Summary
En este manuscrito, se presenta un protocolo para realizar la medición basada en FACS de la actividad transcripcional BK-polioomavirus mediante el uso de células HEK293T transcritas con un plásmido reportero bidireccional que expresa tdTomato y eGFP. Este método permite además determinar cuantitativamente la influencia de nuevos compuestos en la transcripción viral.
Abstract
Los poliomavirus, como el BK-poliomavirus (BKPyV), pueden causar patologías graves en pacientes inmunocomprometidos. Sin embargo, dado que actualmente no se dispone de antivirales altamente eficaces, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales. Aquí, se construyó un reportero de doble fluorescencia que permite el análisis de la región de control no codificante BKPyV (NCCR) impulsada por la actividad promotora temprana y tardía para cuantificar el impacto de los posibles medicamentos antivirales en la expresión génica viral a través de tdTomato y eGFP Expresión. Además, mediante la clonación de los amplicones BKPyV-NCCR que en este protocolo se han obtenido ejemplarmente del ADN derivado de la sangre de pacientes trasplantados renales inmunocomprometidos, se puede determinar el impacto de los reordenamientos del NCCR en la expresión génica viral. Tras la clonación de los amplicons derivados del paciente, las células HEK293T fueron transinfectadas con los plásmidos del reportero y tratadas con posibles agentes antivirales. Posteriormente, las células fueron sometidas a análisis FACS para medir intensidades medias de fluorescencia 72 h después de la transfección. Para probar también el análisis de fármacos que tienen un potencial efecto inhibidor del ciclo celular, sólo se utilizan células transinfectadas y por lo tanto fluorescentes. Dado que este ensayo se realiza en células grandes que expresan el antígeno T, el impacto de la expresión temprana y tardía se puede analizar de una manera mutuamente independiente.
Introduction
Los poliomavirus representan una familia independiente de pequeños virus de ADN de doble cadena (ADN DSDNA) con el virus Simian 40 (SV40) como especie prototipo. La infección primaria ocurre principalmente durante la infancia, que generalmente procede nacones sin síntomas de la enfermedad y generalmente causan infecciones latentes en huéspedes inmunes competentes. El BK-polioomavirus (BKPyV) persiste principalmente en las células de los túbulos renales sin causar nefropatías, sin embargo, en caso de deterioro de la competencia inmunitaria después del trasplante renal, el virus puede reactivarse y causar daños graves e insuficiencia del injerto función al alcanzar una viremia alta (1 x 104 copias de ADN BKPyV/ml)1,2. En aproximadamente el 10% de los receptores de trasplante de riñón, la reactivación del BK-poliomavirus (BKPyV) da como resultado una nefropatía asociada al poliomavirus (PyVAN), que se asoció hasta un 80% con un alto riesgo de fallos de aloinjerto renal3,4 . Dado que no se dispone de agentes antivirales aprobados, el tratamiento actual se basa en la reducción de la inmunosupresión. Curiosamente, inhibidores de mTOR parecen tener un efecto antiviral; por lo tanto, cambiar la terapia inmunosupresora a la inmunosupresión basada en mTOR podría representar un enfoque alternativo para prevenir la progresión de la viremia BKPyV5,6,7. Sin embargo, el mecanismo antiviral basado en mTOR todavía se entiende incompletamente. Por lo tanto, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales en concentraciones clínicamente relevantes.
El genoma circular del BKPyV consiste en aproximadamente 5 kb que albergan una región de control no codificante (NCCR) que sirve como origen de la replicación y concomitantemente un promotor bidireccional que impulsa la expresión de transcripciones de ARNm de fase temprana y tardía. Dado que los reordenamientos, deleciones y duplicaciones del NCCR de origen espontáneo se encuentran en el BKPyV8 patógeno y se acumulan significativamente en pacientes que sufren de PVAN 5,9, una comparación de arquetípicos (wt) y re-arreglado (rr) Las actividades del NCCR son útiles para caracterizar la aptitud replicativa viral.
