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Genetics

बीके-पॉलीओमावायरस गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र संचालित ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि वाया फ्लो साइटोमेट्री का मापन

Published: July 13, 2019 doi: 10.3791/59755
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2,3, 3, 3, 4, 1, 2, 2
1Department of Nephrology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 2Institute for Virology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 3Center for Translational Medicine, Medical Department I, Marien Hospital Herne, University Hospital of the Ruhr-University of Bochum, 4Department of Infectious Diseases, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen Hufelandstr

Summary

इस पांडुलिपि में, एक प्रोटोकॉल एक द्विदिश रिपोर्टर प्लाज्मिड tdTomato और eGFP व्यक्त करने के साथ transfected HEK293T कोशिकाओं का उपयोग करके बीके-पॉलीओमावायरस ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के FACS आधारित माप प्रदर्शन करने के लिए प्रस्तुत किया है। इस विधि को आगे मात्रात्मक वायरल प्रतिलेखन पर उपन्यास यौगिकों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है.

Abstract

Polyomaviruses, बीके-पॉलीओमावायरस (BKPyV) की तरह, प्रतिरक्षा समझौता रोगियों में गंभीर रोगों का कारण बन सकता है। हालांकि, चूंकि अत्यधिक प्रभावी एंटीवायरल वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं, इसलिए संभावित एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव को मापने के तरीकों की आवश्यकता है। यहाँ, एक दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर है कि BKPyV गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (NCCR) जल्दी और देर प्रमोटर गतिविधि संचालित के विश्लेषण की अनुमति देता है tdTomato और eGFP के माध्यम से वायरल जीन अभिव्यक्ति पर संभावित एंटीवायरल दवाओं के प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए निर्माण किया गया था अभिव्यक्ति. इसके अलावा, बीकेपीवी-एनसीसीआर एम्प्लियन्स की क्लोनिंग करके, जो इस प्रोटोकॉल में प्रतिरक्षा-संपीड़ित गुर्दे के प्रतिरोपित रोगियों के रक्त व्युत्पन्न डीएनए से प्राप्त किए गए हैं, वायरल जीन अभिव्यक्ति पर एनसीसीआर-पुनर्व्यवस्थाओं के प्रभाव का निर्धारण किया जा सकता है। रोगी व्युत्पन्न amplicons की क्लोनिंग के बाद, HEK293T कोशिकाओं रिपोर्टर-प्लास्मिड के साथ transfected थे, और संभावित एंटीवायरल एजेंटों के साथ इलाज किया. बाद में, कोशिकाओं को माध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता 72 एच पोस्ट ट्रांसफेक्शन को मापने के लिए FACS-विश्लेषण के अधीन किया गया। यह भी दवाओं है कि एक संभावित सेल चक्र बाधा प्रभाव है के विश्लेषण का परीक्षण करने के लिए, केवल transfected और इस तरह फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है. चूंकि इस परख बड़े टी Antigen व्यक्त कोशिकाओं में किया जाता है, जल्दी और देर से अभिव्यक्ति के प्रभाव को एक पारस्परिक रूप से स्वतंत्र तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है.

Introduction

Polyomaviruses एक प्रोटोटाइप प्रजातियों के रूप में Siman वायरस 40 (SV40) के साथ छोटे डबल-स्लेंड डीएनए (dsDNA) वायरस के एक स्वतंत्र परिवार का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्राथमिक संक्रमण मुख्य रूप से बचपन के दौरान होता है, जो आमतौर पर रोग के लक्षणों के बिना आगे बढ़ता है और आमतौर पर प्रतिरक्षा सक्षम मेजबानों में गुप्त संक्रमण का कारण बनता है। बीके-पॉलीओमावायरस (BKPyV) मुख्य रूप से नेफ्रोपैथोलॉजिस्ट के कारण के बिना गुर्दे ट्यूबल कोशिकाओं में बनी रहती है, हालांकि, गुर्दे प्रत्यारोपण के बाद प्रतिरक्षा क्षमता की हानि के मामले में वायरस को पुनः सक्रिय कर सकते हैं और गंभीर नुकसान और बिगड़ा भ्रष्टाचार का कारण बन सकता है समारोह जब एक उच्च viremia तक पहुँचने (1 x 104 BKPyV डीएनए प्रतियां / गुर्दे प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के लगभग 10% में, बीके-पॉलीओमावायरस (BKPyV) के पुनः सक्रियण एक polyomavirus जुड़े नेफ्रोपैथी (PyVAN) मेंपरिणाम है, जो 80% गुर्दे allograft विफलताओं के एक उच्च जोखिम के साथ जुड़े 3,4 . चूंकि कोई अनुमोदित एंटीवायरल एजेंट उपलब्ध नहीं हैं, वर्तमान चिकित्सा इम्यूनोसुप्रेशन की कमी पर आधारित है। दिलचस्प बात यह है कि, MTOR अवरोधकों का एंटीवायरल प्रभाव होता है; इस प्रकार, इम्युनोसुप्रेसिव थेरेपी को एम टी आर-आधारित इम्यूनोसुप्रेशन में बदलने से बीकेपीवी विरेमिया5,6,7की प्रगति को रोकने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व हो सकता है। हालांकि, MTOR आधारित एंटीवायरल तंत्र वर्तमान में अभी भी अधूरा समझ में आ गया है. इस प्रकार, नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता में संभावित एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव को मापने के तरीकों की आवश्यकता है।

BKPyV के परिपत्र जीनोम लगभग 5 केबी एक गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (NCCR) है कि प्रतिकृति और संयोग से एक द्विदिश प्रमोटर जल्दी और देर से चरण MRNA प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति ड्राइविंग के एक मूल के रूप में कार्य करता है शरण के होते हैं. स्वतः होने वाली NCCR-पुनर्व्यवस्थापन, विलोपन, और duplications रोगजनक BKPyV8 में पाए जाते हैं और काफी PVANसेपीड़ित रोगियों में जमा5 ,9, आर्केटाइपिक (डब्ल्यूटी) की तुलना और पुन: व्यवस्थित (आरआर) एनसीसीआर-कार्यकलाप वायरल प्रतिकृति फिटनेस की विशेषता के लिए सहायक होते हैं।

जैसा कि चित्र 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है , यह प्रोटोकॉल बीकेपीवी एनसीसीआर ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को मापने के लिए सामान्य रूप से प्रयुक्त विधि का वर्णन करता है, जो दो फ्लोरोफोर्स tdTomato और eGFP के फ्लोरोसेंट को मापने के लिए एक रिपोर्टर प्लाज्मिड5से व्यक्त किया जाता है, 9,10,11. प्रक्रिया SV40 बड़े टी प्रतिजन (lTAg) की उपस्थिति में किया जाता है, जो जल्दी और देर से NCCR-सक्रियता पर संभावित एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव का विश्लेषण करने की अनुमति देता है अलग से5. यह परख आगे एनसीसीआर गतिविधि पर पुनर्व्यवस्था ओंकारने के प्रभाव और डब्ल्यूटी-एनसीसीआर5,9 के साथ तुलना का विश्लेषण करतीहै. रिपोर्टर प्लाज्मिड क्रमशः tdTomato और eGFP के लिए दोनों प्रतिलिपि के तुलनीय और कुशल प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक fluorophore खुला पढ़ने फ्रेम के बहाव SV40 देर polyadenylation संकेत बंदरगाह. QRT-पीसीआर आधारित तरीकों की तुलना में5,12, इस FACS आधारित दृष्टिकोण संक्रमित सेल संस्कृति और कोई महंगा के लिए कोई जटिल निष्कर्षण प्रोटोकॉल के बाद से एक कम लागत और उच्च थ्रूपुट संगत विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिरक्षा फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए एंटीबॉडी की जरूरत है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की एक परिभाषित राशि प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं के बाद से, सेल चक्र बाधा एजेंटों का विश्लेषण भी एक मात्रात्मक तरीके से संभव है.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल मानव अनुसंधान के दिशा निर्देशों के रूप में Duisburg-Esen (14-6028-BO) विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय की नीति समिति द्वारा अनुमोदित के बाद.

