Summary
이 원고에서, 프로토콜은 tdTomato 및 eGFP를 발현하는 양방향 리포터 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포를 이용하여 BK-폴리오마바이러스 전사 활성의 FACS 기반 측정을 수행하기 위해 제시된다. 이 방법은 바이러스 전사에 대한 신규 화합물의 영향을 정량적으로 결정할 수 있게 한다.
Abstract
BK-폴리오마바이러스(BKPyV)와 같은 폴리오마바이러스는 면역 손상 환자에서 심각한 병리학을 유발할 수 있습니다. 그러나, 매우 효과적인 항 바이러스는 현재 사용할 수 없기 때문에, 잠재적인 항 바이러스 에이전트의 영향을 측정 하는 방법이 필요. 여기서, BKPyV 비코딩 제어 영역(NCCR)의 분석을 가능한 이중 형광 리포터는 tdTomato 및 eGFP를 통해 바이러스 유전자 발현에 대한 잠재적항바이러스 약물의 영향을 정량화하기 위해 구축되었다. 식. 또한, 본 프로토콜에서 면역손상신장 이식 환자의 혈액 유래 DNA로부터 예시적으로 수득된 BKPyV-NCCR 앰플리칸을 복제함으로써, NCCR 재배열이 바이러스 성 유전자 발현에 미치는 영향을 결정할 수 있다. 환자 유래 앰플리톤의 클로닝에 이어, HEK293T 세포를 리포터 플라스미드로 형질전환시키고, 잠재적인 항바이러스제로 치료하였다. 이어서, 세포는 평균 형광 강도 72시간 후 형질감염을 측정하기 위한 FACS 분석을 실시하였다. 또한 잠재적인 세포 주기 억제 효과가 있는 약물의 분석을 테스트하기 위해 형질감염 및 따라서 형광 세포만 사용됩니다. 이러한 분석이 큰 T 항원 발현 세포에서 수행되기 때문에, 조기 및 후기 발현의 영향은 상호 독립적인 방식으로 분석될 수 있다.
Introduction
폴리오마바이러스는 시미미안 바이러스 40(SV40)을 시제품 종으로 가진 작은 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스의 독립적인 군을 나타낸다. 1 차적인 감염은 일반적으로 질병 현상 없이 진행하고 일반적으로 면역 유능한 호스트에 있는 잠복 감염을 일으키는 원인이 되는 유년기 도중 주로 생깁니다. BK-폴리오마바이러스 (BKPyV)는 주로 신장 관 세포에서 신병요법을 일으키지 않고 지속하지만, 신장 이식 후 면역 능력이 손상된 경우 바이러스가 재활성화되어 심각한 손상및 이식 이식 장애를 일으킬 수 있습니다. 높은 비혈증에 도달할 때 기능 (1 x 104 BKPyV DNA 사본 / mL) 1,2. 신장 이식 수혜자의 대략 10%에서, BK-polyomavirus (BKPyV)의 재활성화는 신장 동종 이식 실패의 고위험과 관련되었던 80%까지 관련되었던 polyomavirus 관련되는 신장 병증 (PyVAN)귀착됩니다3,4 . 승인된 항바이러스제를 사용할 수 없기 때문에 현재 치료법은 면역 억제의 감소에 기초합니다. 흥미롭게도, mTOR 억제제는 항 바이러스 효과가있는 것 같다; 따라서, 면역억제 요법을 mTOR 계 면역억제로 전환하면 BKPyV 비레미아 5,6,7의 진행을 방지하는 대안적 접근법을 나타낼 수 있다. 그러나, mTOR 계 항바이러스 메커니즘은 현재 아직 불완전하게 이해된다. 따라서, 임상적으로 관련된 농도에서 잠재적항바이러스제의 영향을 측정하는 방법이 요구된다.
BKPyV의 원형 게놈은 약 5kb의 비코딩 제어 영역(NCCR)을 품고 복제의 기원역할을 하며, 이와 일치하게 초기 및 후기 단계 mRNA 전사체의 발현을 유도하는 양방향 프로모터로 구성된다. NCCR-재배열, 결실 및 중복이 병원성 BKPyV 8에서 발견되기 때문에 PVAN5,9,전형(wt)의 비교를 통해 유의하게 축적된 환자들로부터 재배열 (rr) NCCR 활동은 바이러스 복제 피트니스를 특성화하는 데 도움이됩니다.
도1에 요약된 바와 같이, 이 프로토콜은 기자 플라스미드 5로부터 발현된 두 개의 형광단 tdTomato 및 eGFP의 형광을 정량화함으로써 BKPyV NCCR 전사 활성을 측정하는 일반적인 방법을설명한다. 9,10,11. 절차는 SV40 대형 T 항원(lTAg)의 존재에서 수행되며, 이는 NCCR 활성 초기에 및 후기에 대한 잠재적항바이러스제의 영향을 별도로 분석할 수 있다5. 이 분석은 NCCR 활성에 대한 재배열의 영향을 추가로 분석하고 wt-NCCrRs5,9. 리포터 플라스미드는 각각 tdTomato 및 eGFP에 대한 두 전사체의 비교가능한 효율적인 처리를 보장하기 위해 각 형광부 개방 판독 프레임의 SV40 후기 폴리아데닐화 신호 하류를 항구합니다. qRT-PCR 기반 방법5,12에비해, 이 FACS 기반 접근법은 감염된 세포 배양에 대한 복잡한 추출 프로토콜이 없고 비용이 많이 들지 않으므로 저렴한 비용과 높은 처리량 호환 대안을 나타냅니다. 면역 형광 염색을 위한 항체가 필요합니다. 더욱이, 정의된 양의 형광세포가 유세포분석을 통해 분석되기 때문에, 세포주기 억제제의 분석도 정량적 방식으로 가능하다.