Como se resume en la Figura 1, este protocolo describe un método comúnmente utilizado para medir la actividad transcripcional BKPyV NCCR cuantificando la fluorescencia de dos fluoróforos tdTomato y eGFP expresadas a partir de un reportero plásmido5, 9,10,11. El procedimiento se realiza en presencia del antígeno T grande SV40 (lTAg), que permite analizar el impacto de los posibles agentes antivirales en la actividad temprana y tardía del NCCR por separado5. Este ensayo analiza más a fondo el impacto de los reordenamientos en la actividad del NCCR y la comparación con los WT-NCCRs5,9. El plásmido reportero alberga la señal de poliadenilación tardía SV40 aguas abajo de cada marco de lectura abierto de fluoróforo para asegurar un procesamiento comparable y eficiente de ambas transcripciones para tdTomato y eGFP, respectivamente. En comparación con los métodos basados en qRT-PCR5,12, este enfoque basado en FACS representa una alternativa compatible de bajo costo y alto rendimiento, ya que no hay protocolos de extracción complicados para el cultivo celular infectado y no costoso se necesitan anticuerpos para la tinción de fluorescencia inmune. Además, dado que una cantidad definida de células fluorescentes se analizan a través de la citometría de flujo, el análisis de los agentes inhibidores del ciclo celular también es posible de manera cuantitativa.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices de la investigación humana aprobadas por el comité ético de la facultad de medicina de la Universidad de Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. Recolección de muestras de sangre u orina y aislamiento del ADN del poliomavirus
- Recoger al menos 3 ml de sangre en tubos EDTA u orina en tubos de adquisición.
- Centrifugar la muestra a 2.500 x g durante 15 min. Si es necesario, pipetee el plasma en un tubo nuevo y almacene las muestras de plasma a 4 oC durante varios días o congele a -20 oC para un almacenamiento más largo.
- Preparar 40 ml de proteinasa K en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 400 ml de plasma mediante pipeteo.
- Lijar la muestra añadiendo 400 s l de tampón de lisis, vórtice durante 15 s e incubar durante 10 min a 56 oC.
- Aísle el ADN utilizando un kit de extracción de sangre de ADN como se describe en las instrucciones del fabricante. Brevemente, agregue alcohol y cargue los lysates en una columna de espín que contenga una membrana a base de sílice de unión al ADN. Lave las columnas varias veces para producir ADN puro.
- Eluye el ADN producido en 30-50 l de tampón te.
2. Amplificación de la región de control no codificante (NCCR)
- Realice el siguiente procedimiento en salas separadas físicamente. Utilice una sala aislada para preparar los reactivos y distribuir la mezcla a los tubos PCR.
- Prepare la mezcla maestra para el pre-PCR utilizando el par de imprimación A (Tabla 1) en un volumen total de 50 l y utilice el ADN previamente aislado del paso 1.6. El esquema de pipeteo para preparar la mezcla maestra para el PCR pre y anidado se imprime en el Cuadro2.
- Distribuya 45 s de la mezcla maestra en los tubos PCR.
- Añadir 5 l de ADN aislado en los tubos de PCR.
NOTA: Utilice otra habitación distinta a la de la preparación de la mezcla maestra para evitar la contaminación. - Ejecute el PCR con las condiciones de reacción como se ilustra en el Cuadro3. Repetir la desnaturalización, recocido y extensión en 35 ciclos.
- Para la amplificación anidada utilice el par de imprimación B que alberga los sitios de restricción para AgeI y SpeI (Tabla1).
- Ejecute el PCR anidado con las condiciones de reacción como se describe en los pasos 2.2 a 2.5 utilizando 5 l de la pre-PCR.
- Mezclar 10 l del producto PCR con 2 ml de tinte de carga de gel 6x. Cargue 10 ml de la mezcla en un gel de agarosa del 1,5% y ejecute el gel durante 30 min a 60 mA.