1. रक्त या मूत्र के नमूनों का संग्रह और polyomavirus डीएनए के अलगाव

  1. अधिग्रहण ट्यूबों में EDTA ट्यूब या मूत्र में रक्त की कम से कम 3 एमएल ले लीजिए.
  2. 15 मिनट के लिए 2,500 x ग्राम पर नमूना सेंट्रीफ्यूज। यदि आवश्यक हो, एक नई ट्यूब में पिपेट प्लाज्मा और कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मा नमूने की दुकान या लंबे समय तक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
  3. प्रोटीनेज के 40 डिग्री सेल्सियस को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तैयार कीजिए और पाइपिंग द्वारा प्लाज्मा के 400 डिग्री सेल्सियस को जोड़ें।
  4. lysis बफर के 400 $L, 15 s के लिए भंवर, और 56 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट जोड़कर नमूने Lyse.
  5. निर्माता के निर्देशों में वर्णित के रूप में एक डीएनए रक्त निष्कर्षण किट का उपयोग कर डीएनए अलग. संक्षेप में, शराब जोड़ें और एक डीएनए बाइंडिंग सिलिका-आधारित झिल्ली युक्त एक स्पिन कॉलम पर lysates लोड। शुद्ध डीएनए प्राप्त करने के लिए कॉलम को कई बार धोएं।
  6. ते बफर के 30-50 डिग्री एल में प्राप्त डीएनए Elute.

2. गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र का प्रवर्धन (एनसीसीआर)

  1. शारीरिक रूप से अलग कमरे में निम्नलिखित प्रक्रिया प्रदर्शन. अभिकर्मकों को तैयार करने और पीसीआर ट्यूबों के लिए मिश्रण वितरित करने के लिए एक अलग कमरे का उपयोग करें।
  2. प्राइमर युग्म A (तालिका 1) का उपयोग करते हुए पूर्व-पीसीआर के लिए मास्टर मिक्स तैयार करें , 50 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा में और चरण 1.6 से पहले पृथक डीएनए का उपयोग करें। पूर्व और नेस्टेड पीसीआर के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए पाइपिंग योजना तालिका 2में छपी है।
  3. पीसीआर ट्यूबों में मास्टर मिश्रण के 45 डिग्री एल वितरित करें।
  4. पीसीआर ट्यूबों में अलग डीएनए के 5 डिग्री एल जोड़ें.
    नोट: संदूषण से बचने के लिए मास्टर मिश्रण तैयारी के लिए एक से दूसरे कमरे का उपयोग करें।
  5. पीसीआर को क्रियाप्रतिक्रिया स्थितियों के साथ चलाएँ जैसा कि सारणी 3में दिखाया गया है। 35 चक्रों में विकृतीकरण, अनीलन और विस्तार दोहराएँ।
  6. नेस्टेड प्रवर्धन के लिए प्राइमर युग्म B का उपयोग करते हैं जो आयुI और स्पीआई (सारणी 1) के लिए प्रतिबंध स्थलों को आश्रय देते हैं।
  7. पूर्व-पीसीआर के 5 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करके चरण 2.2 से 2.5 में वर्णित प्रतिक्रिया स्थितियों के साथ नेस्टेड PCR चलाएँ.
  8. 6x जेल लोड हो रहा डाई के 2 $L के साथ पीसीआर उत्पाद के 10 डिग्री एल मिक्स करें। एक 1.5% agarose जेल पर मिश्रण के 10 $L लोड, और 60 लेकिन पर 30 मिनट के लिए जेल चलाते हैं.
  9. एक उपयुक्त यूवी प्रलेखन प्रणाली का उपयोग कर जेल कल्पना.
    नोट: amplicon का आकार 300-500 bp के बीच कि क्या rerangements (deletions, सम्मिलन, या duplications) उत्पन्न हुई के आधार पर होने की उम्मीद है (चित्र 2C).
  10. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करपीसी amplicons शुद्ध। इल्यूशन बफर के 30 डिग्री एल में पीसीआर एम्प्लिकॉन्स को इल्यूट करें।
  11. प्राइमर जोड़ी बी का उपयोग कर Sanger अनुक्रमण के लिए amplicons भेजें.

3. दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर में NCCR की क्लोनिंग

  1. सारणी4 में वर्णित 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए आयुआई तथा स्पीआई के साथ शुद्ध प्रवर्तक (चरण 2-10) को डाइजेस्ट करें।
  2. चरण 2.10 दोहराएँ और पचाए गए amplicons शुद्ध.
  3. समांतर में प्लाज्मिड बैकबोन (1.5 ग्राम) को भी चहल-द-जाद के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 ह के लिए तथा सारणी 5में वर्णित के रूप में पचाएं। यह चरण केवल एक बार किया जा करने की आवश्यकता है। बाद की प्रतिक्रियाओं के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर पाचन फ्रीज.
  4. एक 0.8% कम पिघल agarose जेल पर पचा प्लाज्मिड रीढ़ का विश्लेषण करें.
    नोट: 40 लेकिन से अधिक वर्तमान के साथ जेल न चलाएं। मूल रूप से प्लाज्मिड pEX-K4 2-LTR CD313 से व्युत्पन्न स्पेसर क्षेत्र का अपेक्षित सम्मिलित 128 बीपी (चित्र 2C) है।
  5. लंबे समय से लहर यूवी प्रकाश (320 एनएम) का उपयोग कर डीएनए टुकड़े कल्पना और एक साफ स्केलपेल का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी बैंड बाहर कटौती। एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में कम पिघल जेल टुकड़ा स्थानांतरण. डीएनए क्षति को रोकने के लिए लंबे यूवी जोखिम समय से बचें।
    नोट: के बाद से कम पिघल agarose प्रयोग किया जाता है, यह लिगेशन से पहले डीएनए को शुद्ध करने के लिए आवश्यक नहीं है।
  6. जेल टुकड़ा पिघला और कोमल भंवर द्वारा हर 2 मिनट मिश्रण करने के क्रम में 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कम पिघल agarose टुकड़ा युक्त रीढ़ की हड्डी गर्मी। पिघल जेल सीधे ligation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  7. सारणी 6में दर्शाए गए इस योजना का उपयोग करते हुए रात को 16 डिग्री सेल्सियस पर टी 4 डी एन ए लिगेस का उपयोग करते हुए रीढ़ की हड्डी और पचे हुए एम्प्लिकॉन को ली ।
  8. गर्मी सदमे विधि का उपयोग कर ई. कोलाई में परिवर्तन प्रदर्शन, एलबी-एएमपी प्लेटों पर प्लेट बैक्टीरिया, और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति।
  9. अगले दिन, तीन सकारात्मक क्लोन का चयन करें और रात भर ई. कोलाई संस्कृतियों (एलबी-एएमपी के 5 एमएल) और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति तैयार करें।
  10. कहीं और वर्णित के रूप में मानक प्रोटोकॉल का उपयोग प्लाज्मिड-डीएनए अलग14, सकारात्मक क्लोन के लिए जाँच करने के लिए AgeI और SpeI पाचन प्रदर्शन और एक 1% agarose जेल पर टुकड़े बाहर कटौती कल्पना. स्पेसर बैंड (128 बीपी) को बड़े एनसीसीआर-अनुक्रम (300-500 बीपी, ऊपर देखें) द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा।
  11. प्राइमर EGFP-N या प्राइमर जोड़ी B (तालिका1) का उपयोग करके Sanger अनुक्रमण के लिए प्लाज्मिड भेजें।
  12. चूंकि उत्परिवर्तन स्वतः हो सकते हैं, अनुक्रमण परिणामों की तुलना amplicon के साथ प्राप्त अनुक्रमण परिणामों के साथ करें। केवल amplicon की तुलना में समान दृश्यों युक्त क्लोन का उपयोग करें.
  13. प्राप्त अनुक्रमों को संरेखित और संपादित करने के लिए आण्विक वर्कबैंच सॉफ्टवेयर (उदा., फ्रीवेयर GENtle 1.9.4 या अन्य अनुक्रम संपादन प्रोग्राम) का उपयोग करें (चित्र 3)।
  14. 1.9.4 GENtle शुरू करें और आयात बटन पर क्लिक करके डीएनए दृश्यों आयात (तीर नीचे हरा).
  15. उपकरण पर अगले क्लिक करें और मेनू से संरेखण का चयन करें (एक शॉर्टकट के रूप में Ctrl+G का उपयोग करें) और संरेखण के लिए डीएनए दृश्यों का चयन करें.
  16. जोड़ें पर क्लिक करके संरेखण के लिए एक अनुक्रम जोड़ें या निकालेंपर क्लिक करके एक अनुक्रम निकालें निकालें पर क्लिक करके एक अनुक्रम निकालें. JN19243815की तरह एक कट्टर NCCR आम सहमति अनुक्रम शामिल हैं, सामान्य रूप से इस्तेमाल किया Dunlop तनाव16से एनसीसीआर अनुक्रम का उपयोग नहीं करते, क्योंकि यह archetypical BKPyV की तुलना में rerangements और duplications दूसरों को आश्रय उपभेदों.
    नोट: एनसीसीआर में पहले से ही अनुवादात्मक प्रारंभ कोडोन (चित्र3) है।
  17. उपकरण पट्टी में एल्गोरिथ्म पर क्लिक करके संरेखण के लिए एक विधि चुनें और संरेखण W. 2 से मेल करने के लिए संरेखण पैरामीटर सेट करें; अंतराल एक्सटेंशन जुर्माना -1; अंतराल जुर्माना -2 और संरेखण को चलाने के लिए ठीक पर क्लिक करें।

4. रिपोर्टर प्लाज्मिड और संभावित एंटीवायरल एजेंटों के साथ उपचार के साथ HEK293T कोशिकाओं के क्षणिक परिवर्तन

  1. बाद transfection प्रयोगों के लिए प्लाज्मिड डीएनए की पर्याप्त मात्रा में तैयार करने के लिए एक 150 एमएल रात भर संस्कृति तैयार करते हैं. एक प्लाज्मिड आइसोलेशन किट का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए को अलग करें। वैकल्पिक रूप से, अन्य प्लाज्मिड शोधन किट का उपयोग किया जा सकता है।
  2. डी एम ई एम में बीज 1 x 105 HEK293T कोशिकाओं जिसमें 10% एफसीएस, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x) ट्रांसफेक्शन से पहले 12-वेल प्लेट 24 एच के प्रति अच्छी तरह से और ट्रांसफेक्शन के दौरान सक्रिय प्रसार को बनाए रखने के लिए रात भर में इनक्यूबेट।
    नोट: कोशिकाओं transfection पर लगभग 80% confluent होना चाहिए.
  3. एक बाँझ ट्यूब में कम सीरम मीडिया के 250 डिग्री एल प्लेस और प्रत्येक रिपोर्टर प्लाज्मिड डीएनए के 1 डिग्री ग्राम जोड़ें और पाइपिंग द्वारा धीरे मिश्रण.
  4. डीएनए मिश्रण में ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक के 3 डिग्री एल जोड़ें, 15 मिनट के लिए पाइपटिंग और इनक्यूबेट द्वारा धीरे से मिश्रण करें। उपयोग करने से पहले 22 डिग्री सेल्सियस और भंवर के परिवेश तापमान में ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक को गर्म करें।
  5. कुओं में मिश्रण ड्रॉप-वार जोड़ें और धीरे से अच्छी तरह से वितरित करें।
  6. 4 ज के बाद, परीक्षण एजेंटों और विलायक नियंत्रण युक्त ताजा माध्यम के साथ supernatant की जगह। विश्लेषण तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। इस उदाहरण में, MTOR अवरोधक INK128 (100 ng/mL) और rapamycin (100 ng/mL) का उपयोग किया गया.

5. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री

  1. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे लाल और हरे रंग के फ्लोरोसेंट के लिए कोशिकाओं की जाँच करें (चित्र 4)।
    नोट: लाल और हरे रंग की फ्लोरोसेंट क्रमशः जल्दी और देर BKPyV जीन अभिव्यक्ति के अनुरूप हैं।
  2. 72 एच पोस्ट ट्रांसफेक्शन के बाद, सुपरनेंट को एस्पायर करें और कोशिकाओं को 1 एमएल ठंड पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  3. धीरे trypsin के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और कोशिकाओं की समय से पहले टुकड़ी से बचने के लिए थाली थोड़ा बारी. यह चरण सेल doubts से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
  4. इसके अलावा के बाद, एक ही पिपेट टिप के साथ सीधे trypsin हटा दें.
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. 3% एफसीएस युक्त पीबीएस के 1 एमएल के साथ ट्रिप्सिनीकृत कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और पूर्व-लेबल एफएसीएस ट्यूबों में निलंबन को स्थानांतरित करें।
  7. FACS विश्लेषण करने से पहले DAPI (1 g/mL) जोड़ें।
  8. एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं का विश्लेषण करें. प्रत्येक नमूने के लिए, कम से कम 10,000 जीवित कोशिकाओं को मापें, जो DAPI धुंधला के लिए नकारात्मक हैं।