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Protocol
이 프로토콜은 뒤스부르크 - 에센 대학의 의료 학부의 윤리위원회에 의해 승인 된 인간의 연구의 지침을 따릅니다 (14-6028-BO).
1. 혈액 또는 소변 샘플 수집 및 폴리오마 바이러스 DNA의 격리
- EDTA 관 또는 수집 관에 있는 소변에 있는 혈액의 적어도 3 mL를 수집합니다.
- 샘플을 2,500 x g에서 15 분 동안 원심 분리합니다. 필요한 경우, 파이펫 플라즈마를 새로운 튜브에 넣고 플라즈마 샘플을 며칠 동안 4°C로 저장하거나 -20°C에서 동결하여 보관하십시오.
- 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 40 μL의 단백질을 준비하고 파이펫팅으로 400 μL의 플라즈마를 추가합니다.
- 400 μL의 용해 완충액, 15s의 소용돌이, 56°C에서 10분 동안 배양하여 샘플을 용해시.
- 제조업체의 지침에 설명된 대로 DNA 혈액 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다. 간단히, 알코올을 추가하고 DNA 결합 실리카 기반 막을 포함하는 스핀 컬럼에 용해를로드합니다. 순수한 DNA를 산출하기 위해 열을 여러 번 씻으하십시오.
- TE 완충제의 30-50 μL에서 항복한 DNA를 용해시켰다.
2. 비코딩 제어 영역 (NCCR)의 증폭
- 물리적으로 분리된 방에서 다음 절차를 수행합니다. 분리된 방을 사용하여 시약을 준비하고 혼합물을 PCR 튜브에 분배합니다.
- 프라이머 쌍 A(표 1)를 사용하여 프리-PCR용 마스터 믹스를 총 부피 50 μL로 준비하고 1.6단계에서 이전에 단리된 DNA를 사용한다. 사전 및 중첩된 PCR에 대한 마스터 믹스를 준비하기 위한 파이펫팅 방식은 표2에 인쇄되어 있습니다.
- 마스터 믹스 45 μL을 PCR 튜브에 분배합니다.
- 분리된 DNA의 5 μL을 PCR 튜브에 추가합니다.
참고 : 오염을 방지하기 위해 마스터 믹스 준비에 대한 것보다 다른 방을 사용합니다. - 표3에 나타인 바와 같이 반응 조건으로 PCR을 실행한다. 35사이클에서 변성, 어닐링 및 확장을 반복합니다.
- 중첩 증폭용 프라이머 쌍 B는 AgeI 및 SpeI에 대한제한 사이트를 항구한다(표 1).
- 사전 PCR의 5 μL을 사용하여 단계 2.2~ 2.5에 기재된 바와 같이 반응 조건으로 중첩된 PCR을 실행한다.
- PCR 제품의 10 μL을 6x 젤 로딩 염료 2 μL과 혼합합니다. 혼합물의 10 μL을 1.5% 아가로즈 겔에 적재하고, 60 mA에서 30 분 동안 겔을 실행한다.
- 적절한 UV 문서화 시스템을 사용하여 젤을 시각화합니다.
참고: 앰플리콘의 크기는 재배열(삭제, 삽입 또는 중복)이 발생했는지 여부에 따라 300-500 bp 사이가 될 것으로 예상됩니다(그림2C). - 제조업체의 지침에 따라 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 앰플리폰을 정화합니다. 용출 버퍼의 30 μL에서 PCR 앰플리곤을 용해.
- 프라이머 쌍 B를 사용하여 생거 시퀀싱을위한 앰플리폰을 보냅니다.
3. NCCR을 이중 형광 리포터로 복제
- 표4에 기재된 바와 같이 37°C에서 2시간 동안 AgeI 및 SpeI로 정제된 앰플리콘(단계 2.10)을 소화한다.
- 2.10단계를 반복하고 소화된 앰플리곤을 정화한다.
- 병행하여, 표5에 기재된 바와 같이, 37°C에서 2시간 동안 AgeI 및 SpeI로 플라스미드 백본(1.5 μg)을 소화한다. 이 단계는 한 번만 수행하면 됩니다. 후속 반응을 위해 -20 °C에서 소화를 동결하십시오.
- 0.8% 낮은 용융 아가로즈 겔에서 소화된 플라스미드 백본을 분석하였다.
참고: 현재 40mA 보다 높은 젤을 실행하지 마십시오. 원래 플라스미드 pEX-K4 2-LTR CD3로부터 유래된 스페이서 영역의 예상 삽입은 128 bp(도 2C)이다. - 장파 UV 광(320 nm)을 사용하여 DNA 단편을 시각화하고 깨끗한 메스를 사용하여 백본 밴드를 잘라냅니다. 저용융 겔 단편을 새로운 1.5 mL 미세원원지 튜브로 옮김. DNA 손상을 방지하기 위해 긴 자외선 노출 시간을 피하십시오.
참고 : 낮은 용융 아가로스가 사용되기 때문에 결찰 전에 DNA를 정화 할 필요가 없습니다. - 젤 조각을 녹이고 부드러운 소용돌이로 2 분마다 혼합하기 위해 65 °C에서 10 분 동안 낮은 용융 아가로즈 조각을 포함하는 백본을 가열합니다. 용융 겔은 결찰에 직접 사용될 수 있다.