- Visualice el gel utilizando un sistema de documentación UV adecuado.
NOTA: Se espera que el tamaño del amplificador esté entre 300-500 bp dependiendo de si se produjeron reorganizaciones (eliminaciones, inserciones o duplicaciones) (Figura2C). - Purificar los amplicons PCR utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Elule los amplicons PCR en 30 l de búfer de elución.
- Envíe los amplicons para la secuenciación de Sanger utilizando el par de imprimación B.
3. Clonación del NCCR en el reportero de doble fluorescencia
- Digerir los amplicons purificados (paso 2.10) con AgeI y SpeI durante 2 h a 37oC, tal como se describe en la Tabla4.
- Repita el paso 2.10 y purifique los amplicons digeridos.
- Paralelamente, también digiere la columna vertebral del plásmido (1,5 g) con AgeI y SpeI durante 2 h a 37oC, tal como se describe en la Tabla5. Este paso solo debe realizarse una vez. Para reacciones posteriores, congele la digestión a -20 oC.
- Analizar la columna vertebral del plásmido digerido en un gel de agarosa baja de fusión de 0.8%.
NOTA: No ejecute el gel con una corriente superior a 40 mA. La plaquita esperada de la región espaciadora originalmente derivada del plásmido pEX-K4 2-LTR CD313 es de 128 bp (Figura2C). - Visualice fragmentos de ADN utilizando luz UV de onda larga (320 nm) y corte la banda troncal usando un bisturí limpio. Transfiera el fragmento de gel de fusión baja a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Evite largos tiempos de exposición a los rayos UV para evitar daños en el ADN.
NOTA: Dado que se utiliza agarosa de fusión baja, no es necesario purificar el ADN antes de la ligadura. - Calentar la columna vertebral que contiene la pieza de agarosa de fusión baja durante 10 minutos a 65 oC para derretir la pieza de gel y mezclar cada 2 minutos mediante un suave vórtice. El gel fundido se puede utilizar directamente para la ligadura.
- Ligar la columna vertebral y el amplicon digerido utilizando ligasa de ADN T4 durante la noche a 16 oC utilizando el esquema que se muestra en la Tabla 6.
- Realizar la transformación en E. coli utilizando el método de choque térmico, bacterias de placas en placas de amplificador de LB, y el cultivo a 37 oC durante la noche.
- Al día siguiente, seleccione tres clones positivos y prepare cultivos de E. coli durante la noche (5 ml de LB-Amp) y cultivo a 37 oC.
- Aislar el plásmido-ADN utilizando protocolos estándar como se describe en otros lugares14,realizar la digestión AgeI y SpeI para comprobar si hay clones positivos y visualizar fragmentos cortados en un gel de agarosa del 1%. La banda espaciadora (128 bp) será reemplazada por la secuencia NCCR más grande (300-500 bp, véase arriba).
- Envíe el plásmido para la secuenciación de Sanger utilizando imprimación EGFP-N o par de imprimación B (Tabla 1).
- Dado que las mutaciones pueden ocurrir espontáneamente, compare los resultados de la secuenciación con los resultados de secuenciación obtenidos con el amplicon. Utilice únicamente los clones que contengan secuencias idénticas en comparación con el amplificador.
- Utilice un software de banco de trabajo molecular (por ejemplo, freeware GENtle 1.9.4 u otros programas de edición de secuencias) para alinear y editar las secuencias obtenidas (Figura3).
- Inicie GENtle 1.9.4 e importe las secuencias de ADN haciendo clic en el botón Importar (flecha verde hacia abajo).
- A continuación, haga clic en Herramienta y seleccione Alineación en el menú (Usar Ctrl+G como acceso directo) y elija las secuencias de ADN para la alineación.