6. डेटा विश्लेषण

  1. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में डेटा आयात करें और क्लिक करके नमूने जोड़ें और कार्यस्थान में खींचें.
  2. आयातित फ़ाइल पर डबल क्लिक करें और एक ग्राफ प्लॉट बनाएँ. x- और y-अक्ष पर क्लिक करके FSC-A बनाम SSC-A चुनें. उपकरण पट्टी पर बहुभुज पर क्लिक करके और सेल जनसंख्या तैयार करके मुख्य सेल जनसंख्या को गेट करें (चित्र 5)। चुने गए कक्ष जनसंख्या को आवश्यक के रूप में नाम करें (उदाहरण के लिए "एकल कक्ष"). "एकल कक्ष" एक नए कार्यस्थान के रूप में दिखाई देगा.
  3. DAPI नकारात्मक (यानी, "जीवित कोशिकाओं") के लिए "एकल कक्ष" गेटिंग के साथ आगे बढ़ें. जीवित कोशिकाओं की पहचान करने के साथ और DAPI धुंधला बिना सेल आबादी की तुलना करें. दोनों भूखंडों में FSC-A बनाम प्रशांत-नीला-ए चुनें।
  4. आयत पर क्लिक करें और DAPI नकारात्मक सेल जनसंख्या का चयन करें, चुने गए सेल जनसंख्या "जीवित कोशिकाओं" नाम, और FITC (eGFP) बनाम पीई (tdTomato) के रूप में पहले वर्णित दिखा एक नया डॉट-प्लाट बनाएँ.
  5. उपकरण पट्टी से क्वाड का चयन करके "जीवित कोशिकाओं" में क्वाड्रेंट जोड़ें। प्रत्येक जनसंख्या के किनारे करने के लिए वृत्त का चतुर्थ भाग के केंद्र खींचकर जनसंख्या गेट. क्वाड्रेंट का प्रतिनिधित्व करते हैं 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+.
    नोट: FITC और पीई के बीच उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के वर्णक्रमीय ओवरले के कारण, प्रारंभिक मुआवजा लाल और हरे संकेतों के बीच अंतर करने के लिए और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
  6. माध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता (MFIs) का चतुर्भुज पर राइट क्लिक करके और सांख्यिकी जोड़ेंका चयन करके निर्धारित करें। मतलब चुनें और ठीकक्लिक करें. मतलब MFI अब अनुभाग "सांख्यिकी" में जनसंख्या के नीचे प्रदर्शित किया जाता है. चतुष्क 2 और 4 प्रारंभिक अभिव्यक्ति के अनुरूप हैं, जबकि क्वाड्रेंट 3 और 4 देर से अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  7. सांख्यिकीय शक्ति के लिए एक ही तरीके से अतिरिक्त प्रतिकृति जोड़ें.
  8. डेटा व्याख्या साजिश के लिए जल्दी और देर से एक बार साजिश में MFI मूल्यों:
  9. विभिन्न दाताओं या वायरस उपभेदों से प्राप्त NCCR गतिविधियों की तुलना करने के लिए, एक archetypical नियंत्रण या Dunlop तनाव16 जोड़ने के लिए और 100% करने के लिए अपने रिश्तेदार MFIs सेट, और रिश्तेदार MFI मूल्यों की गणना. प्रत्येक प्रतिकृति के साथ दोहराएँ और मतलब और मानक विचलन निर्धारित करते हैं.
  10. ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि पर संभावित यौगिकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, विलायक नियंत्रण को 100% पर सेट करें और उपचारित कोशिकाओं के MFI को प्लॉट करें।

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Representative Results

इस प्रतिनिधि प्रयोग में, BK-polyomavirus गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र संचालित ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से मापा गया था. इसके अलावा, एक MTOR अवरोध करनेवाला, जो BKPyV पुनः सक्रियण के बाद रोगियों के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वायरल जल्दी जीन अभिव्यक्ति के अपने निषेध के लिए परीक्षण किया गया था. यह अंत करने के लिए, एक दोहरी फ्लोरोसेंट-रिपोर्टर परख पहले प्रकाशित5के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्रायोगिक सेटअप की समग्र कार्यप्रवाह योजना को Figure 1में दिखाया गया है। सबसे पहले, संस्थागत नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित मानव अनुसंधान के दिशानिर्देशों के अनुसार प्रतिरक्षा रोगी वृक्कित रोगियों से रक्त के नमूने एकत्र किए गए। रक्त EDTA युक्त ट्यूबों में एकत्र किया गया था और चरणों centrifugation द्वारा अलग किया गया. बाद में, polyomavirus डीएनए के अलगाव के लिए प्लाज्मा के 400 डिग्री एल इस्तेमाल किया गया था. गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (एनसीसीआर) को नेस्टेड-पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके बढ़ाया गया था जैसा कि बाहरी प्राइमर जोड़ी बीकेवी-सीआर-1एफऔर बीकेवी-सीआर-1आरवी, साथ ही आंतरिक प्राइमर जोड़ी बीकेवी-सीआर-2fw-आयुआई (प्राइमर एजीआई) और बीकेवी-सीआर-2-एसप() का उपयोग करते हुए चित्रा 2ए में सचित्र में सचित्र ा0वर्ग प्राइमर SpeI)17, जिनमें से बाद AgeI और SpeI के लिए प्रतिबंध साइटों बंदरगाह. एम्पिकन सत्यापन चित्र 2खमें दर्शाए अनुसार अगारोस जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस के माध्यम से किया गया था. जबकि आर्केटाइपिक एनसीसीआर दृश्यों (डब्ल्यूटी) से प्राप्त amplicons जेल में एक सजातीय आकार वितरण किया था, उन सम्मिलन के साथ पुनर्व्यवस्थित NCCRs से व्युत्पन्न (आरआरइन )और विलोपन (आर आरडेल) उनके आकार में भिन्न (लगभग 300-500 बीपी). विशेष रूप से, पुनर्व्यवस्था के कारण, डनलप एनसीसीआर संदर्भ अनुक्रम16 (DUN), जिसे नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था, आर्केटाइपिक वायरस से प्राप्त एनसीसीआर से बड़ा था। चूंकि प्रवर्धक अनुमानित आकारों के अनुरूप थे, इसलिए शुद्ध PCR उत्पादों को आगे के विश्लेषण के लिए रिपोर्टर प्लाज्मिड में क्लोन किए गए अनुक्रमों के साथ बाद में तुलना के लिए Sanger अनुक्रमण के लिए भेजा गया था।

amplicons की क्लोनिंग के लिए, पाचन दो प्रतिबंध एंजाइमों AgeI और SpeI का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर में क्लोनिंग के बाद, जो मानक क्लोनिंग प्रक्रिया का उपयोग करके किया गया था, एनसीसीआर वाले सकारात्मक क्लोनों का चयन आयुआई और स्पीआई पाचन द्वारा सत्यापित किया गया था (चित्र 2C)। यहाँ, छोटे स्पेसर क्षेत्र (एनसी, 128 बीपी) बड़े NCCR-fragments (लगभग 300-500 बीपी) सकारात्मक क्लोन का संकेत द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था. सत्यापित क्लोन से अलग Plasmid डीएनए Sanger अनुक्रमण के लिए भेजा गया था और amplicon अनुक्रमण से प्राप्त दृश्यों के साथ तुलना में (नहीं दिखाया). केवल क्लोन है कि amplicon अनुक्रम मैच आगे प्रसंस्करण के लिए चुना गया. जैसा कि चित्र 3में दर्शाया गया है , अनुक्रमण परिणामों की तुलना एक आद्य विशिष्ट एनसीसीआर अनुक्रम (JN192438) से की गई थी। इस उदाहरण में, P-ब्लॉक में हटाने और O-ब्लॉक में प्रतिस्थापन पाया गया।

