Summary
Descrito aqui é um protocolo para imunorotulagem direta de miofibras necróticas em criosecções musculares. As células necróticas são permeáveis para as proteínas séricas, incluindo a imunoglobulina G (IgG). Revelar a captação de IgG por miofibras permite a identificação e quantificação de miofibras que sofrem necrose, independentemente da condição muscular.
Abstract
A necrose das fibras musculares (mionecrose) desempenha um papel central na patogênese de várias condições musculares, incluindo distrofias musculares. Espera-se que as opções terapêuticas que abordem as causas da patogênese da distrofia muscular aliviem a degeneração muscular. Portanto, um método para ensaio e quantificar a extensão da morte celular em biópsias musculares é necessário. Métodos convencionais para observar a degeneração da miofibra in situ são pouco quantitativos ou dependem da injeção de corantes vitais. Neste artigo, um protocolo de imunofluorescência é descrito que mancha miofibras necróticas, visando a captação de imunoglobulina G (IgG) por miofibras. O método de captação de IgG é baseado em características celulares que caracterizam a morte necrótica, incluindo 1) a perda de integridade da membrana plasmática com a liberação de padrões moleculares associados a danos e 2) a captação de proteínas plasmáticas. Nas seções transversais de urina, a co-imunorotulagem de miofibras, proteínas de matriz extracelular e o mouse IgG permite a identificação limpa e direta das miofibras com destino necrótico. Este método simples é adequado para análise quantitativa e aplicável a todas as espécies, incluindo amostras humanas, e não requer a injeção de tinudura vital. A coloração de miofibras necróticas pela captação de IgG também pode ser emparelhada com outras co-imunorotulagem.
Introduction
O músculo esquelético estriado consiste principalmente em fibras musculares (miofibras), que são responsáveis pela função contélica voluntária característica. Essas células são estruturas multinucleadas e pós-mitocômicas que suportam o estresse mecânico ocorrendo durante a contração. A estabilidade estrutural da membrana de miofibra (sarcolemia) e sua matriz extracelular são cruciais para a homeostase do tecido. As células de satélite compreendem a principal população de progenitores musculares no músculo esquelético maduro e existem em estado quiescente em músculos saudáveis. Após a morte por miofibra, a regeneração muscular é apoiada por células via satélite após um programa miogênico que envolve ativação de células via satélite, proliferação, diferenciação e fusão para, em última análise, formar novas miofibras multinucleadas.
A morte da miofibra pode ocorrer em múltiplas condições musculares, incluindo trauma mecânico, lesões de isquemia-reperfusão ou distrofias musculares, e está associada à morfologia necrótica das células mortas1,2. A morte necrótica é caracterizada pela permeabilidade rápida da membrana plasmática e liberação de conteúdo celular no compartimento extracelular3. Pode resultar de um processo não regulamentado que não envolva nenhuma sinalização celular adequada (ou seja, necrose acidental) ou de uma via intracelular orquestrada (ou seja, necrose regulada). Em miofibras, ambos regulamentados4 enão regulamentados 5 processos podem levar à necrose. Uma conseqüência típica da mioneconese é a liberação de padrões de moléculas associados a danos, ativando uma poderosa resposta inflamatória6. A presença de macrófagos é observada em torno de 48 h e 72 h após lesão7. Além de seu papel na limpeza de detritos necróticos, eles também são importantes na regeneração muscular8,9.
Distrofias musculares (DM) são um grupo heterogêneo de patologias que muitas vezes resultam de um defeito na estrutura da sarcolema. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença juvenil ligada ao X que afeta aproximadamente 1 em cada 3.500 nascimentos masculinos em todo o mundo10,e é causada pela ausência de expressão de distrofina na sarcolema. A degeneração crônica do tecido muscular em meninos dmd leva a extrema fraqueza muscular e mortalidade precoce. Inflamação resultante da morte necrótica aumenta a citotoxicidade, e promove a fibrose muscular e a perda da função muscular11,12. Tratamentos atualmente em ensaios clínicos visando as raízes de distúrbios degenerativos musculares, como a terapia gênica, são esperados para aliviar a mioneconese. Técnicas simples para quantificar com precisão a degeneração muscular são, portanto, necessárias.