- Agregue una secuencia a la alineación haciendo clic en Agregar o quitar una secuencia haciendo clic en Eliminar. Incluir una secuencia de consenso arquetípica NCCR como JN19243815, no utilice la secuencia NCCR de la Comúnmente utilizada Dunlop-strain16, ya que alberga reordenamientos y duplicaciones otros que el arquetípico BKPyV Cepas.
NOTA: El NCCR ya contiene el codón de inicio traslacional (Figura3). - Elija un método para la alineación haciendo clic en Algoritmo en la barra de herramientas y elija clustal W. Establezca los parámetros de alineación para que coincidan con 2; penalización de extensión de brecha -1; penalización de brecha -2 y haga clic en Aceptar para ejecutar la alineación.
4. Transfectar transitoriamente las células HEK293T con el plásmido reportero y el tratamiento con posibles agentes antivirales
- Para preparar cantidades suficientes de ADN plásmido para experimentos de transfección posteriores preparar un cultivo nocturno de 150 ml. Aísle el ADN plásmido utilizando un kit de aislamiento plásmido. Alternativamente, se pueden utilizar otros kits de purificación de plásmidos.
- Semilla 1 x 105 HEK293T células en DMEM que contienen 10% FCS, penicilina y estreptomicina (1x) por pozo de una placa de 12 pocillos 24 h antes de la transfección e incubar durante la noche a 37 oC y 5% CO2 para mantener la proliferación activa durante la transfección.
NOTA: Las células deben ser aproximadamente un 80% de confluente en la transfección. - Coloque 250 ml de medios séricos reducidos en un tubo estéril y agregue 1 g de ADN de plásmido de cada reportero y mezcle suavemente pipeteando.
- Añadir 3 l del reactivo de transfección a la mezcla de ADN, mezclar suavemente pipeteando e incubar durante 15 min. Precaliente el reactivo de transfección a la temperatura ambiente de 22 oC y vórtice suavemente antes de usarlo.
- Agregue la mezcla en cuanto a los pozos y distribuya suavemente al pozo.
- Después de 4 h, reemplace el sobrenadante por un medio fresco que contenga los agentes de ensayo y el control del disolvente. Incubar a 37oC hasta su análisis. En este ejemplo, se utilizaron los inhibidores mTOR INK128 (100 ng/ml) y rapamicina (100 ng/ml).
5. Microscopía de fluorescencia y citometría de flujo
- Compruebe las células para la fluorescencia roja y verde bajo el microscopio de fluorescencia (Figura 4).
NOTA: La fluorescencia roja y verde corresponde a la expresión génica BKPyV temprana y tardía, respectivamente. - Después de 72 h después de la transfección, aspirar el sobrenadante y lavar las células dos veces con 1 mL de PBS frío.
- Agregue suavemente 500 s de trippsina y gire ligeramente la placa para evitar el desprendimiento prematuro de las células. Este paso es importante para evitar los dobletes celulares.
- Después de la adición, retire la trippsina directamente con la misma punta de pipeta.
- Incubar las células durante al menos 5 min a 37 oC.
- Resuspenda las células trippsinizadas con 1 ml de PBS que contengan 3% de FCS y transfiera la suspensión en tubos FACS preetiquetados.
- Agregue DAPI (1 g/ml) antes del análisis FACS.
- Analice las celdas utilizando un catómetro de flujo. Para cada muestra, mida al menos 10.000 células vivas, que son negativas para la tinción de DAPI.
6. Análisis de datos
- Importe los datos al software de análisis de citometría de flujo y agregue muestras haciendo clic y arrastrar al espacio de trabajo.
- Haga doble clic en el archivo importado y cree un gráfico. Elija FSC-A frente a SSC-A haciendo clic en el eje X e Y. Atraviese la población de células principales haciendo clic en Polígono en la barra de herramientas y enmarcando la población celular (Figura5). Asigne un nombre a la población de celdas elegida según sea necesario (por ejemplo, "células individuales"). Las "células individuales" aparecerán como un nuevo espacio de trabajo.