- 표6에 나타낸 방식을 이용하여 16°C에서 밤에 T4 DNA 리가아를 사용하여 백본 및 소화된 앰플리콘을 리게이트한다.
- 열 충격 방법, LB-amp 플레이트의 플레이트 박테리아, 밤새 37°C에서 배양하여 대장균의 변형을 수행합니다.
- 다음날, 3개의 양성 클론을 선택하고 37°C에서 하룻밤 대장균 배양물(LB-Amp의 5 mL)과 배양을 준비한다.
- 다른곳에서설명된 바와 같이 표준 프로토콜을 사용하여 플라스미드-DNA를 분리하고, AgeI 및 SpeI 소화를 수행하여 양성 클론을 확인하고 1% 아가로즈 겔에서 잘라낸 조각을 시각화합니다. 스페이서 대역(128 bp)은 더 큰 NCCR 서열(300-500 bp, 위 참조)으로 대체될 것이다.
- 프라이머 EGFP-N 또는 프라이머 쌍 B를 사용하여 생거 시퀀싱을 위한 플라스미드를 보냅니다(표 1).
- 돌연변이가 자발적으로 발생할 수 있기 때문에, 염기서열 분석 결과와 앰플리온으로 얻은 시퀀싱 결과를 비교한다. 앰플리온에 비해 동일한 서열을 포함하는 클론만 사용하십시오.
- 분자 워크벤치 소프트웨어(예: 프리웨어 GENtle 1.9.4 또는 기타 시퀀스 편집 프로그램)를 사용하여얻은 시퀀스를 정렬하고 편집합니다(그림 3).
- GENtle 1.9.4를 시작하고 가져오기 버튼(녹색 아래쪽 화살표)을 클릭하여 DNA 서열을 가져옵니다.
- 다음 도구를 클릭하고 메뉴에서 정렬을 선택하고 (바로 가기로 Ctrl + G 사용) 정렬을위한 DNA 시퀀스를 선택합니다.
- 시퀀스 추가 또는 제거를클릭하여 시퀀스를 클릭하여 정렬에 시퀀스를 추가합니다. JN19243815와같은 전형적인 NCCR 합의 시퀀스를 포함, 일반적으로 사용되는 던롭 스트레인16에서NCCR 시퀀스를 사용하지 마십시오, 그것은 전형BKPyV보다 재배열 및 중복 다른 항구 때문에 변종.
참고: NCCR에는 이미 번역 시작 코돈이 포함되어 있습니다(그림 3). - 도구 모음에서 알고리즘을 클릭하여 정렬 방법을 선택하고 clustal W. 정렬 매개 변수를 2와 일치하도록 설정; 간격 확장 페널티 -1; 간격 페널티 -2및 확인을 클릭하여 정렬을 실행합니다.
4. 기자 플라스미드와 HEK293T 세포의 과도 성 수혈 및 잠재적 인 항 바이러스 제와 치료
- 후속 형질감염 실험을 위해 충분한 양의 플라스미드 DNA를 준비하여 150 mL의 하룻밤 배양을 준비한다. 플라스미드 절연 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 대안적으로, 다른 플라스미드 정제 키트가 사용될 수 있다.
- 종자 1 x 105 HEK293T 세포는 10% FCS, 페니실린 및 스트렙토마이신(1x)을 함유하는 12웰 플레이트의 웰당 24시간 전에 형질감염 및 37°C 및 5% CO2에서 밤새 배양하여 형질감염 동안 활성 증식을 유지한다.
참고: 세포는 트랜스펙트 시 약 80%의 유동이어야 합니다. - 멸균 튜브에 250 μL의 감소된 혈청 매체를 놓고 각 리포터 플라스미드 DNA의 1 μg를 추가하고 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
- DNA 혼합물에 3 μL의 형질전환 시약을 넣고, 파이펫팅하여 부드럽게 혼합하고 15분 동안 배양합니다.
- 혼합물을 우물에 떨어 뜨리고 우물에 부드럽게 분배합니다.
- 4시간 후, 상판체를 시험제 및 용매 제어를 포함하는 신선한 배지로 교체한다. 분석전까지 37°C에서 배양합니다. 이 예에서, mTOR 억제제 INK128 (100 ng/mL) 및 라파마이신(100 ng/mL)을 사용하였다.
5. 형광 현미경 검사법 및 유세포 분석
- 형광 현미경하에서 적색 및 녹색 형광에 대한 세포를 확인합니다(그림4).
참고: 적색 및 녹색 형광은 각각 초기 및 후기 BKPyV 유전자 발현에 해당한다. - 72 시간 후 형질 감염 후, 상월제를 흡인하고 차가운 PBS 의 1 mL로 세포를 두 번 씻어.
- 500 μL의 트립신을 부드럽게 추가하고 세포의 조기 분리를 피하기 위해 플레이트를 약간 돌립니다. 이 단계는 셀 이배를 방지하는 것이 중요합니다.
- 추가 후, 같은 파이펫 팁으로 직접 트립신을 제거하십시오.
- 37 °C에서 적어도 5 분 동안 세포를 배양하십시오.
- 3% FCS를 포함하는 PBS의 1 mL로 트립시니화 세포를 다시 중단하고 미리 표지된 FACS 튜브에 현탁액을 전달합니다.