Vários métodos são rotineiramente usados para monitorar a perda de miofibra in vivo. A medição da atividade enzimática da cineza de creatina (CK) no sangue permite quantificação confiável da necrose contínua nos tecidos musculares e cardíacos. In situ, a coloração hematoxilina e eosina (H&E) é o método mais popular usado atualmente no diagnóstico para avaliar a remodelação da regeneração da degeneração. No entanto, a base molecular da rotulagem de H&E das células mortas ainda não está clara. Além disso, modificações de cor que sugerem morte por miofibra na coloração de H&E são relativamente sutis e não facilitam a quantificação confiável e reproduzível. Métodos que revelam a fragmentação do DNA, como o terminal desoxinucleotidyl transferase dUTP nick end labelling (TUNEL), imperfeitamente rotular morte necrótica3. Eles também são mal adaptados para monitorar a morte de células sincrial, como miofibras. A injeção de corantes vitais, como o corante azul de Evan (EBD), representa uma alternativa útil para avaliar miofibras que perderam a integridade da sarcolema, mas não é necessariamente conveniente em alguns protocolos experimentais. Por exemplo, a presença de EBD em amostras de sangue pode afetar os resultados das medições de CK, um ensaio colorimétrico. Além disso, a adposição intracelular de EBD torna a co-imunorotulagem desafiadora. Portanto, um método alternativo que permite a rotulagem direta das miofibras submetidas à necrose é de interesse.
O mecanismo de ação de corantes vitais depende da perda da integridade da membrana plasmática em miofibras necróticas e da captação passiva do corante injetado. Da mesma forma, as miofibras necróticas captam proteínas do sangue, como a albumina, para a qual a EBD tem uma forte afinidade13,14, imunoglobulina G (IgG) e IgM15. A presença anormal de proteínas do sangue dentro de miofibras, portanto, representa marcadores convenientes para mioneconese in situ. Manchar estas proteínas pode ser uma alternativa para o uso de corantes vitais.
Usando a captação de IgG como um marcador da mioneconese in situ, este protocolo é usado para avaliar a degeneração muscular no tibialis anterior (TA) de camundongos deficientes em distrophina mdx. Este método apresenta vantagens significativas sobre técnicas alternativas: 1) é reproduzível e simples em sua execução; 2) não requer qualquer tratamento animal antes da coleta muscular, como a injeção de corantes vitais circulantes, e 3) como qualquer imunorotulagem convencional, é compatível com a co-rotulagem.
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Protocol
Os experimentos foram realizados de acordo com a legislação da Comunidade Francesa e Europeia (licença número 11-00010).
1. Preparação da goma de Tragacanth
- Em um copo de vidro, dissolva 6 g de pó de tragacanth em 100 mL de água desionizada. Cubra com papel alumínio e deixe por pelo menos 3 h. Ocasionalmente mexa manualmente com uma espátula de metal como a mistura rapidamente se torna viscosa.
- Deixe a mistura de tragacanth a 60 °C durante a noite em um banho de água ou no forno. Selar cuidadosamente o copo para evitar a secagem. Mexa pelo menos uma vez antes de adianizar.
- Aliquot e armazenar a 4 °C por até 2 semanas.
2. Coleção do músculo
NOTA: Para este experimento, um rato mdx macho de 4 semanas de idade foi sacrificado por luxação cervical. Este procedimento não requer anestesia e é um método de matança humana de acordo com a legislação local.
- Dissecação do músculo tibialis anterior (TA)
- Depois de raspar a perna do rato, coloque o rato de costas e pine os pés em um quadro de cortiça com agulhas. Usando tesoura de precisão (ou um bisturi) e fórceps, retire a pele da perna do pé até o joelho para expor todo o comprimento da tíbia e TA.
- Com tesoura, faça uma incisão entre a tíbia e o TA. Isto facilitará a separação do TA do osso e fornecerá um aperto fácil ao epimysium. Usando fórceps de precisão, retire cuidadosamente a camada de epimisão da superfície do TA.