- Continúe con las "células únicas" para DAPI negativa (es decir, "células vivas"). Para identificar las células vivas, compare la población celular con y sin tinción de DAPI. En ambas parcelas elija FSC-A versus pacific-blue-A.
- Haga clic en el rectángulo y elija la población de celdas negativas de DAPI, asigne a la población de celdas elegida "células vivas" y cree una nueva gráfica de puntos que muestre FITC (eGFP) frente a PE (tdTomato) como se describió anteriormente.
- Agregue cuadrantes en "células vivientes" eligiendo Quad en la barra de herramientas. Atraviese la población arrastrando el centro del cuadrante hasta el borde de cada población. Los cuadrantes representan 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+.
NOTA: Debido a la superposición espectral de espectros de emisión entre FITC y PE, la compensación inicial es esencial para distinguir entre señales rojas y verdes y para lograr resultados precisos. - Determine las intensidades medias de fluorescencia (IMF) haciendo clic con el botón derecho en el cuadrante y seleccionando Añadir estadísticas. Elija Media y haga clic en Aceptar. La IMF media se muestra ahora por debajo de la población en la sección "estadísticas". Los cuadrantes 2 y 4 corresponden a la expresión temprana, mientras que los cuadrantes 3 y 4 representan la expresión tardía.
- Agregue réplicas adicionales de la misma manera para la potencia estadística.
- Para la interpretación de datos, los valores de MFI de inicio y de retraso en una gráfica de barras:
- Para comparar las actividades del NCCR obtenidas de diferentes donantes o cepas de virus, agregue un control arquetípico o la cepa Dunlop16 y establezca sus IMF relativas en 100%, y calcule los valores de IMF relativos. Repita con cada réplica y determine la media y la desviación estándar.
- Para evaluar un efecto de los compuestos potenciales en la actividad transcripcional, establezca el control de disolvente en 100% y trace la IMF de las células tratadas.
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Representative Results
En este experimento representativo, la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus se midió a través de la citometría de flujo. Además, se probó la inhibición de la expresión génica temprana viral para tratar a los pacientes después de la reactivación del BKPyV. Con este fin, se utilizó un ensayo de doble fluorescencia-reportero como publicado anteriormente5. El esquema de flujo de trabajo general de la configuración experimental se ilustra en Figure 1. En primer lugar, se recogieron muestras de sangre de pacientes trasplantados renales inmunocomprometidos de acuerdo con las directrices de investigación humana aprobadas por el comité de ética institucional. La sangre se recogió en tubos que contienen EDTA y las fases se separaron por centrifugación. Posteriormente, se utilizaron 400 l de plasma para el aislamiento del ADN del poliomavirus. La región de control no codificante (NCCR) se amplifió utilizando un protocolo PCR anidado como se ilustra en la Figura 2A utilizando el par de imprimación exterior BKV-CR-1fw y BKV-CR-1rv, así como el par de imprimación interna BKV-CR-2fw-AgeI (Primer AgeI) y BKV-CR-2rv-SpeI ( Primer SpeI)17, el último de los cuales alberga los sitios de restricción para AgeI y SpeI. La verificación del amplificador se realizó a través de la electroforesis de gel de agarosa como se muestra en la Figura 2B. Mientras que los amplicons derivados de secuencias arquetípicas NCCR (wt) tenían una distribución de tamaño homogénea en el gel, los derivados de NCCRs reorganizados con inserciones (rrins)y eliminaciones (rrdel) diferían en su tamaño (aprox. 300-500 bp). En particular, debido a los reordenamientos, la secuencia de referencia Dunlop NCCR16 (DUN), que se incluyó como control, era mayor que la del NCCR obtenida de virus arquetípicos. Dado que los amplicons correspondían a los tamaños predichos, los productos de PCR purificados se enviaron para la secuenciación de Sanger para su posterior comparación con las secuencias clonadas en el plásmido del reportero para su posterior análisis.