- FACS 분석 전에 DAPI(1 μg/mL)를 추가합니다.
- 유세포계를 사용하여 세포를 분석합니다. 각 샘플에 대해 DAPI 염색에 대해 음수인 적어도 10,000개의 살아있는 세포를 측정합니다.
6. 데이터 분석
- 데이터를 유세포 분석 분석 소프트웨어로 가져오고 클릭 및 드래그하여 샘플을 작업 공간으로 추가합니다.
- 가져온 파일을 두 번 클릭하고 그래프 플롯을 만듭니다. x축 및 y축을 클릭하여 FSC-A 대 SSC-A를 선택합니다. 도구 모음에서 다각형을 클릭하고 셀 모집단을 프레이밍하여주 셀 모집단을 게이트합니다(그림 5). 선택한 셀 모집단의 이름을 필요에 따라 지정합니다(예: "단일 셀"). "단일 셀"이 새 작업 영역으로 나타납니다.
- DAPI 음성(즉, "살아있는 세포")에 대한 게이팅 "단일 세포"를 진행합니다. 살아있는 세포를 확인하기 위하여DAPI 염색의 유무에 관계없이 세포 인구를 비교합니다. 두 플롯 에서 FSC-A 대 태평양-파란색-A를 선택합니다.
- 사각형을 클릭하고 DAPI 음수 세포 모집단을 선택하고 선택한 셀 집단의 이름을 "살아있는 셀"로 지정하고 앞에서 설명한 대로 FITC(eGFP) 대 PE(tdTomato)를 보여주는 새로운 도트 플롯을 만듭니다.
- 도구 모음에서 쿼드를 선택하여 "살아있는 셀"에 사분면을 추가합니다. 사분면의 중심을 각 모집단의 가장자리로 드래그하여 모집단을 게이트합니다. 사분면은 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+를 나타냅니다.
참고: FITC와 PE 간의 방출 스펙트럼의 스펙트럼 오버레이로 인해 적색 신호와 녹색 신호를 구별하고 정확한 결과를 얻으려면 초기 보상이 필수적입니다. - 사분면을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 통계추가를 선택하여 평균 형광 강도(MFI)를 결정합니다. 평균을 선택하고 확인을클릭합니다. 평균 MFI는 이제 "통계" 섹션의 인구 아래에 표시됩니다. 사분면 2와 4는 초기 표현식에 해당하고 사분면 3과 4는 늦은 식을 나타냅니다.
- 통계적 기능을 위해 동일한 방식으로 복제를 추가합니다.
- 데이터 해석플롯의 경우 초기 및 후기의 MFI 값을 막대 플롯으로 플롯합니다.
- 다른 기증자 또는 바이러스 균주에서 얻은 NCCR 활동을 비교하려면 전형적 제어 또는 Dunlop 변형률16을 추가하고 상대 MFI를 100%로 설정하고 상대 MFI 값을 계산합니다. 각 복제를 반복하고 평균 및 표준 편차를 결정합니다.
- 전사 활성에 대한 잠재적 화합물의 효과를 평가하기 위해 용매 대조군을 100%로 설정하고 처리된 세포의 MFI를 플롯한다.
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Representative Results
본 대표적인 실험에서, BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성은 유세포측정을 통해 측정하였다. 또한, BKPyV 재활성화 후 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 mTOR 억제제는 바이러스 성 초기 유전자 발현의 억제를 위해 시험되었다. 이를 위해, 이중 형광-리포터 분석이 이전에 출판된바와 같이 사용되었다 5. 실험 설정의 전체 워크플로 우표 방식은 Figure1에 설명되어 있습니다. 첫째, 면역손상신장이식환자로부터의 혈액샘플을 기관윤리위원회의 승인을 받아 인간연구의 가이드라인에 따라 채취하였다. 혈액을 EDTA 함유 튜브에서 수집하고 위상을 원심분리에 의해 분리시켰다. 이어서, 400 μL의 혈장이 폴리오마바이러스 DNA의 분리를 위해 사용되었다. 비코딩 제어 영역(NCCR)은 외부 프라이머 쌍 BKV-CR-1fw 및 BKV-CR-1rv를 사용하여 도 2A에 도시된 바와 같이 중첩-PCR 프로토콜을 사용하여 증폭되었고, 내부 프라이머 쌍BKV-CR-2fw-AgeI(Primer AgeI) 및 BKV-CR-2rv-Spei(프라이머 에이지)를 사용하여 증폭되었다. 프라이머 SpeI)17,후자는 AgeI와 SpeI에 대한 제한 사이트를 항구. 상기 앰플리코 검증은 도 2B에도시된 바와 같이 아가로즈 겔 전기동동을 통해 수행되었다. 전형적인 NCCR 서열(wt)으로부터 유래된 앰플리콘은 겔에서 균질한 크기 분포를 가졌고, 삽입(rrins)및 삭제(rr del)를가진 재배열된 NCCR로부터 유래된 것들은 그들의 크기(약 300-500 bp)에서 달랐다. 특히, 재배열로 인해, 던롭 NCCR 기준 서열(DUN)은 대조군으로 포함되었고, 전형적인 바이러스로부터 수득된 NCCR보다 더 컸다. 상기 앰플리폰은 예측된 크기에 대응하기 때문에, 추가 분석을 위해 리포터 플라스미드에 복제된 서열과 나중에 비교하기 위해 Sanger 시퀀싱을 위해 정제된 PCR 제품을 전송하였다.