बाद में सेल संस्कृति में क्लोन एनसीसीआर दृश्यों की प्रतिलेखनात्मक गतिविधि का परीक्षण करने के लिए, HEK293T कोशिकाओं को संबंधित रिपोर्टर निर्माणों के साथ क्षणिक रूप से transfected किया गया (चित्र 4A)। जैसा कि चित्र 4खमें देखा गया है, ट्रांसफेक्शन दक्षता और एनसीसीआर-सक्रियता को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से निगरानी की गई थी। लाल और हरे रंग की फ्लोरोसेंट क्रमशः5जल्दी और देर BKPyV जीन अभिव्यक्ति के अनुरूप. कोशिकाओं दोनों फ्लोरोफोर्स कुशल जल्दी और देर से promotor गतिविधि का संकेत व्यक्त किया. जैसा कि दो उदाहरणों द्वारा सचित्र है, पहले एनसीसीआर (एनसीसीआर1) ने एक मजबूत देर जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शित की, जबकि दूसरा उदाहरण (NCCR2) का अपेक्षाकृत मजबूत प्रारंभिक लेकिन मध्यम देर से जीन अभिव्यक्ति (चित्र4B) था। इस प्रकार, नमूने प्रवाह साइटोमेट्री माप के लिए तैयार किए गए थे। प्रोटोकॉल खंड 6 में वर्णित के रूप में, DAPI नकारात्मक कोशिकाओं gated थे (चित्र 5A,कम पैनल) और एक डॉट साजिश eGFP बनाम tdTomato दिखा बनाया गया था. नमूने जो ऋणात्मक थे (चित्र 5B), साथ ही tdTomato के लिए सकारात्मक (चित्र 5C) या eGFP (चित्र 5D) केवल विश्लेषण में शामिल किए गए थे. ध्यान दें, प्रारंभिक मुआवजा प्रदर्शन किया गया था, जो लाल और हरे संकेतों को अलग करने के लिए और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है18. माध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रत्येक परीक्षण क्लोन से प्राप्त की गई थी। यहाँ, tdTomato सकारात्मक कोशिकाओं जल्दी अभिव्यक्ति के अनुरूप है, जबकि eGFP सकारात्मक कोशिकाओं देर अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व किया. इस उदाहरण में दोहरी mTOR अवरोध करनेवाला INK128 के साथ उपचार काफी कम tdTomato MFI (चित्र 5E-F), जिसका अर्थ है कि जल्दी अभिव्यक्ति बाधित किया गया था.

Figure 1
चित्र 1 : प्रयोगात्मक सेटअप के लिए कार्यप्रवाह योजना. 1) रक्त का संग्रह (वैकल्पिक मूत्र) नमूने, 2) polyomavirus डीएनए के अलगाव 3) गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र के प्रवर्धन (NCCR) एक नेस्टेड-पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर, 4) Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस और amplicon सत्यापन, 5) पीसीआर amplicon के Sanger अनुक्रमण, 6) AGEI और SpeI का उपयोग दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर में NCCR की क्लोनिंग, 7) सकारात्मक क्लोन का चयन, 8) प्लाज्मिड डीएनए के Sanger अनुक्रमण, 9) पत्रकार प्लाज्मिड और यौगिकों के अलावा परीक्षण किया जा करने के साथ HEK293T कोशिकाओं के क्षणिक transfection, 10) कुशल transfection सत्यापित करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, 11) प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण, 12) गैटिंग और eGFP tdTomato अभिव्यक्ति का विश्लेषण, 13) डेटा व्याख्या. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : नेस्टेड पीसीआर और रोगी व्युत्पन्न NCCR-amplicons के प्रतिनिधि विश्लेषण. ए) प्रतिरक्षा समझौता गुर्दे प्रतिरोपित रोगियों से व्युत्पन्न डीएनए अर्द्ध-नेस्टेड पीसीआर प्रवर्धन के अधीन किया गया था प्रतिबंध साइटों AgeI और SpeI के साथ जुड़े ओलिगोन्यूक्लिओटाइड प्राइमर का उपयोग कर। बीकेपीवी तनाव JN192438 से प्रधान नाम और लंबाई (आधार जोड़े) आद्य ओ, पी, क्यू, आर, और एस ब्लॉक के कोष्ठक में संकेत दिया जाता है। बी) Amplicons में electrophoresis द्वारा विश्लेषण किया गया 1.5% agarose जेल और डीएनए धुंधला का उपयोग कर कल्पना की. M1 ] 100 बीपी सीढ़ी, wt ] wildtype (archetypical), rr ] पुनर्व्यवस्थित, ins ] सम्मिलन, डेल] विलोपन, DUN ] Dunlop तनाव. सी) AgeI और SpeI के साथ Plasmid पाचन. पाचन टुकड़े 1.5% agarose जेल में electrophoresis द्वारा विश्लेषण किया गया और डीएनए धुंधला का उपयोग कर कल्पना की. M1 $ 100 बीपी सीढ़ी, M2 ] 2-लॉग सीढ़ी. नेकां - नकारात्मक नियंत्रण (स्पेसर). + - सकारात्मक क्लोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 3
चित्र 3 : क्लोनिंग और दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर में NCCR के सत्यापन. प्लाज्मिड अनुक्रमण के प्रतिनिधि परिणाम। Amplicons एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध और Sanger अनुक्रमण के अधीन थे. संबंधित दृश्यों एनसीसीआर अनुक्रम के लिए गठबंधन किया गया था कट्टर BKPyV तनाव JN192438 से व्युत्पन्न. हटाने और प्रतिस्थापन लाल रंग में चिह्नित हैं। AgeI और SpeI प्रतिबंध साइटों, eGFP खुला पढ़ने फ्रेम के translational शुरू (बोल्ड में मुद्रित) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NCCR ब्लॉक ओ एस संकेत दिया जाता है. संबंधित ब्लॉक और प्रतिबंध साइटों रंग में प्रकाश डाला जाता है. आधार युग्मों में प्रत्येक एनसीसीआर ब्लॉक की लंबाई कोष्ठकों में मुद्रित की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 4
चित्र 4 : जल्दी और देर से NCCR प्रमोटर गतिविधि के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विश्लेषण. क) द्विदिश प्रमोटर के नियंत्रण में दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का जीन नक्शा. जैसा कि पहले वर्णित5 प्लाज्मिड पीटीए-टीडीटीओएम-एनसीसीआर-eGFP (6,009 बीपी) प्रत्येक अभिव्यक्ति कैसेट के नीचे SV40 देर polyadenylation संकेत बंदरगाह tdTomato के लिए दोनों टेप के तुलनीय और कुशल प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए (जल्दी अभिव्यक्ति) और eGFP (देर अभिव्यक्ति), क्रमशः. एनसीसीआर आयुआई और स्पाई आई से घिरा हुआ है। वेक्टर क्लोनिंग प्रक्रिया के दौरान चयन के लिए एक एम्पसिलिन प्रतिरोध कैसेट शामिल हैं। बी) HEK293T कोशिकाओं दोहरी-fluorscence रिपोर्टर के साथ transfected थे रोगी व्युत्पन्न NCCR दृश्यों (NCCR1-2) के नियंत्रण में प्रत्येक का निर्माण. कोशिकाओं को ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विश्लेषण 72 एच पोस्ट ट्रांसफेक्शन के अधीन किया गया। माइक्रोस्कोप के फ़िल्टर सेटिंग्स निम्नलिखित उत्तेजना पर्वतमाला में इस्तेमाल किया गया: tdTomato के लिए हरे रंग (515-560 एनएम) और eGFP (450-490 एनएम) के लिए नीले. पैमाने पट्टी (200 डिग्री मीटर) प्रत्येक फोटोग्राफी के नीचे सही में संकेत दिया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : प्रतिनिधि FACS विश्लेषण. दिखाया गया है सरल gating रणनीति इस विधि के लिए आवश्यक है. दो-पैरामीटर घनत्व या डॉट भूखंडों का उपयोग किया जाता है। ए) सबसे पहले, FSC प्रशांत ब्लू के खिलाफ साजिश रची है, जबकि केवल DAPI नकारात्मक (यानी, जीवित कोशिकाओं) आगे संसाधित कर रहे हैं. बी-एफ) FITC (eGFP) बनाम पीई (tdTomato) प्लॉट किए जाते हैं। सी-डी) प्रवाह साइटोमीटर पर मुआवजे को समायोजित करने के लिए विशेष रूप से हरे और लाल फ्लोरोसेंट कोशिकाओं जोड़ें। ई-एफ) इस उदाहरण में, MTOR inhibitors INK128 और काफी tdTomato MFI कम कर देता है, जो BKPyV जल्दी जीन अभिव्यक्ति की कमी से मेल खाती है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राइमर नाम अनुक्रम (5' $ 3')
बीके-सीआर-fwd1 सीसीसीएजीजीएजीसीटीटीसीएजीसी
बीके-सीआर-रिव1 सीसीटीसीच्या आतच्या
बीकेवी-सीआर-2-fw-AgeI AAAAAACCGGT TTGCAAAAATGCAAAGAATAGG
बीकेवी-सीआर-2-आरवी-स्पेआई टीटीटीटीएक्टाजीटीसीटीजीजीसीजीएजीएजीसीसीटी
ईजीएफपी-एन CGTCGCCTCCAGCCGACCAG