Para la clonación de los amplicons, la digestión se realizó utilizando las dos enzimas de restricción AgeI y SpeI. Después de la clonación en el reportero de fluorescencia dual, que se realizó mediante el procedimiento de clonación estándar, la selección de clones positivos que contienen el NCCR fue verificada por la digestión de AgeI y SpeI (Figura2C). Aquí, la pequeña región espaciadora (NC, 128 bp) fue reemplazada por los fragmentos NCCR más grandes (aprox. 300-500 bp) que indicaban clones positivos. El ADN plásmido aislado de clones verificados fue enviado para la secuenciación de Sanger y comparado con las secuencias obtenidas de la secuenciación de amplificación (no se muestra). Solo se eligieron los clones que coinciden con la secuencia de amplificación para su posterior procesamiento. Como se muestra en la Figura 3, los resultados de la secuenciación se compararon con una secuencia NCCR arquetípica (JN192438). En este ejemplo, se detectó una eliminación en el bloque P y una sustitución en el bloque O.
Para probar posteriormente la actividad transcripcional de las secuencias NCCR clonadas en el cultivo celular, las células HEK293T se transfectó transitoriamente con las respectivas construcciones de reportero (Figura4A). Como se visualiza en la Figura 4B,la eficiencia de transfección y la actividad NCCR se monitorizaron mediante microscopía de fluorescencia. La fluorescencia roja y verde correspondió a la expresión génica BKPyV temprana y tardía, respectivamente5. Las células expresaron ambos fluoróforos que indican una actividad promotora eficiente temprana y tardía. Como se ilustra en los dos ejemplos, el primer NCCR (NCCR1) mostró una fuerte expresión genética tardía, mientras que el segundo ejemplo (NCCR2) tenía una expresión genética tardía temprana pero moderada comparativamente fuerte (Figura4B). Por lo tanto, se prepararon muestras para la medición de la citometría de flujo. Como se describe en la sección de protocolo 6, las celdas negativas DeDAPI se encerradon (Figura5A,panel inferior) y se creó una gráfica de puntos que muestra eGFP frente a tdTomato. Las muestras que fueron negativas (Figura5B),así como las positivas para tdTomato (Figura5C)o eGFP (Figura 5D) solamente, se incluyeron en el análisis. Tenga en cuenta que se realizó la compensación inicial, que es esencial para distinguir las señales rojas y verdes y para lograr resultados precisos18. Las intensidades medias de fluorescencia se derivaron de cada clon de prueba. Aquí, las células positivas tdTomato correspondían a la expresión temprana, mientras que las células positivas de eGFP representaban la expresión tardía. En este ejemplo, el tratamiento con el inhibidor de mTOR dual INK128 redujo significativamente tdTomato MFI (Figura5E-F), lo que significa que se inhibió la expresión temprana.
