Summary
في هذه المخطوطة، يتم تقديم بروتوكول لإجراء قياس يستند إلى FACS للنشاط النسخي لفيروس الورم الأوب باستخدام خلايا HEK293T المنقولة مع بلازميد مراسل ثنائي الاتجاه يعبر عن tdTomato وeGFP. كما تسمح هذه الطريقة بتحديد تأثير المركبات الجديدة على النسخ الفيروسي بشكل كمي.
Abstract
يمكن أن تسبب الفيروسات المتعددة، مثل فيروس الورم المتعدد BK (BKPyV)، أمراضًا حادة لفي المرضى الذين يعانون من ضعف المناعة. ومع ذلك، بما أن مضادات الفيروسات عالية الفعالية غير متوفرة حالياً، فإن هناك حاجة إلى أساليب لقياس تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة. هنا، تم بناء مراسل الفلورة المزدوجة التي تسمح بتحليل BKPyV غير الترميز السيطرة المنطقة (NCCR) مدفوعة في وقت مبكر ونشاط المروج في وقت متأخر لتحديد تأثير الأدوية المضادة للفيروسات المحتملة على التعبير الجيني الفيروسي عن طريق tdTomato وeGFP التعبير. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق استنساخ التضخيم BKPyV-NCCR التي تم الحصول عليها في هذا البروتوكول بشكل مثالي من الحمض النووي المستمدة من الدم من المرضى الذين زرعوا الكلى المناعية، يمكن تحديد تأثير إعادة ترتيب NCCR على التعبير الجيني الفيروسي. بعد استنساخ التضخيم المشتقة من المريض، تم نقل خلايا HEK293T مع البلازميدات المراسل، وعولجت مع العوامل المضادة للفيروسات المحتملة. وفي وقت لاحق، خضعت الخلايا لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لقياس متوسط كثافة الفلورة 72 ساعة بعد الانتراب. لاختبار أيضا تحليل الأدوية التي لها دورة الخلية المحتملة تثبيط تأثير, يتم استخدام الخلايا الفلورية فقط وبالتالي. بما أنّ هذا فحص يكون أنجزت في كبيرة [ت] مستضد عبّر عن خلايا, التأثير صدمة من مبكّرة وتعبير متأخّرة يستطيع كنت حللت في طريقة مستقلّة متبادلة.
Introduction
تمثل فيروسات الورم اللامع عائلة مستقلة من فيروسات الحمض النووي المزدوج (dsDNA) الصغيرة التي تقطعت بها السبل مع فيروس سيميان 40 (SV40) كنوع أولي. تحدث العدوى الأولية بشكل رئيسي خلال مرحلة الطفولة، والتي عادة ما تستمر دون أعراض المرض وعادة ما تسبب التهابات كامنة في المضيفين المختصة المناعية. فيروس الورم الحميد BK (BKPyV) يستمر بشكل رئيسي في خلايا الأنابيب الكلوية دون التسبب في أمراض الكلى، ومع ذلك، في حالة ضعف الكفاءة المناعية بعد زرع الكلى يمكن أن يعيد تنشيط الفيروس ويسبب أضرار شديدة وضعف الكسب غير المشروع وظيفة عند الوصول إلى فيرميا عالية (1 × 104 BKPyV نسخ الحمض النووي / مل)1،2. في ما يقرب من 10٪ من متلقي زراعة الكلى، يؤدي إعادة تنشيط فيروس الورم البولي BK (BKPyV) إلى اعتلال الكلى المرتبط بفيروس الورم الحميد (PyVAN)، والذي كان يصل إلى 80٪ المرتبطة بارتفاع خطر فشل الطعوم الكلوية3،4 . وبما أنه لا تتوفر أي عوامل مضادة للفيروسات المعتمدة، يقوم العلاج الحالي على الحد من كبت المناعة. ومن المثير للاهتمام, مثبطات mTOR يبدو أن لها تأثير مضاد للفيروسات; وبالتالي، فإن تحويل العلاج المثبط للمناعة إلى كبت المناعة القائم على mTOR قد يمثل نهجا بديلا لمنع تطور فيرميا BKPyV5،6،7. ومع ذلك، فإن الآلية المضادة للفيروسات المستندة إلى mTOR لا تزال حاليا غير مفهومة بشكل كامل. وبالتالي، هناك حاجة إلى طرق لقياس تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة في التركيزات ذات الصلة سريرياً.
يتكون الجينوم الدائري للBKPyV من حوالي 5 كيلو بايت يؤوي منطقة تحكم غير ترميزية (NCCR) التي تعمل كأصل للنسخ المتماثل وفي الوقت الذي يقوم فيه مروج ثنائي الاتجاه يقود التعبير عن النصوص في مرحلة مبكرة ومتأخرة من الحمض النووي الريبي. منذ تحدث تلقائيا NCCR-إعادة ترتيب، يتم العثور على الحذف، والازدواجية في BKPyV المسببة للأمراض8 وتراكمت بشكل كبير في المرضى الذين يعانون من PVAN5،9، مقارنة بين archetypical (الوزن) و إعادة ترتيب (ص) NCCR الأنشطة مفيدة لوصف اللياقة البدنية فيروسي ة.