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाले ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स। रेखांकित ठिकानों क्रमशः AgeI और SpeI के लिए प्रतिबंध एंजाइम साइटों से संकेत मिलता है.

घटक वॉल्यूम/प्रतिक्रिया (जेडएल) अंतिम सांद्रण
RNase मुक्त पानी 32.8 $L -
10x पीसीआर बफर 5 $L 1x
डीएनटीपी (प्रत्येक के 10 एम एम) 1 $L प्रत्येक डीएनटीपी के 0.2 एम.एम.
Fwd-प्राइमर (10 $M) 3 $L 0.3 $M
रेव-प्राइमर (10 डिग्री सेल्सियस) 3 $L 0.3 $M
ताक पॉलिमरेज 0.2 जेडएल 2 इकाई/
टेम्पलेट डीएनए 5 $L 0.5 ग्राम/50 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया

तालिका 2: मास्टर मिश्रण तैयारी प्रोटोकॉल. यह अनुदेश क्रमशः 2ण्2 तथा 2ण्7 में वर्णित पूर्व और नेस्टेड PCR अभिक्रियाओं पर लागू होता है.

तापमान अवधि पीसीआर-चरण चक्र
95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट प्रारंभिक विकृतीकरण
95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड विकृतीकरण
55 डिग्री सेल्सियस 34 सेकंड अनीलन x35
72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट एक्सटेंशन
72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट अंतिम विस्तार
4 डिग्री सेल्सियस ∞ शीतलक

तालिका 3: पीसीआर प्रोग्राम एनसीसीआर प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया। अनुदेश दोनों पूर्व और नेस्टेड PCR प्रतिक्रियाओं के लिए लागू होता है.

अभिकर्मक वॉल्यूम/प्रतिक्रिया (जेडएल) अंतिम सांद्रण
DNase मुक्त H20 6 20 डिग्री करने के लिए
10x बफर २ 1x
AgeI 1 10 इकाइयां
SpeI 1 10 इकाइयां
शुद्ध पीसीआर-एम्प्लिकॉन 10 चर

तालिका 4: एम्पलिकॉन पाचन प्रोटोकॉल. अनुदेश चरण 3.1 में वर्णित दो प्रतिबंध एंजाइमों के साथ amplicon डीएनए के एक साथ पाचन के लिए लागू होता है.

अभिकर्मक वॉल्यूम/प्रतिक्रिया (जेडएल) अंतिम सांद्रण
DNase मुक्त H20 14.5 20 डिग्री करने के लिए
10x बफर २ 1x
AgeI 1 10 इकाइयां
SpeI 1 10 इकाइयां
प्लाज्मिड रीढ़ (1 ग्राम/ 1.5 1.5 $g

तालिका 5: प्लाज़्मिड पाचन प्रोटोकॉल. अनुदेश कदम 3.3 में वर्णित दो प्रतिबंध एंजाइमों के साथ प्लाज्मिड डीएनए रीढ़ की हड्डी के एक साथ पाचन के लिए लागू होता है.

अभिकर्मक वॉल्यूम/प्रतिक्रिया (जेडएल) अंतिम सांद्रण
DNase मुक्त H20 7 20 डिग्री करने के लिए
T4 डीएनए लिगेस 1 20
10x T4 डीएनए लिगे बफर २ 1x
शुद्ध प्लाज़्मिड रीढ़ की हड्डी
कम पिघल पतला 1/		 २ चर
पाचन और शुद्ध पीसीआर-एम्प्लिकन से कदम 2.7 8 चर

तालिका 6: प्लाज़्मिड लिगेशन प्रोटोकॉल। अनुदेश चरण 3.7 में वर्णित पचापीसीआर amplicon डीएनए के साथ प्लाज्मिड डीएनए रीढ़ की हड्डी के लिगेशन के लिए लागू होता है।

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Discussion

इस लेख में, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि प्रस्तुत किया है कि BKPyV गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (NCCR) जल्दी और देर से प्रमोटर गतिविधि संचालित के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. एनसीसीआर गतिविधि को एक साथ मापा जा सकता है और ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के lysis की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या का विश्लेषण किया जा सकता है और फ्लोरोसेंट मूल्यों के सामान्यीकरण के लिए अतिरिक्त मार्करों के सह-स्थानांतरण आवश्यक नहीं है।