Figura 1 : Esquema de flujo de trabajo para la configuración experimental. 1) Recogida de muestras de sangre (alternativamente orina), 2) Aislamiento del ADN del poliomavirus 3) Amplificación de la región de control no codificante (NCCR) utilizando un protocolo PCR anidado, 4) Electroforesis de gel de agarosa y amplicon verificación, 5) Secuenciación de Sanger del amplicon de PCR, 6) Clonación del NCCR en el reportero de fluorescencia dual usando AgeI y SpeI, 7) Selección de clones positivos, 8) Secuenciación de Sanger del ADN plásmido, 9) Transfección transitoria de células HEK293T con plásmido reportero y adición de compuestos a probar, 10) Microscopía de fluorescencia para verificar la transfección eficiente, 11) Análisis de citometría de flujo, 12) Gating y análisis de la expresión eGFP tdTomato, 13) Interpretación de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : PCR anidado y análisis representativo de los NCCR-amplicons derivados del paciente. A) El ADN derivado de pacientes trasplantados renales inmunocomprometidos fue sometido a amplificación de PCR semianidada utilizando imprimaciones de oligonucleótidos vinculadas con sitios de restricción AgeI y SpeI. Los nombres de los primeros y la longitud (pares base) de los bloques arquetípicos O, P, Q, R y S de la cepa BKPyV JN192438 se indican entre corchetes. B) Los amplicons fueron analizados por electroforesis en un gel de agarosa del 1,5% y visualizados mediante tinción de ADN. M1 a 100 bp escalera, wt - tipo salvaje (arquetípico), rr - reorganizado, ins - inserciones, despilores del, DUN - Dunlop Strain. C) Digestión plásmido con AgeI y SpeI. Los fragmentos digeridos fueron analizados por electroforesis en un gel de agarosa del 1,5% y visualizados mediante tinción de ADN. M1 a 100 bp escalera, M2 á escalera de 2 troncos. NC - control negativo (espaciador). + clon positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Clonación y validación del NCCR en el reportero de doble fluorescencia. Resultados representativos de la secuenciación de plásmidos. Los amplicons fueron purificados usando un kit de purificación de PCR y sometidos a la secuenciación de Sanger. Las secuencias respectivas se alinearon con la secuencia NCCR derivada de la cepa arquetípica BKPyV JN192438. Las eliminaciones y sustituciones se marcan en rojo. Se indican los sitios de restricción AgeI y SpeI, el inicio traslacional del marco de lectura abierto eGFP (impreso en negrita) así como los bloques O-S del NCCR. Los bloques respectivos y los sitios de restricción se resaltan en color. La longitud de cada bloque NCCR en pares de bases se imprime entre corchetes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Análisis representativo de la microscopía de fluorescencia de la actividad temprana y tardía del promotor del NCCR. A) Mapa genético del reportero de fluorescencia dual bajo el control del promotor bidireccional. Como se describió anteriormente5 el plásmido pTA-tdTOM-NCCR-eGFP (6.009 bp) alberga la señal de poliadenilación tardía SV40 aguas abajo de cada casete de expresión para asegurar un procesamiento comparable y eficiente de ambas transcripciones para tdTomato (principios expresión) y eGFP (expresión tardía), respectivamente. El NCCR está flanqueado por AgeI y SpeI. El vector contiene un casete de resistencia a la ampicilina para su selección durante el procedimiento de clonación. B) Las células HEK293T fueron transcinfectadas con construcciones de reporteros de doble fluorescencia cada una bajo el control de secuencias NCCR derivadas del paciente (NCCR1-2). Las células fueron sometidas a un análisis de campo brillante y microscopía de fluorescencia 72 h después de la transfección. Los ajustes del filtro del microscopio se utilizaron en los siguientes rangos de excitación: verde para tdTomato (515-560 nm) y azul para eGFP (450-490 nm). La barra de escala (200 m) se indica en la parte inferior derecha de cada fotografía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Análisis REPRESENTATIVO de FACS. Se muestra la estrategia de gating simple necesaria para este método. Se utilizan gráficas de puntos o densidad de dos parámetros. A) En primer lugar, el FSC se traza contra Pacific Blue, mientras que sólo dAPI negativo (es decir, células vivas) se procesan aún más. B-F) Se trazan FITC (eGFP) frente a PE (tdTomato). C-D) Agregue exclusivamente celdas fluorescentes verdes y rojas para ajustar la compensación en el citómetro de flujo. E-F) En este ejemplo, los inhibidores mTOR INK128 y reduce significativamente la IMF tdTomato, que corresponde a una reducción de la expresión génica temprana BKPyV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Primer nombre | Secuencia (5' a 3') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGCAGCTCTTTCAAGGC |
| BK-CR-rev1 | CCTCTAACAAAATTCCAGCAAAAGC |
| BKV-CR-2-fw-AgeI | AAAAAAACCGGTTTTGCAAAAATTGCAAAAGAATAGG |
| BKV-CR-2-rv-SpeI | TTTTTTACT CTGGCGCAGAACCATGGCCTTT |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
Tabla 1: Oligonucleótidos utilizados en este protocolo. Las bases subrayadas indican los sitios de enzimas de restricción para AgeI y SpeI, respectivamente.