كما هو ملخص في الشكل 1، يصف هذا البروتوكول طريقة شائعة الاستخدام لقياس نشاط النسخ BKPyV NCCR من خلال قياس الفلورة من اثنين من الفلوروفور tdTomato وeGFP أعرب عنها من بلازميد مراسل5، 9،10،11. يتم تنفيذ هذا الإجراء في وجود مستضد T SV40 كبيرة (lTAg)، والذي يسمح لتحليل تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة على نشاط NCCR في وقت مبكر ومتأخر بشكل منفصل5. ويحلل هذا التقييم كذلك أثر إعادة الترتيب على نشاط اللجنة الوطنية للامتحانات والمقارنة مع التقارير الوطنية المتعلقة بالموارد المعتمدة في مجال الصدمات الأرضية5و9. مراسل بلازميد يأوي إشارة SV40 في وقت متأخر polyadenylation المصب من كل إطار القراءة المفتوحة فلوروفور لضمان معالجة قابلة للمقارنة وفعالة من كل من النصوص لtdTomato وeGFP، على التوالي. بالمقارنة مع أساليب qRT-PCR القائمة5،12،وهذا النهج القائم على FACS يمثل منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية البديل متوافق منذ عدم وجود بروتوكولات استخراج معقدة لثقافة الخلايا المصابة وليس مكلفة هناك حاجة إلى الأجسام المضادة لتلطيخ الفلورة المناعية. وعلاوة على ذلك، منذ يتم تحليل كمية محددة من الخلايا الفلورية عن طريق قياس التدفق الخلوي، وتحليل دورة الخلية تثبيط وكلاء ممكن أيضا بطريقة كمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للبحوث البشرية كما أقرتها لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة دويسبورغ- إيسن (14-6028-BO).
1. جمع عينات الدم أو البول وعزل الحمض النووي فيروس الورم
- جمع ما لا يقل عن 3 مل من الدم في أنابيب EDTA أو البول في أنابيب اكتساب.
- الطرد المركزي العينة في 2500 × ز لمدة 15 دقيقة. إذا لزم الأمر، ماصة البلازما في أنبوب جديد وتخزين عينات البلازما في 4 درجة مئوية لعدة أيام أو تجميد في -20 درجة مئوية لتخزين أطول.
- إعداد 40 ميكرولتر من بروتيناس K في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل وإضافة 400 ميكرولتر من البلازما عن طريق الأنابيب.
- Lyse العينة عن طريق إضافة 400 درجة مئوية من العازلة lysis، دوامة لمدة 15 ثانية، وحضانة لمدة 10 دقيقة عند 56 درجة مئوية.
- عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج دم الحمض النووي كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. باختصار، إضافة الكحول وتحميل lysates على عمود تدور تحتوي على غشاء الحمض النووي ملزمة السيليكا القائم. غسل الأعمدة عدة مرات لإنتاج الحمض النووي النقي.
- Elute الحمض النووي العائد في 30-50 درجة مئوية من TE العازلة.
2 - تضخيم منطقة المراقبة غير الترميزية
- تنفيذ الإجراء التالي في غرف منفصلة جسديا. استخدم غرفة معزولة لإعداد الكواشف وتوزيع المزيج على أنابيب PCR.
- إعداد المزيج الرئيسي لPRE-PCR باستخدام الزوج التمهيدي A (الجدول1) في حجم إجمالي قدره 50 درجة مئوية واستخدام الحمض النووي المعزول سابقا من الخطوة 1.6. تتم طباعة مخطط الأنابيب لإعداد المزيج الرئيسي لـ PCR قبل ومتداخلة في الجدول2.
- توزيع 45 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في أنابيب PCR.
- إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي المعزول في أنابيب PCR.
ملاحظة: استخدم غرفة أخرى من غرفة لإعداد المزيج الرئيسي لتجنب التلوث. - قم بتشغيل PCR مع شروط رد الفعل كما هو موضح في الجدول 3. كرر التناطور، الصلب، والتمديد في 35 دورة.
- للتضخيم المتداخلة استخدام التمهيدي الزوج B إيواء مواقع تقييد لAgeIوSpeI (الجدول 1).
- تشغيل PCR المتداخلة مع شروط رد الفعل كما هو موضح في الخطوات 2.2 إلى 2.5 باستخدام 5 μL من PCR pre-.
- مزيج 10 درجة مئوية من المنتج PCR مع 2 ميكرولتر من 6X هلام صبغ التحميل. تحميل 10 درجة مئوية من المزيج على هلام أجاروز 1.5٪، وتشغيل هلام لمدة 30 دقيقة في 60 مل.
- تصور هلام باستخدام نظام وثائق الأشعة فوق البنفسجية المناسبة.
ملاحظة: من المتوقع أن يكون حجم amplicon بين 300-500 نقطة أساس استناداً إلى ما إذا كانت إعادة الترتيب (عمليات الحذف أو الإدراج أو التكرارات) قد حدثت (الشكل2C). - تنقية amplicons PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. Elute amplicons PCR في 30 درجة مئوية من العازلة elution.
- إرسال amplicons لتسلسل Sanger باستخدام الزوج التمهيدي B.
3- استنساخ اللجنة الوطنية للاستنساخ في المراسل المزدوج الفلوري
- هضم amplicons النقي (الخطوة 2.10) مع AgeI وSpeI لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية كما هو موضح في الجدول 4.
- كرر الخطوة 2.10 وتنقية amplicons المهضوم.
- وبالتوازي مع ذلك، يهضم أيضا العمود الفقري للبلازميد (1.5 ميكروغرام) مع AgeI وSpeI لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية على النحو المبين في الجدول 5. هذه الخطوة تحتاج فقط إلى تنفيذ مرة واحدة. لردود الفعل اللاحقة، تجميد الهضم في -20 درجة مئوية.
- تحليل العمود الفقري بلازميد المهضوم على هلام أروز ذوبان منخفضة 0.8٪.
ملاحظة: لا تقم بتشغيل الجل مع الحالي أعلى من 40 ما إلى هذا اللون. والإدراج المتوقع لمنطقة المتباعدة المستمد أصلاً من البلازميد pEX-K4 2-LTR CD313 هو 128 نقطة أساس (الشكل2C). - تصور شظايا الحمض النووي باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة (320 نانومتر) وقطع الفرقة العمود الفقري باستخدام مشرط نظيفة. نقل جزء هلام تذوب منخفضة في أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge. تجنب أوقات التعرض للأشعة فوق البنفسجية الطويلة لمنع تلف الحمض النووي.
ملاحظة: منذ يتم استخدام الأجاروز ذوبان منخفضة، فإنه ليس من الضروري لتنقية الحمض النووي قبل الربط. - سخني العمود الفقري المعوّض على قطعة أغاروز منخفضة الذوبان لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية من أجل إذابة قطعة الجل واخلطي كل دقيقتين بواسطة الدوامة اللطيفة. يمكن استخدام الجل المذاب مباشرة للربط.