앰플리코의 복제를 위해, 소화는 두 가지 제한 효소 AgeI 및 SpeI를 사용하여 수행하였다. 표준 복제 절차를 사용하여 수행된 이중 형광 리포터로 복제한 후, NCCR을 함유하는 양성 클론의 선택은 AgeI 및 SpeI소화에 의해 확인되었다(도 2C). 여기서, 소형 스페이서 영역(NC, 128 bp)은 양성 클론을 나타내는 더 큰 NCCR 단편(약 300-500 bp)으로 대체되었다. 확인된 클론으로부터 분리된 플라스미드 DNA는 Sanger 시퀀싱을 위해 보내졌고 앰플리온 시퀀싱으로부터 수득된 서열과 비교하였다(도시되지 않음). 추가 처리를 위해 앰플리온 시퀀스와 일치하는 클론만 선택되었습니다. 도3에 도시된 바와 같이, 시퀀싱 결과는 전형적인 NCCR 서열(JN192438)과 비교하였다. 이 예에서는 P-블록의 삭제 및 O-블록의 치환이 검출되었다.
이어서 세포 배양에서 복제된 NCCR 서열의 전사 활성을 시험하기 위해, HEK293T 세포는 각각의 리포터 컨스트럭트(도 4A)로 과도하게 형질감염시켰다(도4A). 도 4B에서가시화됨에 따라 형광 효율 및 NCCR 활성은 형광 현미경 검사법을 통해 모니터링되었다. 적색 및 녹색 형광은 각각5.초기 및 후기 BKPyV 유전자 발현에 대응하였다. 세포는 효율적인 초기 및 후기 운동 활성을 나타내는 형광단을 모두 발현하였다. 두 예에 의해 예시된 바와 같이, 제1 NCCR(NCCR1)은 강한 후기 유전자 발현을 나타내었으며, 제2예(NCCR2)는 비교적 초기에 는 비교적 강하지만 중간 정도의 후기 유전자 발현을 가졌다(도 4B). 따라서, 시료를 유세포분석 측정을 위해 제조하였다. 프로토콜 섹션 6에 기재된 바와 같이, DAPI 음성 세포는 게이트(도5A,하부 패널)하고 tdTomato 대 eGFP를 나타내는 도트 플롯이 생성되었다. 음수(도5B)였던샘플과 tdTomato(도5C)또는 eGFP(그림5D)에대해서만 양성 반응을 보였던 샘플만 분석에 포함되었다. 적색 및 녹색 신호를 구별하고 정확한 결과를 달성하기 위해 필수적인 초기 보정이 수행되었습니다18. 평균 형광 강도는 각 시험 클론으로부터 유래되었다. 여기서, tdTomato 양성 세포는 eGFP 양성 세포가 늦은 발현을 나타내면서 초기 발현에 대응하였다. 이 예에서 이중 mTOR 억제제 INK128을 사용하여 치료한tdTomato MFI(도 5E-F)가 현저히 감소하였고, 이는 조기 발현이 억제되었다는 것을 의미한다.
그림 1 : 실험 설정을 위한 워크플로우 구성표입니다. 1) 혈액 (대체 소변) 샘플의 수집, 2) 폴리오마 바이러스 DNA 의 분리 3) 중첩 된 PCR 프로토콜을 사용하여 비 코딩 제어 영역 (NCCR)의 증폭, 4) 아가로즈 겔 전기 영동 및 앰플리콘 검증, 5) PCR 앰플리콘의 생어 시퀀싱, 6) 에이지I와 SpeI를 사용하여 이중 형광 리포터에 NCCR의 복제, 7) 양성 클론의 선택, 8) 플라스미드 DNA의 생거 시퀀싱, 9) HEK293T 세포의 과일시침 및 시험할 화합물첨가, 10) 효율적인 형질감염을 검증하기 위한 형광 현미경 검사법, 11) 유세포분석, 12) 게이팅 및 eGFP tdTomato 식 분석, 13) 데이터 해석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 중첩 된 PCR 및 환자 유래 NCCR 앰플리온의 대표적인 분석. A) 면역손상신장이식환자로부터 유래된 DNA는 연령및 SpeI 제한 부위와 연결된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 반중첩된 PCR 증폭을 행하였다. BKPyV 스트레인 JN192438의 전형적인 O, P, Q, R 및 S 블록의 프라이머 이름 및 길이(기준 쌍)가 괄호로 표시됩니다. B) 앰플리컨은 1.5% 아가로즈 겔에서 전기동거의 전기동백에 의해 분석되었고 DNA 염색을 사용하여 시각화하였다. M1 = 100 bp 사다리, wt = 와일드 타입 (전형적인), rr = 재배열, ins = 삽입, del = 삭제, DUN = 던롭 변형. C) 에이지와 스페이와 함께 플라스미드 소화. 소화된 단편은 1.5% 아가로즈 겔에서 전기동공으로 분석하고 DNA 염색을 사용하여 시각화하였다. M1 = 100 bp 사다리, M2 = 2 로그 사다리. NC = 음극 제어 (스페이서). + = 양수 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 이중 형광 리포터로 NCCR의 복제 및 검증. 플라스미드 시퀀싱의 대표적인 결과. 앰플리온은 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고 Sanger 시퀀싱을 실시하였다. 각각의 서열은 전형적인 BKPyV 스트레인 JN192438로부터 유래된 NCCR 서열에 정렬되었다. 삭제 및 대체는 빨간색으로 표시됩니다. AgeI 및 SpeI 제한 사이트, eGFP 오픈 리딩 프레임(굵게 인쇄)의 번역 시작과 NCCR 블록 O-S가 표시됩니다. 각 블록과 제한 사이트는 색상으로 강조 표시됩니다. 기본 쌍의 각 NCCR 블록의 길이는 괄호로 인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : NCCR 프로모터 활성의 대표적인 형광 현미경 분석. A) 양방향 프로모터의 제어하에 이중 형광 리포터의 유전자 맵. 