इस विधि का एक महत्वपूर्ण हिस्सा यह है कि क्लोन एनसीसीआर में बिल्कुल समान अनुक्रम शामिल होने चाहिए जैसा कि एम्प्लिकॉन अनुक्रमण द्वारा पहचाना जाता है, जो रोगी प्लाज्मा में मौजूद बहुमत वेरिएंट से मेल खाता है। सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए और पीसीआर प्रवण त्रुटियों को कम करने के लिए यह अत्यधिक सबूत पढ़ने गतिविधि के साथ एक polymerase का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. वैकल्पिक रूप से, दृश्यों वाणिज्यिक जीन संश्लेषण सेवाओं द्वारा आदेश दिया जा सकता है. नामित एनसीसीआर अनुक्रमों को प्रत्यक्ष क्लोनिंग के लिए एजीआई और स्पीआई प्रतिबंध स्थलों सहित आदेशित किया जा सकता है। इस मामले में, रीढ़ की हड्डी प्लाज्मिड के समानांतर प्लाज्मिड को पचाएं और स्पेसर डालने को संश्लेषित निर्माण से संबंधित एनसीसीआर टुकड़े के साथ बदलें। डीएनए वैकल्पिक रूप से मूत्र के नमूने से अलग किया जा सकता है. हालांकि, चूंकि BKPyV भी इम्यूनोअक्षम व्यक्तियों द्वारा मूत्र में स्रावित होता है और जरूरी नहीं कि सक्रिय प्रतिकृति को प्रतिबिंबित करता है, नैदानिक प्रासंगिकता सीमित है। आदर्श रूप में, डीएनए भी गुर्दे बायोप्सी जिसमें पहले PVAN histologically पता लगाया जा सकता है से अलग किया जा सकता है (कोर्थ एट अल के साथ तुलना करें,201919).

हरे और लाल फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के द्वारा, इस विधि transfection दक्षता और परीक्षण एजेंटों के विरोधी proliferative प्रभाव के पूर्वाग्रह के बिना NCCR व्युत्पन्न फ्लोरोसेंट / अवरोधक INK128 या PP242)5|

रिपोर्टर प्रणाली का एक अन्य आवेदन जल्दी और देर से promotor गतिविधि पर नैदानिक अलग में पाया NCCR में सम्मिलन, विलोपन, या duplications के परिणामों का विश्लेषण करने की संभावना है. पिछले अध्ययनों में, इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों का एनसीसीआर गतिविधि को मॉड्युलेट करने के लिए अध्ययन किया गया है; तथापि, कोई उत्परिवर्तन या एनसीसीआर पुनर्व्यवस्था नहीं पाई गई जो संवेदनशीलता को प्रभावित करती है। हालांकि, उत्परिवर्तन ों वाले नए पदार्थों की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं जिन्हें निकट भविष्य में अनुमोदित किया जा सकता है।

यह प्रासंगिक हो सकता है क्योंकि कोडिंग क्षेत्रों के विपरीत बड़े टी एंटीजन या VP1 capsid प्रोटीन, NCCR के रूप में नाम का तात्पर्य एक noncoding क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है और इस तरह एमिनो एसिड स्तर पर चयनात्मक दबाव underlie नहीं है.

इस प्रोटोकॉल में, एनसीसीआर युक्त सकारात्मक क्लोन के चयन AgeI और SpeI पाचन द्वारा सत्यापित किया जाता है। हालांकि, एक कॉलोनी पीसीआर जल्दी से NCCR के लिए स्क्रीन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व हो सकता है e. कोलाई से सीधे agar प्लेटों पर चढ़ाया. इस दृष्टिकोण के लिए, प्राइमर जोड़ी BKV-CR-2-fw-AgeI और EGFP-N (तालिका 1) का उपयोग करें। ट्रांसफेक्शन के बाद, कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाल और हरे रंग के फ्लोरोसेंट के लिए जाँच की जाती है (चित्र 4)। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को 22 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 3% पीएफए का उपयोग कर तय किया जा सकता है। इस मामले में, पीबीएस के साथ धोने, पीबीएस में 0.2% गैर-आयनिक डिटर्जेंट जोड़ें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। फिक्स्ड कोशिकाओं को पीबीएस में डीएपीआई के साथ दागा जा सकता है (1 डिग्री जी/एमएल) 22 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए और फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के अधीन और यूवी प्रकाश (340-380 एनएम) के साथ कल्पना की जा सकती है।

चूंकि दोनों फ्लोरोफोर्स एक ही पॉलीएडेनिलेशन संकेतों को आश्रय देते हैं, इसलिए पॉलीएडेनिलेशन दक्षता का प्रभाव खारिज किया जा सकता है। हालांकि, eGFP की तुलना में, tdTomato एक dimeric प्रोटीन जो इसी एक लंबे समय तक MRNA में टाइप किया जाना चाहिए है (कोडिंग अनुक्रम: 745 बनाम 1431 bp, क्रमशः). हालांकि, के बाद से हस्तक्षेप पदार्थों के साथ इलाज कोशिकाओं से प्रमोटरों की गतिविधि हमेशा अनुपचारित (DMSO) कोशिकाओं के सापेक्ष तुलना में कर रहे हैं, इस अंतर थोड़ा भूमिका निभाता है. प्रतिकृति की उत्पत्ति की उपस्थिति के कारण, कोशिकाओं में रिपोर्टर प्लाज्मिड के transfection stably SV40PyV बड़े टी प्रतिजन व्यक्त बेटी कोशिकाओं को प्लाज्मिड के हस्तांतरण की अनुमति देता है. यह दिखाया गया है कि एसवी 40 व्युत्पन्न बृहत् टी प्रतिजन एसवी 40 और बीकेपीवी एनसीसीआर और वायरल डीएनए प्रतिकृति20को निष्क्रिय कर सकता है। हालांकि, के बाद से एक बड़े टी प्रतिजन भी संक्रमण के देर से चरण के लिए जल्दी से संक्रमण में शामिल है, एक कृत्रिम स्थिति दी जाती है. इस परख का उपयोग करना, यह माना जाना चाहिए कि सबसे प्रतिकृति सीमित कदम जल्दी अभिव्यक्ति बड़ी टी प्रतिजन की अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी है. पूर्ण प्रतिकृति चक्र को मैप करने के लिए प्रारंभिक और देर से MRNAs संक्रमित कोशिकाओं में क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा मापा जाना चाहिए के रूप में कहीं और वर्णित5,12.

एक तुलनीय विधि पहले से ही स्विस और जर्मन समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है archetypical का विश्लेषण करने के लिए और पुनर्व्यवस्थित BKPyV NCCR व्युत्पन्न promotor गतिविधियों, हालांकि स्वतंत्र रूप से क्लोन वेक्टर सिस्टम5,9 केसाथ. गोसेर्ट और बेसल के सहयोगियों ने बीकेपीवी और जेसीपीवी कीएनसीसीआर प्रमोटर गतिविधि 9 ,10,11का निर्धारण करने के लिए इसी प्रकार की विधि का प्रयोग किया . दोनों तरीकों हरी फ्लोरोसेंट के लिए eGFP इस्तेमाल किया; हालांकि, बेसल समूह RFP का इस्तेमाल किया, जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल tdTomato में लाल फ्लोरोसेंट के लिए इस्तेमाल किया गया था. आरएफपी पर tdTomato का लाभ बहुत अधिक प्रकाशस्थिरता है; हालांकि, द्वि-अंगी प्रोटीन एक अनुक्रम द्वारा इनकोडिंग किया जाता है जो RFP21के रूप में दो बार होता है। इसके अलावा, प्रोटीन के आधे जीवन अलग हो सकता है, असमान एकाग्रता 72 एच पोस्ट transfection में जिसके परिणामस्वरूप. हालांकि, यह समस्या केवल प्रासंगिक हो सकता है जब सीधे दोनों फ्लोरोसेंट तीव्रता की तुलना. गोसर्ट एट अल बमही और NotI प्रतिबंध साइटों के रूप में इस्तेमाल किया, जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल AgeI और SpeI में NCCR अनुक्रम flanking हैं. दोनों विधियों का प्रयोग करते हुए संदर्भ DUNLOP तनाव16 ने मजबूत प्रारंभिक लेकिन कमजोर देर से प्रमोटर गतिविधि9,10के साथ तुलनीय फ्लोरोसेंट पैटर्न प्राप्त किया . आगे के समझौते में, पी-क्षेत्र में सम्मिलन के साथ एनसीसीआर-पुनर्व्यवस्थाओं के परिणामस्वरूप डब्ल्यूटी-एनसीसीआर5,9की तुलना में प्रारंभिक और देर से प्रमोटर गतिविधि में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई।