- يُلْقُ العمود الفقري والأمبيراليقّم باستخدام الليغاس الحمض النووي T4 خلال الليل عند 16 درجة مئوية باستخدام المخطط الموضح في الجدول 6.
- قم بإجراء التحول في E. coli باستخدام طريقة الصدمة الحرارية، وبكتيريا اللوحة على لوحات LB-amp، والثقافة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- في اليوم التالي، حدد ثلاثة استنساخ إيجابية وإعداد بين عشية وضحاها E. الثقافات القولونية (5 مل من LB-Amp) والثقافة في 37 درجة مئوية.
- عزل بلازميد الحمض النووي باستخدام بروتوكولات قياسية كما هو موضح في مكان آخر14، أداء AgeI وSpeI الهضم للتحقق من استنساخ إيجابية وتصور قطع شظايا على هلام أغاروز 1٪. سيتم استبدال نطاق الخفض (128 bp) بتسلسل NCCR أكبر (300-500 bp، انظر أعلاه).
- إرسال بلازميد لتسلسل Sanger باستخدام التمهيدي EGFP-Nأو التمهيدي الزوج B (الجدول 1).
- منذ الطفرات قد تحدث تلقائيا، مقارنة نتائج التسلسل مع نتائج التسلسل التي تم الحصول عليها مع amplicon. استخدم فقط النسخ التي تحتوي على تسلسلات متطابقة مقارنة ً بـ amplicon.
- استخدام برنامج منضدة جزيئية (على سبيل المثال، مجانية GENtle 1.9.4 أو غيرها منبرامج تحرير التسلسل) لمحاذاة وتحرير التسلسلات التي تم الحصول عليها (الشكل 3).
- بدء تشغيل GENtle 1.9.4 واستيراد تسلسل اتّباع الحمض النووي بالنقر فوق الزر استيراد (سهم أخضر لأسفل).
- انقر على أداة ثم حدد محاذاة من القائمة (استخدام Ctrl + G كاختصار) واختيار تسلسل اتّباع الحمض النووي للمحاذاة.
- إضافة تسلسل إلى المحاذاة بالنقر فوق إضافة تسلسل أو إزالته بالنقر فوق إزالة. تضمين تسلسل توافق الآراء NCCR archetypical مثل JN19243815، لا تستخدم تسلسل NCCR من Dunlop-strain شائعةالاستخدام 16، لأنها تأوي إعادة ترتيب وازدواجية أخرى من BKPyV archetypical سلالات.
ملاحظة: يحتوي NCCR بالفعل على codonبدء الترجمة (الشكل 3). - اختيار طريقة للمحاذاة عن طريق النقر على خوارزمية في شريط الأدوات واختيار clustal W. تعيين معلمات المحاذاة لمطابقة 2؛ عقوبة تمديد الفجوة -1؛ عقوبة الفجوة -2 وانقر على موافق لتشغيل المحاذاة.
4. الانسياق العابر لخلايا HEK293T مع بلازميد المراسل والعلاج مع العوامل المضادة للفيروسات المحتملة
- لإعداد كميات كافية من الحمض النووي بلازميد لتجارب الانف المتحول اللاحقة إعداد ثقافة 150 مل بين عشية وضحاها. عزل الحمض النووي بلازميد باستخدام مجموعة العزل بلازميد. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام مجموعات تنقية بلازميد أخرى.
- البذور 1 × 105 خلايا HEK293T في DMEM تحتوي على 10٪ FCS، البنسلين والعقديات (1X) لكل بئر من لوحة 12 جيدا 24 ساعة قبل التغوط والحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للحفاظ على الانتشار النشط أثناء الانكسار.
ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا حوالي 80% مترافقة في التغوط. - ضع 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام المصل ية منخفضة في أنبوب معقم وإضافة 1 ميكروغرام من كل DNA بلازميد مراسل ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب.
- أضف 3 ميكرولتر من كاشف الانف إلى خليط الحمض النووي، واخلطها برفق عن طريق الأنابيب والحضانة لمدة 15 دقيقة.
- يُضاف المزيج إلى الآبار ويُوزّع برفق على البئر.
- بعد 4 ساعة، استبدال supernatant مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على وكلاء الاختبار والسيطرة المذيبات. حضانة في 37 درجة مئوية حتى التحليل. في هذا المثال، تم استخدام مثبطات mTOR INK128 (100 نانوغرام/مل) ورابامايسين (100 نانوغرام/مل).
5. التنظير المجهري الفلوري والقياس السيتومي للتدفق
- فحص الخلايا للفلورة الحمراء والخضراء تحت المجهر الفلوري(الشكل 4).
ملاحظة: الفلورة الحمراء والخضراء تتوافق مع التعبير الجيني BKPyV في وقت مبكر ومتأخر، على التوالي. - بعد 72 ح بعد التغوط، يستنشق supernatant وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من PBS الباردة.
- إضافة بلطف 500 درجة مئوية من التربسين وتحويل لوحة قليلا لتجنب انفصال سابق لأوانه من الخلايا. هذه الخطوة مهمة لتجنب doublets الخلية.
- بعد إضافة، إزالة التربسين مباشرة مع نفس غيض ماصة.
- حضانة الخلايا لمدة 5 دقائق على الأقل عند 37 درجة مئوية.
- إعادة تعليق الخلايا التربسية مع 1 مل من PBS تحتوي على 3٪ FCS ونقل التعليق في أنابيب FACS المسمى مسبقا.
- إضافة DAPI (1 ميكروغرام /مل) قبل تحليل FACS.
- تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق. لكل عينة، قياس ما لا يقل عن 10،000 الخلايا الحية، والتي هي سلبية لتلطيخ DAPI.
6 - تحليل البيانات
- استيراد البيانات إلى برنامج تحليل قياس التدفق وإضافة عينات عن طريق النقر والسحب إلى مساحة العمل.
