merking for å vurdere viktige parametre som myofiber plassering eller omfanget og arten av inflammatorisk celle infiltrere. EBD-metoden krever Dye injeksjon av dyr rundt 24 h før høsting musklene, mens IgG opptaket metoden kan utføres i noen prøver, inkludert mennesker. Hele muskulaturen av EBD-injisert dyr inneholder fargestoff som kan muligens påvirke videre analyse som fluorescerende immunolabelling av muskler eller blod CK fargemetrisk analysen.
Å bestemme den presise kvantifisering av myonecrosis fortrinnsvis innebærer en pålitelig markør av celle type. Her kan innholdet i cellene bli vurdert sammen med nekrotisk skjebne ved co-merking IgG med ekstracellulære kupé rundt myofibers. I figur 1ble myofibers identifisert ved hjelp av antistoffer rettet mot proteiner av de omkringliggende ekstracellulære matrise som laminin. Andre komponenter som kollagen kan også være beiset. Antistoffer mot proteiner som tilhører sarcolemma bør imidlertid unngås. I vår erfaring, forsvinner deres immunoreactivity umiddelbart etter nekrose av fiber.
Immunolabelling av IgG-opptak innenfor myofibers er en enkel og pålitelig metode for å spesifikt flekk nekrotisk muskelfibre. Det kan være enkelt og rutinemessig utført og gjelder for prøver mottagelig for klassisk immunofluorescence farging. Betenke dens spesifisitet og General mangel på counterindications, det er en anbefalt å bruk som gullet målestokk for myonecrosis vurderingen, uten hensyn til arten av det nekrotisk skaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av foreningen Française contre Les myopatier med Translamuscle programmet. Forfatterne takker Dr. Perla Reyes-Fernandez og Dr. Matthew Borok for deres nøye lesning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