NOTA: A partir desta etapa, o TA pode ser mais suscetível à secagem, que deve ser evitada. - Na região do tornozelo, isolar o tendão TA de outros tendões com fórceps. Puxe suavemente o tendão TA para isolá-lo da tíbia e músculos circundantes.
- Quando a barriga TA é totalmente separada, segure o tendão para cima de modo que apenas a parte proximal do músculo TA está ligado ao joelho. Cortar suavemente o tendão proximal o mais próximo possível do osso do joelho.
- Coloque o TA em uma gaze que é levemente umedecido com soro para evitar a secagem antes de congelar o músculo.
- Pré-cool 70-100 mL de isopentane em um plástico ou copo de politetrafluoroetileno, mergulhando parcialmente em nitrogênio líquido. Deixe esfriar até que o isopentane na parte inferior do copo se torne um sólido branco.
- Em um pedaço circular de cortiça (20 mm x 11 mm x 8 mm), coloque ~ 0,5 mL de goma tragacanth. Cuidadosamente pré-rotular o outro lado da cortiça para que a biópsia pode ser devidamente identificado após a etapa de congelamento.
- Incorporar o TA na goma com fórceps, tendão distal para cima. Para permitir seções transversais apropriadas do músculo, segure o músculo com seu eixo perpendicular à superfície da cortiça. A qualidade das criossecções melhorará se a biópsia não estiver completamente incorporada na gengiva. Permita que pelo menos metade do TA (lado do tendão) seja descoberto pela gengiva.
- Mergulhe rapidamente a cortiça com o músculo embutido na camada de isopentane descongelada e fria. Note-se que a cortiça vai flutuar no líquido isopentane. Segure a amostra de cabeça para baixo como o músculo precisa ser mergulhado em isopentane. Deixe as amostras no isopentane por cerca de 2 min para permitir o congelamento completo.
NOTA: A partir desta fase, o TA deve permanecer congelado até criosecção. Guarde o músculo no gelo seco antes do armazenamento a longo prazo em um congelador de -80 °C.
3. Criossecagem
- Definir a temperatura do criostat em -25 °C. Mantenha a temperatura do objeto em torno de -20 °C. Corrigir o objeto no criostat usando temperatura de corte ideal (OCT) composto. Apare o músculo até atingir a barriga muscular, em seguida, corte 7-10 seções μm.
NOTA: A estabilização da temperatura do objeto requer pelo menos 10 min. - Mantenha lâminas de vidro usadas para coletar criosecções à temperatura ambiente (RT). Colete pelo menos duas seções em cada slide. As seções musculares irão automaticamente ficar e descongelar no contato do slide de vidro quente. Retire o slide e mantê-lo em RT.
- Permitir que as seções sequem pelo menos 20 min no RT em um ambiente ventilado.
- Guarde as criosmas em lâminas de vidro a -80 °C até o uso.
4. Imunorotulagem
- Descongele slides em RT por pelo menos 15 min em um ambiente ventilado.
- Delineie a área das seções com uma pena hidrofóbica. Permita que a barreira hidrofóbica seque.
- Corrija o tecido com paraformaldeído de 2% por 10 min em uma câmara úmida.
- Lave as seções com sosseo-soline tampão de fosfato (PBS) 2x por 5 min cada.
- Bloqueie as seções musculares com 10% de soro de cabra diluído em PBS por 1 h em RT em uma câmara úmida.
- Incubar as seções para 2 h em RT (ou durante a noite em 4 °C) em uma câmara úmida com os anticorpos primários diluídos em 5% de soro de cabra. Para a rotulagem simples da captação de IgG em miofibras, apenas incubação seções com anticorpo coelho para rato pan-laminina.
NOTA: Outros antígenos da matriz extracelular podem ser direcionados, desde que forneçam uma rotulagem clara da matriz extracelular circundante das miofibras. Marcadores para regeneração muscular, inflamação ou outros parâmetros podem ser combinados, desde que os anticorpos não são levantadas em um hospedeiro do mouse. O microscópio utilizado para a análise deve incluir uma cor suplementar de fluorescência. - Lave as seções com PBS 3x por 5 min cada.