앞서설명한 바와 같이 5는 플라스미드 pTA-tdTOM-NCCR-eGFP(6,009 bp)는 TdTomato에 대한 두 전사체의 비교가능한 효율적인 처리를 보장하기 위해 각 발현 카세트의 SV40 후기 폴리아데닐화 신호 다운스트림을 항구한다(조기 식)과 eGFP(늦은 식)를 각각 사용합니다. NCCR은 에이지와 스페이에 의해 측면에 있습니다. 벡터는 복제 절차 동안 선택을위한 암피실린 저항 카세트를 포함합니다. B) HEK293T 세포는 환자 유래 NCCR 서열(NCCR1-2)의 제어하에 각각 이중 형광 리포터 구성으로 형질감염되었다. 세포는 투과 후 72시간 동안 밝은 필드 및 형광 현미경 분석을 실시하였다. 현미경의 필터 설정은 tdTomato (515-560 nm)에 대한 녹색과 eGFP (450-490 nm)에 대한 파란색 : 다음과 같은 여기 범위에서 사용되었다. 스케일 막대(200 μm)는 각 사진의 오른쪽 하단에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 대표적인 FACS 분석. 이 방법에 필요한 간단한 게이팅 전략이 도시되어 있습니다. 2매개변수 밀도 또는 점 도표가 사용됩니다. A) 첫째, FSC는 퍼시픽 블루에 대해 플롯되고 DAPI 음성(즉, 살아있는 세포)만 추가로 처리됩니다. B-F) FITC (eGFP) 대 PE (tdTomato)가 플롯됩니다. C-D) 유세포계의 보정을 조정하기 위해 녹색 및 적색 형광 세포를 독점적으로 추가합니다. E-F) 이 예에서, mTOR 억제제 INK128은 BKPyV 초기 유전자 발현의 감소에 대응하는 tdTomato MFI를 현저하게 감소시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프라이머 이름 | 시퀀스(5' → 3') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGCAGCCtTTCAAGGC |
| BK-CR-레브1 | CCTCTAACAAATTCCAGAAAAGC |
| BKV-CR-2-fw-AgeI | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
| BKV-CR-2-rv-스페이 | TTTTACTT ACTAGTCTGGCGCAACCATGGGCCTT |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
표 1: 이 프로토콜에 사용되는 올리고뉴클레오티드. 밑줄이 그어진 염기는 각각 AgeI 및 SpeI에 대한 제한 효소 부위를 나타낸다.
| 구성 요소 | 부피/반응(μl) | 최종 농도 |
| RNase 무료 물 | 32.8 μL | - |
| 10x PCR 버퍼 | 5 μL | 1x |
| dNTP (각 10 mM) | 1 μL | 각 dNTP의 0.2 mM |
| Fwd-프라이머 (10 μM) | 3 μL | 0.3 μM |
| 레브 프라이머 (10 μM) | 3 μL | 0.3 μM |
| 타크 폴리머라제 | 0.2 μL | 2 단위/반응 |
| 템플릿 DNA | 5 μL | <0.5 μg/50 μL 반응 |
표 2: 마스터 믹스 준비 프로토콜. 이 명령은 각각 단계 2.2 및 2.7에 설명된 대로 사전 및 중첩된 PCR 반응 모두에 적용됩니다.
| 온도 | 기간 | PCR 스텝 | 사이클 |
| 95°C | 약 5분 | 초기 변성 | |
| 95°C | 30초 | 변성 | |
| 55°C | 34초 | 어 닐 링 | x35 |
| 72°C | 1분 | 확장 | |
| 72°C | 약 10분 | 최종 확장 | |
| 4°C | ∞ | 냉각 |
표 3: NCCR 증폭에 사용되는 PCR 프로그램. 이 명령은 사전 및 중첩된 PCR 반응 모두에 적용됩니다.
| 시약 | 부피/반응(μl) | 최종 농도 |
| DNase 프리 H20 | 6개 | 20 μl |
| 10x 버퍼 | 2개 | 1x |
| 에이지 (주) | 1개 | 10 대 |
| 스페이 (주) | 1개 | 10 대 |
| 정제 된 PCR 앰플리톤 | 10개 | 변수 |
표 4: 앰플리톤 소화 프로토콜. 이 명령은 3.1단계에서 설명된 두 가지 제한 효소를 가진 앰플리코 DNA의 동시 소화에 적용된다.
| 시약 | 부피/반응(μl) | 최종 농도 |
| DNase 프리 H20 | 14.5 | 20 μl |
| 10x 버퍼 | 2개 | 1x |
| 에이지 (주) | 1개 | 10 대 |
| 스페이 (주) | 1개 | 10 대 |
| 플라스미드 백본(1 μg/μL) | 1.5 | 1.5 μg |
표 5: 플라스미드 소화 프로토콜. 이 명령은 3.3단계에서 설명된 두 가지 제한 효소를 가진 플라스미드 DNA 백본의 동시 소화에 적용된다.
| 시약 | 부피/반응(μl) | 최종 농도 |
| DNase 프리 H20 | 7명 | 20 μl |
| T4 DNA 리가제 | 1개 | 20개 |
| 10x T4 DNA 리가제 완충제 | 2개 | 1x |
| 정제된 플라스미드 백본 3.5단계에서 희석된 저용융액 1/2 |
2개 | 변수 |
| 2.7단계에서 PCR-앰플리온을 소화하고 정제 | 8개 | 변수 |
표 6: 플라스미드 결찰 프로토콜. 이 명령은 3.7단계에서 기재된 소화된 PCR 앰플리톤 DNA를 가진 플라스미드 DNA 백본의 결찰에 적용된다.