- انقر نقرا مزدوجا على الملف المستورد ة وإنشاء رسم بياني رسم. اختر FSC-A مقابل SSC-A بالنقر فوق محور x و y. بوابة السكان الخلية الرئيسية عن طريق النقر على المضلع على شريط الأدوات وتأطير السكان الخلية (الشكل5). اسم مجموعة الخلايا المختارة كما هو مطلوب (على سبيل المثال "الخلايا المفردة"). ستظهر "الخلايا المفردة" كمساحة عمل جديدة.
- المضي قدما في gating "خلايا واحدة" لDAPI السلبية (أي، "الخلايا الحية"). لتحديد الخلايا الحية مقارنة السكان الخلية مع وبدون تلطيخ DAPI. في كلا المخططات اختيار FSC-A مقابل المحيط الهادئ الأزرق-A.
- انقر على المستطيل واختر مجموعة الخلايا السالبة DAPI، قم بتسمية مجموعة الخلايا المختارة "الخلايا الحية"، وإنشاء مؤامرة نقطية جديدة تظهر FITC (eGFP) مقابل PE (tdTomato) كما هو موضح من قبل.
- إضافة رباعيات في "الخلايا الحية" عن طريق اختيار رباعية من شريط الأدوات. بوابة السكان عن طريق سحب مركز الربع إلى حافة كل السكان. الأرباع تمثل 1) eGFP-tdTOM-، 2) eGFP-tdTOM +، 3) eGFP + tdTOM-، 4) eGFP + tdTOM +.
ملاحظة: نظراً للتراكب الطيفي لأطياف الانبعاثات بين شركة فيتك والمؤسسة العامة، فإن التعويض الأولي ضروري للتمييز بين الإشارات الحمراء والخضراء وتحقيق نتائج دقيقة. - تحديد متوسط كثافة الفلورة (MFIs) عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الربع واختيار إضافة إحصائيات. اختر يعني وانقر فوق موافق. يتم عرض متوسط MFI الآن تحت السكان في قسم "الإحصاءات". تتوافق الربعان 2 و4 مع التعبير المبكر، بينما يمثل الربعان 3 و4 التعبير المتأخر.
- إضافة نسخ متماثلة إضافية بنفس الطريقة للقوة الإحصائية.
- ل [دتا سفي] تفسير خطة [مفي] قيم من مبكّرة ومتأخّرة داخل قضيب خطة:
- لمقارنة أنشطة NCCR التي تم الحصول عليها من جهات مانحة مختلفة أو سلالات الفيروسات، أضف عنصر تحكم نموذجي أو سلالة دنلوب16 وحدد مؤسسات التمويل الأصغر النسبية إلى 100%، وحساب قيم MFI النسبية. كرر مع كل تكرار وتحديد المتوسط والانحراف المعياري.
- لتقييم تأثير المركبات المحتملة على النشاط النسخي، تعيين السيطرة المذيبات إلى 100٪ ورسم MFI من الخلايا المعالجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه التجربة التمثيلية، تم قياس النشاط النسخي الدافع لمنطقة التحكم غير الترميزية من BK-polyoma من خلال قياس التدفق. وبالإضافة إلى ذلك، تم اختبار مثبط mTOR، والتي يمكن استخدامها لعلاج المرضى بعد إعادة تنشيط BKPyV، لتثبيطه للتعبير الجيني الفيروسي المبكر. ولهذه الغاية، تم استخدام حد مزدوج للمراسل الفلوري كما نشرت سابقا5. يتم توضيح نظام سير العمل الكلي للإعداد التجريبي في Figure 1. أولاً، تم جمع عينات الدم من المرضى الذين زرعوا في الكلى الذين يعانون من نقص المناعة وفقاً للمبادئ التوجيهية للبحوث البشرية كما وافقت عليها لجنة الأخلاقيات المؤسسية. تم جمع الدم في أنابيب تحتوي على EDTA وتم فصل المراحل عن طريق الطرد المركزي. في وقت لاحق، تم استخدام 400 ميكرولتر من البلازما لعزل الحمض النووي فيروس الورم. تم تضخيم منطقة التحكم غير الترميز (NCCR) باستخدام بروتوكول متداخلة PCR كما هو موضح في الشكل 2A باستخدام الزوج التمهيدي الخارجي BKV-CR-1fw و BKV-CR-1rv، وكذلك، الزوج التمهيدي الداخلي BKV-CR-2fw-AgeI (التمهيدي AgeI) و BKV-CR-2rv-SpeI ( التمهيدي SpeI)17، وهذا الأخير الذي يأوي مواقع تقييد لAgeI وSpeI. تم إجراء التحقق من amplicon عن طريق الكهربائي هلام أغاروز كما هو مبين في الشكل 2B. في حين أن الأمبيرات المشتقة من تسلسلات NCCR الأثرية (wt) كان لها توزيع حجم متجانس في الجل، فإنتلك المستمدة من المراكز الوطنية لإعادة ترتيب النقاط الوطنية مع عمليات الإدراج (rrins)والحذف (rr del) تختلف في حجمها (حوالي 300-500 نقطة أساس). وتجدر الإشارة إلى أن التسلسل المرجعي16 (DUN) الذي أُدرج كتحكم، كان أكبر من التسلسل المرجعي لـ "دنلوب NCCR" (DUN)، الذي تم الحصول عليه من الفيروسات المستقوية. بما أنّ ال [أمبليكونس] يماثل إلى ال يتوقّع حجوم, ال ينقيّ [بّر] منتوجات كان أرسلت ل [سنجر] تسلسل لمقارنة متأخّرة مع التسلسل يستنسخ داخل المراسل [بلازميد] لتحليل بعيدة.