- Incubar as seções com anticorpo secundário policlonal de cabra fluorescente vermelha para coelho IgG H&L e anticorpo secundário policlonal de cabra fluorescente verde para camundongoIgH&L. Incubate em RT por 45 min em uma câmara úmida.
- Lave com PBS 3x por 10 min cada.
- Monte as seções em médio de montagem fluorescente contendo 100 ng/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e cubra cada slide com um coverslip.
- Deixe a secagem durante a noite a 4 °C antes da imagem.
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Representative Results
As miofibras estão cercadas por uma matriz extracelular contendo laminina. A coloração vermelha delimita a periferia das miofibras e permite sua identificação. IgG é mostrado em verde. Os núcleos são manchados com DAPI e são encontrados azuis o microscópio. No entanto, os núcleos são mostrados em branco aqui (Figura 1). Uma imunoreatividade IgG fraca é esperada no compartimento extracelular, que pode ser aumentado em caso de inflamação. A coloração verde dentro das miofibras reflete a presença de IgG.
Os TAs do rato de Mdx são caracterizados por uma fase transitória da mioneconese aguda em 3 semanas da idade, seguida sostíncronos eventos da degeneração-regeneração. Como conseqüência, TAs de camundongos mdx de 4 semanas de idade, muitas vezes exibem perfis heterogêneos, incluindo áreas mal afetadas, e degenerando e regenerando áreas em conjunto na mesma seção transversal (Figura 1a). As áreas musculares não afetadas/levemente afetadas contêm miofibras com tamanho grande e homogêneo, e os núcleos são encontrados em baixa densidade e estão localizados principalmente na periferia ou entre miofibras (Figura 1b). As miofibras igg-positivas estão geralmente ausentes em áreas tão saudáveis ou levemente afetadas.
IgG-imunoreatividade dentro de miofibras indica mioneconese (Figura 1c, parte inferior). Após a degeneração celular, as fibras necróticas são eliminadas por fagócitos. Miofibras recém-formadas apresentam pequeno tamanho nos estágios iniciais e, em seguida, ampliam progressivamente à medida que os progenitores musculares se fundem e contribuem para a célula sincicial. Durante este processo, os mionuclei permanecem na posição central. Aglomerados de miofibras pequenas e centralmente nucleadas indicam miofibras recentemente regeneradoras(Figura 1c,parte superior).
Figura 1: Imagem representativa da reprodução da IgG em uma seção transversal de degeneração do músculo mdx. (a)TA de um rato mdx de 4 semanas de idade foi criosecado e imunorotulado usando anticorpos para pan-laminina levantada em coelho (vermelho) e rato IgG (verde). Os núcleos foram rotulados usando DAPI (branco). (b, c) Áreas ampliadas do painel a. Barra de escala = 500 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Necrose da miofibra é uma conseqüência comum do exercício traumático em músculos normais. É bem compensado por uma poderosa capacidade regenerativa dos progenitores musculares locais. No entanto, em várias condições musculares, como em DMs, a capacidade regenerativa das células de satélite é comprometida pela mioneconese crônica e fibrose excessiva. Os resultados recentes mostram que as fibras musculares podem morrer por necroptose, uma forma regulada de necrose. Mais especificamente, a inibição da necroptose pode se tornar uma nova estratégia terapêutica para o tratamento de DMD4. Investigar vias de morte celular em distúrbios de degeneração muscular requer métodos confiáveis de quantificação da morte de células musculares. Este protocolo descreve a técnica de imunofluorescência de captação do IgG que rotula miofibras que foram submetidas à necrose.
A perda da integridade da membrana plasmática que caracteriza a necrose leva à liberação de padrões de moléculas associadas a danos e à captação de proteínas plasmáticas como albumina, IgG e IgM15. O mecanismo de acção do método de rotulagem de captação do IgG é semelhante ao de corantes vitais, como o EBD. Miofibras necróticas tornam-se permeáveis e prendem proteínas do sangue de corantes vitais injetados, enquanto as células vivas não. A prova de conceito desta técnica foi validada pelo grupo de Kevin Campbell sobre MDs15, mas permanece insuficientemente disseminada.