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Discussion
이 문서에서는, BKPyV 비코딩 제어 영역(NCCR) 구동 초기 및 후기 프로모터 활성의 분석을 허용하는 일반적으로 사용되는 방법이 제시된다. NCCR 활성은 동시에 측정될 수 있으며 형질감염된 세포의 라시스가 필요하지 않습니다. 더욱이, 비교적 많은 수의 세포를 분석할 수 있으며 형광 값의 정상화를 위한 추가 마커의 병용형화가 필요하지 않다.
이 방법의 중요한 부분은 복제된 NCCR이 환자 혈장내 의 대다수 변이체에 대응하는 앰플리톤 시퀀싱에 의해 확인된 것과 정확히 동일한 서열을 포함해야 한다는 것입니다. 정확한 결과를 달성하고 PCR에 취약한 오류를 최소화하려면 교정 판독 활동이 있는 폴리머라제(polymerase)를 사용하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 서열은 상업적 유전자 합성 서비스에 의해 주문될 수 있다. 지정된 NCCR 서열은 직접 복제를 위한 측면 AgeI 및 SpeI 제한 사이트를 포함하여 주문할 수 있습니다. 이 경우, 플라스미드를 백본 플라스미드와 평행하게 소화하고 스페이서 인서트를 합성된 구문으로부터 해당 NCCR 단편으로 교체한다. DNA는 소변 샘플에서 대안적으로 분리될 수 있습니다. 그러나, BKPyV는 또한 면역 적격 한 개인에 의해 소변으로 분비되기 때문에 반드시 활성 복제를 반영하지 는 않으며, 임상 관련성은 제한적입니다. 이상적으로, DNA는 또한 이전에 PVAN이 조직학적으로 검출될 수 있던 신장 생검에서 격리될 수 있습니다 (Korth et al., 201919와비교).
녹색 및 적색 형광 세포의 평균 형광 강도를 측정함으로써, 이 방법은 시험된 제제의 형질 감염 효율 및 증식 방지 효과의 편향 없이 NCCR 유래 형광/활성을 정량화할 수 있습니다(예를 들어, 이중 mTOR) 억제제 INK128 또는 PP242)5.
리포터 시스템의 또 다른 적용은 임상적 소산에서 발견된 NCCR의 삽입, 삭제 또는 복제의 결과를 초기 및 후기 운동 활성에 대한 분석의 가능성이다. 이전 연구에서, 면역 억제 제 NCCR 활동을 조절 하기 위해 공부 하고있다; 그러나, 감수성에 영향을 미치는 돌연변이 또는 NCCR 재배열은 발견되지 않았습니다. 그러나, 돌연변이는 가까운 장래에 승인될 지도 모르다 새로운 물질의 반응에 영향을 미칠 수 있습니다.
이는 코딩 영역과 달리 큰 T 항원 또는 VP1 캡시드 단백질과 는 달리, 이름에서 알 수 있듯이 NCCR은 비코딩 영역을 나타내므로 아미노산 수준에서 선택적 압력을 뒷받침하지 않기 때문에 관련될 수 있다.
이 프로토콜에서, NCCR을 포함하는 양성 클론의 선택은 AgeI 및 SpeI 소화에 의해 검증된다. 그러나, 콜로니 PCR은 한천 플레이트에 도금된 대장균으로부터 직접 NCCR 삽입을 신속하게 스크리볼 수 있는 대체 접근법을 나타낼 수 있다. 이 접근법을 위해, 프라이머 쌍 BKV-CR-2-fw-AgeI및 EGFP-N(표 1)을 사용한다. 형질전환 후, 세포는 형광 현미경을 사용하여 적색 및 녹색 형광을 검사합니다(그림4). 대안적으로, 세포는 22°C에서 20분 동안 3% PFA를 사용하여 고정될 수 있다. 이 경우, PBS로 세척하고, PBS에 0.2% 비이온성 세제를 추가하고 10분 동안 배양한다. 고정 세포는 22°C에서 10분 동안 PBS(1 μg/mL)에서 DAPI로 염색하고 형광 현미경 분석을 실시하고 UV 광(340-380 nm)으로 시각화할 수 있다.