لاستنساخ amplicons، تم إجراء الهضم باستخدام اثنين من الإنزيمات تقييد AgeI وSpeI. بعد الاستنساخ في مراسل الفلورة المزدوجة، الذي تم تنفيذه باستخدام إجراء الاستنساخ القياسية، تم التحقق من اختيار استنساخ إيجابية تحتوي على NCCR من قبل AgeI وSpeI الهضم (الشكل2C). وهنا، استعيض عن منطقة الحيز الصغير (NC، 128 bp) بشظايا NCCR الأكبر (حوالي 300-500 نقطة أساس) تشير إلى استنساخ إيجابي. تم إرسال الحمض النووي البلازميد المعزول من الحيوانات المستنسخة التي تم التحقق منها لتسلسل Sanger ومقارنتها مع التسلسلات التي تم الحصول عليها من تسلسل amplicon (لم يظهر). تم اختيار فقط الحيوانات المستنسخة التي تطابق تسلسل amplicon لمزيد من المعالجة. وكما هو موضح في الشكل3، تمت مقارنة نتائج التسلسل بتسلسل NCCR نموذجي (JN192438). في هذا المثال، تم الكشف عن حذف في كتلة P واستبدال في كتلة O.
لاختبار النشاط النسخي لتسلسلNCCR المستنسخة في ثقافة الخلايا، تم نقل خلايا HEK293T بشكل عابر مع بنيات المراسل المعنية (الشكل4A). كما هو متصور في الشكل 4B، تم رصد كفاءة الانعتراب ونشاط NCCR عن طريق الفحص المجهري الفلوري. الأحمر والأخضر الفلورة تتوافق مع التعبير الجيني BKPyV في وقت مبكر ومتأخر، على التوالي5. وأعربت الخلايا عن كل من الفلوروفور تشير إلى كفاءة النشاط الحركي المبكر والمتأخر. وكما يتضح من المثالين، أظهر أول NCCR (NCCR1) تعبيراً جينياً متأخراً قوياً، في حين كان للمثال الثاني (NCCR2) تعبير جيني متأخر قوي نسبياً في وقت مبكر ولكنه معتدل (الشكل4B). وهكذا، أعدت عينات لقياس قياس التدفق. كما هو موضح في القسم 6 من البروتوكول، تم ترتيب بوابات الخلايا السالبة DAPI (الشكل5A،اللوحة السفلى) وتم إنشاء مؤامرة نقطة تظهر eGFP مقابل tdTomato. تم تضمين العينات التي كانت سلبية (الشكل5B)،وكذلك تلك الإيجابية لtdTomato (الشكل5C)أو eGFP (الشكل5D)فقط، في التحليل. ملاحظة، تم إجراء التعويض الأولي، وهو أمر ضروري للتمييز بين الإشارات الحمراء والخضراء وتحقيق نتائج دقيقة18. تم اشتقاق كثافة الفلورة المتوسطة من كل استنساخ اختبار. هنا، تتوافق الخلايا الإيجابية tdTomato مع التعبير المبكر في حين تمثل الخلايا الإيجابية eGFP التعبير في وقت متأخر. في هذا المثال العلاج مع مثبطات mTOR المزدوجة INK128 خفضت بشكل كبير tdTomato MFI (الشكل 5E-F)، مما يعني أن التعبير المبكر كان يمنع.
الشكل 1 نظام سير العمل للإعداد التجريبي. 1) جمع عينات الدم (البول بدلا من ذلك)، 2) عزل DNA فيروس الورم البولي 3) تضخيم منطقة التحكم غير الترميز (NCCR) باستخدام بروتوكول متداخلة PCR، 4) الأوغاروس جل الكهربائي وamplicon التحقق، 5) تسلسل السنجر من amplicon PCR، 6) استنساخ NCCR في مراسل الفلورة المزدوجة باستخدام AgeI وSpeI، 7) اختيار استنساخ إيجابية، 8) تسلسل السنجر من الحمض النووي بلازميد، 9) نقل عابر لخلايا HEK293T مع بلازميد المراسل وإضافة مركبات ليتم اختبارها، 10) مجهرية الفلورية للتحقق من كفاءة التغوط، 11) تحليل قياس التدفق، 12) التجء و تحليل التعبير tdTomato eGFP، 13) تفسير البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : يعشش PCR والتحليل التمثيلي للمريض المستمدة NCCR-amplicons. أ) تعرض الحمض النووي المستمد من المرضى الذين زرعوا في الكلى الذين يعانون من نقص المناعة لتضخيم PCR شبه متداخل باستخدام التمهيديات oligonucleotide المرتبطة بمواقع تقييد AgeI وSpeI. يتم الإشارة إلى أسماء التمهيدي وطول (أزواج قاعدة) من O، P، Q، R، وS-كتل من سلالة BKPyV JN192438 بين قوسين. ب) تم تحليل Amplicons بواسطة الكهربائي في هلام أغاروز 1.5٪ وتصور باستخدام تلطيخ الحمض النووي. M1 = 100 bp سلم، الوزن = النمط البري (archetypical)، rr = إعادة ترتيب، ins = الإدراج، ديل = الحذف، DUN = سلالة دنلوب. ج) هضم البلازميد مع AgeI وSpeI. تم تحليل الشظايا المهضومة بواسطة الكهربائي في 1.5٪ هلام أغاروز وتصور باستخدام تلطيخ الحمض النووي. M1 = 100 سلم بغ، M2 = 2-سجل سلم. NC = التحكم السالب (فاصل). + = استنساخ إيجابية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : استنساخ والتحقق من NCCR في مراسل الفلورة المزدوجة. النتائج التمثيلية لتسلسل البلازميد. تم تنقية Amplicons باستخدام مجموعة تنقية PCR وتعرض لتسلسل Sanger. تمت محاذاة التسلسلات المعنية إلى تسلسل NCCR المستمدة من سلالة BKPyV الأثرية JN192438. يتم وضع علامة باللون الأحمر على عمليات الحذف والاستبدال. يتم الإشارة إلى مواقع تقييد AgeI وSpeI، وبداية الترجمة لإطار القراءة المفتوح eGFP (المطبوعة بالخط العريض) وكذلك كتل NCCR O-S. يتم تمييز الكتل ذات الصلة