A Figura 1 fornece resultados típicos da rotulagem de captação do IgG nos músculos distróficos afetados pela mioneconese. Com uma imunorotulagem, incluindo apenas três cores (IgG em verde, matriz extracelular em vermelho e núcleos em azul / branco). Vários parâmetros importantes da histologia muscular podem ser quantificados, incluindo o número e o tamanho das miofibras e a extensão da mioneconese, expressa saqueada pela porcentagem de rotulagem na área transversal ou porcentagem de miofibras necróticas. Uma estimativa justa da regeneração também pode ser determinada com essa coloração. De fato, a presença de miofibras centralmente nucleadas(Figura 1c,parte superior) reflete a regeneração local e, portanto, após o evento dedegeneração. Para comparação, o tecido muscular saudável é apresentado na Figura 1b. De nota, a nucleação central em miofibras recém-formadas dura várias semanas nas miofibras regeneradas de camundongos adultos. No entanto, o reposicionamento nuclear ocorre significativamente mais rápido antes da idade de desmame em camundongos16.
Este tipo de resultado pode ser facilmente enriquecido adicionando outra rotulagem revelada por outra cor. Por exemplo, a natureza e o fenótipo das células infiltradas podem ser examinados com marcadores apropriados. Os anticorpos dirigidos contra o CD68 rotularão preferencialmente as populações de macrófagos, independentemente de seu status inflamatório4,9. Se necessário, o estado inflamatório dessas células pode ser investigadomais 17.
Como qualquer coloração fluorescente convencional, a qualidade do músculo é crucial. Biópsias musculares e criossecções devem ser mantidas em gelo seco em todos os momentos e para armazenamento a longo prazo a -80 °C até o uso. O armazenamento a -20 °C deve ser evitado, pois pode afetar a preservação do tecido. Os ciclos de congelamento das amostras também devem ser rigorosamente evitados.
Esta técnica tem vantagens significativas sobre as técnicas mais populares, como as manchas EBD e H&E. É simples e flexível e requer apenas material de imunorotulagem convencional e um microscópio fluorescente. A flexibilidade é oferecida em relação à escolha da cor fluorofona associada ao IgG de acordo com as necessidades experimentais, bem como no que diz respeito ao desempenho da co-imunorotulagem contra outros antígenos. Como comparação, a mancha de H&E e a EBD só podem ser reveladas na mesma cor e não podem ser associadas a outras rotulagem para avaliar parâmetros importantes, como a localização da miofibra ou a extensão e a natureza da infiltração de células inflamatórias. O método EBD requer injeção de tine de animais em torno de 24 h antes de colher os músculos, enquanto o método de captação de IgG pode ser realizado em quaisquer amostras, incluindo seres humanos. Toda a musculatura de animais injetados em EBD contém o corante que pode possivelmente afetar uma análise mais aprofundada, como imunorotulagem fluorescente dos músculos ou o ensaio colorítrico ck sangue.
Determinar a quantificação precisa da mioneconese implica preferencialmente um marcador confiável do tipo celular. Aqui, a natureza das células pode ser avaliada juntamente com o destino necrótico co-rotulagem IgG com o compartimento extracelular em torno de miofibras. Na Figura 1,as miofibras foram identificadas por anticorpos direcionados contra proteínas da matriz extracelular circundante, como a laminina. Outros componentes, como o colágeno também podem ser manchados. No entanto, os anticorpos contra as proteínas pertencentes à sarcolema devem ser evitados. Em nossa experiência, sua imunoreatividade desaparece prontamente após a necrose da fibra.
A imunorotulagem da captação de IgG dentro de miofibras é um método simples e confiável para manchar especificamente fibras musculares necróticas. Pode ser facilmente e rotineiramente realizada e é aplicável a amostras passíveis de manchas clássicas de imunofluorescência. Considerando sua especificidade e falta geral de contra-indicações, recomenda-se o uso como padrão ouro para avaliação da mioneconese, independentemente da natureza da lesão necrótica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Associação Française contre les Myopathies com o programa Translamuscle. Os autores agradecem ao Dr. Perla Reyes-Fernandez e ao Dr. Matthew Borok por sua leitura cuidadosa do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
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