두 형광단모두 동일한 폴리아데닐화 신호를 수용하기 때문에 폴리아데닐화 효율의 효과를 배제할 수 있습니다. 그러나, eGFP에 비해, tdTomato는 상응하는 더 긴 mRNA로 전사되어야 하는 디메릭 단백질이다(코딩 서열: 745 대 1431 bp 각각). 그러나, 간섭 물질로 처리된 세포로부터프로모터의 활성은 항상 치료되지 않은(DMSO) 세포에 비해 비교되기 때문에, 이러한 차이는 거의 역할을 하지 않습니다. 복제의 기원의 존재로 인해, SV40PyV 대형 T 항원을 안정적으로 발현하는 세포에서 리포터 플라스미드의 형질전환은 딸 세포로 플라스미드의 전달을 허용한다. SV40 유래 대형 T항원SV40 및 BKPyV NCCR 및 바이러스 DNA복제(20)를트랜스활성화할 수 있는 것으로 나타났다. 그러나, 큰 T 항원도 감염의 초기에서 후기 단계로의 전이에 관여하기 때문에, 인공적인 상황이 주어집니다. 이러한 분석방법을 사용하여, 가장 복제 제한 단계는 큰 T 항원의 발현으로 이어지는 초기 발현이라고 생각되어야 한다. 완전한 복제 주기를 매핑하기 위해서는 다른 곳에서 설명한 대로 qRT-PCR에 의해 감염된 세포에서 초기 및 후기 mRNAs를 측정해야5,12.
비교 방법은 이미 독립적으로 복제 된 벡터 시스템5,9이기는하지만,전형적인 및 재배열 BKPyV NCCR 파생 프로 모터 활동을 분석하기 위해 스위스와 독일 그룹에 의해 사용되었다. 바젤에서 고서트 및 동료들은 BKPyV 및 JCPyV 균주9,10,11의NCCR 프로모터 활성을 결정하기 위해 유사한 방법을 사용했다. 두 방법 모두 녹색 형광에 대해 eGFP를 사용했습니다. 그러나, 바젤 군은 현재 프로토콜tdTomato에서 적색 형광에 사용되었지만 RFP를 사용하였다. RFP에 비해 tdTomato의 장점은 훨씬 더 높은 광 안정성입니다. 그러나, 디메릭 단백질은 RFP21보다두 배 긴 서열에 의해 인코딩된다. 게다가, 단백질의 반감기는 불평등한 사격량 72 시간 후 형질전환의 결과로 다를 지도 모릅니다. 그러나 이 문제는 두 형광 강도를 직접 비교할 때만 관련이 있을 수 있습니다. Gosert 등은 BamHI 및 NotI를 제한 사이트로 사용하였고 현재 프로토콜인 AgeI 및 SpeI는 NCCR 서열을 측면으로 하고 있다. 두 가지 방법을 모두 사용하여, 참조 DUNLOP 균주(16)는 초기에 는 약하지만 약한 후기 프로모터 활성을 가진 유사한 형광 패턴을 산출한 9,10. 추가 계약에서, NCCR-P-부위에 삽입된 NCCR-재배열은 wt-NCCR5,9에비해 초기 및 후기 프로모터 활성에서 상당한 증가를 초래하였다.
SV40 유래 대형 T 항원이 SV40 및 BKPyV 유래 NCCRs20을트랜스활성화할 수 있는 것으로 나타났지만, 향후 연구에서 프로토타입 바이러스SV40이 아닌 BKPyV의 큰 T 항원을 안정적으로 발현하는 인간 세포를 사용하는 것이 흥미로울 수 있습니다. . 그러나, 이 경우 세포주(예를 들어, HEK293)를 트랜스펙트하기 쉬워야 한다.
폴리오마바이러스의 NCCR 프로모터는 매우 유사하기 때문에,이 방법은 또한 프로모터 활성과 JC-폴리오마 바이러스 (JCPyV)의 활성에 대한 강력한 항 바이러스 제의 영향을 조사하기 위해 (프라이머 서열에 작은 적응) 사용할 수 있습니다 파생 된 비 코딩 제어 영역11. JCPyV는 진행성 다초점 백혈구 변halopathy (PML)의 원인이되기 때문에, 가혹한 신경병리학의 결과로 면역 결핍을 가진 환자에서 드물게 생길 수 있는 희소한 중추 신경계 질병, 또한 찾아내야 할 긴급한 필요가 있습니다 면역 손상 된 환자를 치료 하는 직접 행동 항 바이러스 물질. 흥미롭게도, 재배열은 JC NCCRs11에서도발견됩니다. JCPyV는 신경성증을 발음하고 따라서 많은 양의 바이러스가 주류에서 발견되기 때문에, 샘플 수집은 주류 유래 DNA로 조정되어야 합니다. 그러나 후속 단계를 쉽게 조정할 수 있습니다.
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Disclosures
요하네스 코르트는 아스텔라스와 노바티스로부터 연사비와 여행경비를 지원받았다. 마레크 와이더는 노바티스로부터 컨설팅 비용을 받았습니다. 올리버 비츠케는 암젠, 알렉시온, 아스텔라스, 바실레아, 바이오테스트, 브리스톨-마이어스-스퀴브, 코레비오, 치에시, 길르앗, 헥살, 얀센, F. 쾰러 케미 박사, MSD, 노바티스, 노바티스, 로치로부터 임상 연구, 연사 수수료, 명예 및 여행 경비에 대한 보조금을 받았습니다. 화이자, 사노피, 테바.
Acknowledgments
저자는 우수한 기술 지원을 바바라 블레크만 감사합니다. 이러한 연구는 뒤스부르크 - 에센 의과 대학의 IFORES 프로그램과 대학 얼라이언스 루르와 메르카토르 연구 센터 루르 (MERCUR)의 RIMUR 프로그램에 의해 지원되었다. 저자들은 헬렌 세르츠니그 박사의 펠로우십과 지속적인 지원에 대해 위르겐-만초-스티퉁에게 감사를 표한다. 수집 및 환자 자료의 사용은 대학 뒤스부르크 - 에센의 의료 학부의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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