ومواقع التقييد بالألوان. تتم طباعة طول كل كتلة NCCR في أزواج أساسية بين أقواس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 تحليل المجهرية الفلورية التمثيلية لنشاط المروج في وقت مبكر ومتأخر من NCCR. أ) خريطة جينية لمراسل الفلورة المزدوجة تحت سيطرة المروج ثنائي الاتجاه. كما هو موضح سابقا5 pTA-tdTOM-NCCR-eGFP (6,009 bp) يأوي إشارة SV40 في وقت متأخر polyadenylation المصب من كل كاسيت التعبير لضمان معالجة قابلة للمقارنة وفعالة من كل من النصوص لtdTomato (في وقت مبكر التعبير) وeGFP (التعبير في وقت متأخر)، على التوالي. يحيط بالمجلس الوطني للأمراض من قبل AgeI وSpeI. يحتوي الناقل على كاسيت مقاومة أمبيسيلين للاختيار أثناء إجراء الاستنساخ. ب) تم نقل خلايا HEK293T مع مراسل مزدوج الفلورة يبني كل تحت سيطرة تسلسل NCCR المستمدة من المريض (NCCR1-2). خضعت الخلايا لتحليل الفحص المجهري لحقل مشرق وفلورة 72 ساعة بعد الإنعتراب. واستخدمت إعدادات تصفية المجهر في نطاقات الإثارة التالية: الأخضر لtdTomato (515-560 نانومتر) والأزرق لeGFP (450-490 نانومتر). يشار إلى شريط المقياس (200 درجة مئوية) في أسفل يمين كل تصوير فوتوغرافي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 تحليل ممثل FACS. يظهر هو استراتيجية التغرير بسيطة المطلوبة لهذا الأسلوب. يتم استخدام كثافة اثنين من المعلمات أو نقطة المؤامرات. أ) أولا، يتم رسم FSC ضد المحيط الهادئ الأزرق، في حين يتم معالجة فقط DAPI السلبية (أي الخلايا الحية) مزيد من المعالجة. باء - واو) يتم رسم FITC (eGFP) مقابل PE (tdTomato). C-D) إضافة حصرا الأخضر والأحمر خلايا الفلورسنت لضبط التعويض على تدفق مقياس الخلايا. E-F) في هذا المثال، مثبطات mTOR INK128 ويقلل بشكل كبير من MFI tdTomato، الذي يتوافق مع انخفاض التعبير الجيني BKPyV في وقت مبكر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم التمهيدي | تسلسل (5' → 3') |
| BK-CR-fwd1 | في هذا الـ401 |
| BK-CR-rev1 | CCTCTAACAAATTCAAAAGC |
| BKV-CR-2-fw-AgeI | AAAAAAACCGGTTTTTGCAAAAATTGCAAAAGAATAGG |
| BKV-CR-2-rv-SpeI | TTTTACTAGTCTGGCGAACCATGCCTT |
| EGFP-N | CGTCGCCGTGCTCGACCAG |
الجدول 1: Oligonucleotides المستخدمة في هذا البروتوكول. تشير القواعد المسطرة إلى مواقع إنزيمات التقييد لAgeI وSpeI، على التوالي.
| مكون | حجم / رد فعل (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| مياه خالية من RNase | 32.8 ميكرولتر | - |
| 10x PCR العازلة | 5 ميكرولتر | 1x |
| dNTPs (10 mM لكل منها) | 1 ميكرولتر | 0.2 مليون متر من كل dNTP |
| Fwd-التمهيدي (10 درجة مئوية) | 3 ميكرولتر | 0.3 ميكرومتر |
| Rev-التمهيدي (10 درجة مئوية) | 3 ميكرولتر | 0.3 ميكرومتر |
| طاقة للبوليميراز | 0.2 ميكرولتر | 2 وحدة / رد فعل |
| قالب الحمض النووي | 5 ميكرولتر | <0.5 ميكروغرام/50 درجة مئوية رد فعل |
الجدول 2: بروتوكول إعداد المزيج الرئيسي. وتنطبق هذه التعليمات على كل من ردود الفعل السابقة والمتداخلة لتفاعل الـ PCR على النحو المبين في الخطوتين 2-2 و2-7 على التوالي.
| درجه الحراره | مده | PCR-الخطوة | دورات |
| 95 درجة مئوية | 5 دقائق | التناطور الأولي | |
| 95 درجة مئوية | 30 ثانية | التناطور | |
| 55 درجة مئوية | 34 ثانية | الصلب | x35 |
| 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | ملحق | |
| 72 درجة مئوية | 10 دقائق | التمديد النهائي | |
| 4 درجة مئوية | ∞ | التبريد |
الجدول 3: برنامج PCR المستخدم لتضخيم NCCR. تنطبق التعليمات على كل من ردود الفعل قبل ومتداخلة PCR.
| كاشف | حجم / رد فعل (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| DNase خالية H20 | 6 | إلى 20 ميكرولتر |
| 10x المخزن المؤقت | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 وحدات |
| SpeI | 1 | 10 وحدات |
| تنقية PCR-أمبليكون | 10 سنوات | متغير |
الجدول 4: بروتوكول هضم أمبليكون. تنطبق التعليمات على الهضم المتزامن للحمض النووي amplicon مع اثنين من الإنزيمات المقيدة الموصوفة في الخطوة 3.1.
| كاشف | حجم / رد فعل (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| DNase خالية H20 | 14.5 | إلى 20 ميكرولتر |
| 10x المخزن المؤقت | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 وحدات |
| SpeI | 1 | 10 وحدات |
| العمود الفقري بلازميد (1 ميكروغرام / ميكرولتر) | 1.5 | 1.5 ميكروغرام |
الجدول 5: بروتوكول هضم البلازميد. تنطبق التعليمات على الهضم المتزامن للعمود الفقري للحمض النووي البلازميد مع اثنين من الإنزيمات المقيدة الموضحة في الخطوة 3.3.