हालांकि यह दिखाया गया है कि SV40 व्युत्पन्न बड़े टी प्रतिजन SV40 और BKPyV व्युत्पन्न NCCRs20transactivate कर सकते हैं , यह मानव कोशिकाओं है कि stably BKPyV के बड़े टी प्रतिजन व्यक्त और नहीं भविष्य के अध्ययन में प्रोटोटाइप वायरस SV40 का उपयोग करने के लिए दिलचस्प हो सकता है . हालांकि, इस मामले में सेल लाइन transfect करने के लिए आसान हो गया है (उदा., HEK293).

चूंकि polyomaviruses के NCCR प्रमोटरों बहुत समान हैं, इस विधि भी इस्तेमाल किया जा सकता है (प्राइमर दृश्यों में छोटे अनुकूलन के साथ) प्रमोटर गतिविधि और जेसी-polyomavirus की गतिविधि पर शक्तिशाली एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव की जांच करने के लिए (JCPyV) व्युत्पन्न गैर कोडिंग नियंत्रण क्षेत्रों11| चूंकि JCPyV प्रगतिशील multifocal ल्यूकोएन्सेफेलोपैथी (पीएमएल) का कारक एजेंट है, एक दुर्लभ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोग है कि शायद ही कभी गंभीर न्यूरोपैथोलॉजी में जिसके परिणामस्वरूप इम्यूनोडिबिलेक्शन के साथ रोगियों में हो सकता है, वहाँ भी एक दबाव को खोजने की जरूरत है प्रतिरक्षा समझौता रोगियों के इलाज के लिए प्रत्यक्ष अभिनय एंटीवायरल पदार्थ। दिलचस्प बात यह है कि जेसी एनसीसीआर11में भी पुनर्व्यवस्थाएं पाई जाती हैं। चूंकि JCPyV neurotropism स्पष्ट किया है और इस तरह वायरस की बड़ी मात्रा में शराब में पाए जाते हैं, नमूना अधिग्रहण शराब व्युत्पन्न डीएनए के लिए समायोजित किया जाना है. हालांकि, बाद के चरणों को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

जोहान्स Korth Astellas और नोवार्टिस से वक्ता की फीस और यात्रा के खर्च के लिए अनुदान प्राप्त हुआ है. Marek Widera नोवार्टिस से परामर्श शुल्क प्राप्त किया है. ओलिवर Witzke नैदानिक अध्ययन के लिए अनुदान प्राप्त हुआ है, वक्ता की फीस, honoraria और Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, ब्रिस्टल-मायर्स-स्क्विब, Correvio, Chiesi, गिलाद, हेक्साल, Janssen, डॉ एफ केलर Chemie, MSD, नोवार्टिस, Roche, Roche से यात्रा व्यय फाइजर, Sanofi और TEVA.

Acknowledgments

लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए बारबरा Bleekmann धन्यवाद. इन अध्ययनों Duisburg-एस्सेन मेडिकल स्कूल के विश्वविद्यालय के IFORES कार्यक्रम और विश्वविद्यालय एलायंस Ruhr और Mercator अनुसंधान केंद्र Ruhr (MERCUR) के RIMUR कार्यक्रम द्वारा समर्थित थे. लेखक हेलेन Sertznig और लगातार समर्थन की डॉक्टरेट फैलोशिप के लिए जेरगेन-मंचोट-स्टिफटंग धन्यवाद. रोगी सामग्री के संग्रह और उपयोग विश्वविद्यालय Duisburg-Essen (14-6028-BO) के चिकित्सा संकाय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 bp ladder NEB N3231 Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted
2-log ladder NEB N0550 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Agar-Agar, Kobe I Carl Roth 5210.3
AgeI-HF NEB R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure Carl Roth HP62.1
Aqua ad iniectabilia Bbraun 2351744 can be substituted by any manufacturer
BD FACSCanto™ II BD Biosciences
BD FACSDiva BD Biosciences
DAPI Sigma 10236276001
DFC450C camera module Leica Any camera can be used
DMEM Gibco 41966-029 can be substituted by any manufacturer
DMIL LED microscope Leica Any fluorescence microscope can be used
DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 can be substituted by any manufacturer
E.coli DH5alpha Competent Cells Thermo Scientific 18258012
FBS Superior MerckMillipore 50615 Any FBS can be used
FlowJo v10.5.3 FlowJo, LLC Any flow cytometry software FBS can be used
Gel Loading Dye, Purple (6X)  NEB B7024 Any 6x loading dye can be substituted
HEK293T cells ATCC 11268 These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.
HERAcell® 240i CO2 Incubator Thermo Scientific can be substituted by any manufacturer
HotStar PCR kit Qiagen 203203
Intas Gel documentation system Intas Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used
Low Melt Agarose Biozym 850081 can be substituted by any manufacturer
Opti-MEM Invitrogen 31985070 can be substituted by any manufacturer
pBKV (34-2) ATCC 45025 Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS Gibco 14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler Bio-Rad discontinued product Any thermocycler can be used
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega #C1145 can be substituted by any manufacturer
PCR1 and PCR2 Primers metabion not applicable Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water
PenStrep (100x) Gibco 15140-122 can be substituted by any manufacturer
Roti®-GelStain Carl Roth 3865 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
SpeI-HF NEB R3133
T4-DNA Ligase NEB M0202
TransIT LT1 Mirus MIR2300
Trypsin 0.05% - EDTA Gibco 25300-054 can be substituted by any manufacturer
ZymoPURE II Plasmid Kit Zymo D4201 can be substituted by any manufacturer

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References

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जेनेटिक्स अंक 149 बीके-पॉलीओमावायरस बीकेपीवी नॉन-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र एनसीसीआर द्विदिश प्रमोटर गतिविधि एफएसीएस एंटीवायरल गतिविधि गुर्दे प्रत्यारोपण बड़े टी प्रतिजन एसवी 40
बीके-पॉलीओमावायरस गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र संचालित ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि वाया फ्लो साइटोमेट्री का मापन
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Korth, J., Sertznig, H., Moyrer, S., Doevelaar, A. A. N., Westhoff, T. H., Babel, N., Witzke, O., Kribben, A., Dittmer, U., Widera, M. Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (149), e59755, doi:10.3791/59755 (2019).

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