| كاشف | حجم / رد فعل (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| DNase خالية H20 | 7 | إلى 20 ميكرولتر |
| T4 الحمض النووي ligase | 1 | 20 |
| 10X T4 الحمض النووي الرباط العازلة | 2 | 1x |
| العمود الفقري البلازميد النقي انخفاض ذوبان المخفف ة من الخطوة 3.5 |
2 | متغير |
| مهضومة ونقية PCR-amplicon من الخطوة 2.7 | 8 | متغير |
الجدول 6: بروتوكول ربط البلازميد. وتنطبق التعليمات على ربط العمود الفقري للحمض النووي البلازميد مع الحمض النووي AMPlicon PCR المهضوم ة الموصوفة في الخطوة 3-7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، يتم عرض طريقة شائعة الاستخدام تسمح بتحليل منطقة التحكم غير الترميز BKPyV (NCCR) مدفوعة نشاط المروج المبكر والمتأخر. يمكن قياس نشاط NCCR في وقت واحد ولا يحتاج إلى lysis من الخلايا المنقولة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل عدد كبير نسبيا من الخلايا والمشاركة في نقل علامات إضافية لتطبيع قيم الفلورة ليست ضرورية.
جزء حرجة من هذا طريقة أنّ ال يستنسخ [نكر] سوفت احتويت تماما ال نفسه تسلسل بما أنّ يعيّن بال [أمبليسون] تسلسل, أيّ يماثل إلى الأغلبية [فرينت] حاضرة في المريضة بلازما. لتحقيق نتائج دقيقة وتقليل الأخطاء المعرضة للPCR ينصح بشدة لاستخدام البوليمرمع نشاط القراءة البرهانية. وبدلاً من ذلك، يمكن طلب التسلسل اتّباعاً لخدمات توليف الجينات التجارية. ويمكن طلب تسلسلات NCCR المعينة بما في ذلك مواقع تقييد AgeI وSpeI المحيطة للاستنساخ المباشر. في هذه الحالة، هضم بلازميد موازية للبلازميد العمود الفقري واستبدال إدراج فاصل مع جزء NCCR المقابلة من بناء توليفها. يمكن عزل الحمض النووي بدلاً من ذلك من عينات البول. ومع ذلك، بما أن BKPyV يفرز أيضا في البول من قبل الأفراد ذوي الكفاءة المناعية ولا تعكس بالضرورة النسخ المتماثل النشط، والأهمية السريرية محدودة. من الناحية المثالية، يمكن أيضا أن تكون معزولة الحمض النووي من الخزعات الكلوية التي سابقا PVAN يمكن الكشف عن النسيج (مقارنة مع Korth وآخرون، 201919).
من خلال قياس متوسط شدة الفلورة من الخلايا الفلورية الخضراء والحمراء، تسمح هذه الطريقة لتحديد كمية الفلورة المشتقة من NCCR / النشاط دون تحيز كفاءة الانعتراب والآثار المضادة للانتشار من العوامل المختبرة (على سبيل المثال، mTOR المزدوج مثبطات INK128 أو PP242)5.
تطبيق آخر لنظام المراسل هو إمكانية تحليل عواقب الإدراج، والحذف، أو الازدواجية في NCCR وجدت في العزلات السريرية على النشاط promotor في وقت مبكر ومتأخر. في دراسات سابقة, وقد درست العوامل المثبطة للمناعة لتعديل نشاط NCCR; ومع ذلك، لم يتم العثور على أي طفرات أو إعادة ترتيب NCCR التي تؤثر على قابلية. ومع ذلك، قد تؤثر الطفرات على استجابة المواد الجديدة التي قد تتم الموافقة عليها في المستقبل القريب.
هذا يمكن كنت موافقة بما أنّ خلافا ال [كدينغ] مناطق كبيرة [ت] مستضد أو [فب1] [كبيد] بروتين, ال [نكر] بما أنّ الاسم يتضمّن يمثّل [نونكدينغ] منطقة ولذلك لا يسدّ ضغطة انتقائيّة في ال [أمينو سد] مستوى.
في هذا البروتوكول، يتم التحقق من اختيار الحيوانات المستنسخة الإيجابية التي تحتوي على NCCR من قبل AgeI وSpeI الهضم. ومع ذلك، قد يمثل PCR مستعمرة نهجا بديلا لفحص بسرعة لإدراج NCCR مباشرة من E. القولونية مطلي على لوحات أجار. لهذا النهج، استخدم زوج التمهيدي BKV-CR-2-fw-AgeIوEGFP-N (الجدول 1). بعد الانعطاف، يتم فحص الخلايا للحصول على الفلورة الحمراءوالخضراء باستخدام مجهري الفلورية (الشكل 4). بدلا من ذلك، يمكن إصلاح الخلايا باستخدام 3٪ PFA لمدة 20 دقيقة عند 22 درجة مئوية. في هذه الحالة، يغسل مع PBS، إضافة 0.2٪ المنظفات غير الأيونية في PBS وحضانة لمدة 10 دقيقة. الخلايا الثابتة ثم يمكن أن تكون ملطخة DAPI في PBS (1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقائق في 22 درجة مئوية وتخضع لتحليل المجهريالفلورية وتصور مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (340-380 نانومتر).
وبما أن كلا ً من الفلوروفورس يأوي نفس إشارات تعدد الإنكار، يمكن استبعاد تأثير كفاءة تعدد الإنكار. ومع ذلك، بالمقارنة مع eGFP، tdTomato هو بروتين dimeric التي يجب أن يتم تدوينها في المقابل إلى mRNA أطول (تسلسل الترميز: 745 مقابل 1431 نقطة أساس، على التوالي). ومع ذلك، بما أن نشاط المروجين من الخلايا المعالجة بالمواد المسببة للتداخل تتم مقارنتها دائمًا بالنسبة للخلايا غير المعالجة (DMSO)، فإن هذا الاختلاف لا يلعب دورًا يذكر. بسبب وجود أصل النسخ المتماثل، وtransfection من بلازميد مراسل في الخلايا التي تعبر عن مستضد T كبير SV40PyV يسمح بنقل بلازميدات إلى خلايا ابنة. وقد تبين أن مستضد T كبيرة مشتقة SV40 و BKPyV NCCR وتكرار الحمض النووي الفيروسي20. ومع ذلك، منذ مستضد T كبيرة تشارك أيضا في الانتقال من مرحلة مبكرة إلى مرحلة متأخرة من العدوى، يتم إعطاء حالة اصطناعية. باستخدام هذا الاختبار، يجب أن يعتبر أن الخطوة الحد من النسخ المتماثل الأكثر هو التعبير المبكر يؤدي إلى التعبير عن مستضد T كبير. من أجل تعيين دورة النسخ المتماثل الكامل يجب قياس mRNAs في وقت مبكر ومتأخر في الخلايا المصابة عن طريق qRT-PCR كما هو موضح في مكان آخر5،12.
وقد استخدمت بالفعل طريقة مماثلة من قبل المجموعات السويسرية والألمانية لتحليل الأنشطة المضادة للمحركات المستمدة من BKPyV NCCR وإعادة ترتيبها، وإن كان مع أنظمة ناقلات مستنسخة بشكل مستقل5،9. غوسرت وزملاؤه من بازل استخدموا طريقة مماثلة لتحديد نشاط المروج NCCR منسلالات BKPyV و JCPyV 9،10،11. كلا الأسلوبين المستخدمة eGFP للفلورة الخضراء; ومع ذلك، استخدمت مجموعة بازل RFP بينما في البروتوكول الحالي tdTomato تم استخدامها للفلورة الحمراء. ميزة tdTomato على RFP هو عدم الاستقرار الضوئي أعلى بكثير. ومع ذلك، يتم ترميز البروتين dimeric بواسطة تسلسل الذي هو ضعف ما يصل RFP21. وعلاوة على ذلك، فإن نصف عمر البروتينات قد تكون مختلفة، مما يؤدي إلى تركيز غير متكافئ 72 ساعة بعد التغوط. ومع ذلك، قد تكون هذه المسألة ذات صلة فقط عند المقارنة المباشرة بين كثافة الفلورة. استخدم Gosert وآخرون BamHI وNotI كمواقع تقييد بينما في البروتوكول الحالي AgeI وSpeI يحيطان بتسلسل NCCR. باستخدام كلا الأسلوبين، وسلالة DUNLOP المرجعية16 أسفرت عن أنماط الفلورة مماثلة مع قوية في وقت مبكر ولكن ضعيفة نشاط المروج في وقت متأخر9،10. وفي اتفاق آخر، أسفرت عمليات إعادة ترتيب اللجنة الوطنية للاستجابة في المناطق إلى زيادة كبيرة فينشاط المروجين في وقت مبكر ومتأخر بالمقارنة مع اللجنة الوطنية للاستجابة في المناطق 5 و9.
على الرغم من أنه قد ثبت أن مستضد T T المشتقة SV40 و BKPyV المستمدة NCCRs20، قد يكون من المثير للاهتمام لاستخدام الخلايا البشرية التي تعبر عن مستضد T كبيرة من BKPyV وليس النموذج الأولي للفيروس SV40 في الدراسات المستقبلية . ومع ذلك، في هذه الحالة خط الخلية يجب أن يكون من السهل أن transfect (على سبيل المثال، HEK293).
وبما أن المروجين للفيروسات الورمية NCCR متشابهة جداً، يمكن أيضاً استخدام هذه الطريقة (مع تكيف صغير في التسلسلات التمهيدية) للتحقيق في نشاط المروج وتأثير العوامل المضادة للفيروسات القوية على نشاط فيروس الورم متعدد الأورام JC (JCPyV) مناطق التحكم غير الترميز المشتقة11. منذ JCPyV هو العامل المسبب لاعتلال الدماغ متعدد البؤر التدريجي (PML)، وهو مرض نادر في الجهاز العصبي المركزي الذي نادرا ما يمكن أن يحدث في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة مما أدى إلى الأمراض العصبية الشديدة، وهناك أيضا حاجة ملحة للعثور على المواد المضادة للفيروسات مباشرة بالنيابة لعلاج المرضى الذين يعانون من ضعف المناعة. ومن المثير للاهتمام، كما توجد إعادة الترتيب في JC NCCRs11. منذ JCPyV قد وضوحا neurotropism وبالتالي يتم العثور على كميات كبيرة من الفيروسات في الخمور، واقتناء عينة يجب أن تعدل إلى الحمض النووي المستمدة من الخمور. ومع ذلك، يمكن تكييف الخطوات اللاحقة بسهولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد تلقى يوهانس كوث منحا ً لأتعاب المتحدثين ونفقات سفرهم من أستيلاس ونوفارتي. حصلت ماريك وريدا على رسوم استشارية من نوفارتي. تلقى أوليفر فيتزكي منحاً للدراسات السريرية، ورسوم المتحدث، والأتعاب، ونفقات السفر من أمجين، أليكسيون، أستيلاس، باسيليا، بيوتيست، بريستول مايرز-سكويب، كوريفيو، كيسي، جيلاد، هيكسال، يانسن، الدكتور ف. كوهلر كيمي، MSD، نوفارتوس، روش، فايزر، سانوفي وتيفا.
Acknowledgments
ويشكر أصحاب البلاغ باربرا بليكمان على مساعدتها التقنية الممتازة. وقد تم دعم هذه الدراسات من قبل برنامج IFORES التابع لجامعة دويسبورغ- إيسن وكلية الطب في جامعة دويسبورغ- إيسن وبرنامج RIMUR التابع لتحالف جامعة روهر ومركز أبحاث ميركاتور رور (MERCUR). ويشكر المؤلفون يورغن - مانشوت - ستيفتونغ على زمالة الدكتوراه التي حصلت عليها هيلين سيرتزنغ وعلى الدعم المستمر. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة دويسبورغ-إيسن (14-6028-BO) على جمع واستخدام مواد المرضى.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