| Componente | Volumen/reacción (l) | concentración final |
| Agua libre de RNase | 32,8 l | - |
| 10x zona de influencia PCR | 5 l | 1x |
| dNWP (10 mM de cada uno) | 1 L | 0,2 mM de cada dNTP |
| Imprimación Fwd (10 m) | 3 L | 0,3 m |
| Rev-imprimación (10 m) | 3 L | 0,3 m |
| Taq Polimerasa | 0,2 l | 2 unidades/reacción |
| ADN de plantilla | 5 l | Reacción de <0,5 g/50 l |
Cuadro 2: Protocolo maestro de preparación de mezclas. La instrucción se aplica a las reacciones PCR previas y anidadas como se describe en los pasos 2.2 y 2.7, respectivamente.
| Temperatura | Duración | Paso de PCR | Ciclos |
| 95oC | 5 min | Desnaturalización inicial | |
| 95oC | 30 seg | Desnaturalización | |
| 55oC | 34 seg | Recocido | x35 |
| 72oC | 1 min | Extensión | |
| 72oC | 10 min | Extensión final | |
| 4oC | ∞ | Enfriamiento |
Cuadro 3: Programa PCR utilizado para la amplificación del NCCR. La instrucción se aplica a las reacciones PCR previas y anidadas.
| Reactivo | Volumen/reacción (l) | concentración final |
| H20 libre de DNase | 6 | a 20 l |
| 10x Buffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 unidades |
| SpeI | 1 | 10 unidades |
| PCR-amplicon purificado | 10 | Variable |
Cuadro 4: Amplicon protocolo de digestión. La instrucción se aplica para la digestión simultánea del ADN del amplificador con dos enzimas de restricción descritas en el paso 3.1.
| Reactivo | Volumen/reacción (l) | concentración final |
| H20 libre de DNase | 14.5 | a 20 l |
| 10x Buffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 unidades |
| SpeI | 1 | 10 unidades |
| Columna vertebral del plásmido (1 g/l) | 1.5 | 1.5 g |
Tabla 5: Protocolo de digestión plásmido. La instrucción se aplica para la digestión simultánea de la columna vertebral del ADN plásmido con dos enzimas de restricción descritas en el paso 3.3.
| Reactivo | Volumen/reacción (l) | concentración final |
| H20 libre de DNase | 7 | a 20 l |
| Ligasa de ADN T4 | 1 | 20 |
| 10x T4 T4 tampón de ligasa de ADN | 2 | 1x |
| Columna vertebral del plásmido purificado Derretimiento bajo diluido 1/2 del paso 3.5 |
2 | Variable |
| PCR-amplicon digerido y purificado del paso 2.7 | 8 | Variable |
Tabla 6: Protocolo de ligadura plásmido. La instrucción se aplica a la ligadura de la columna vertebral del ADN plásmido con el ADN de amplificación de PCR digerido descrito en el paso 3.7.
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Discussion
En este artículo, se presenta un método comúnmente utilizado que permite el análisis de la actividad de promotor estinúo no codificante (NCCR) impulsada por la actividad temprana y tardía del promotor. La actividad del NCCR se puede medir simultáneamente y no necesita lisis de las células transinfectadas. Además, se puede analizar un número relativamente grande de células y no es necesario la co-transfección de marcadores adicionales para la normalización de los valores de fluorescencia.
Una parte crítica de este método es que el NCCR clonado debe contener exactamente las mismas secuencias identificadas por la secuenciación del amplificador, que corresponde a las variantes mayoritarias presentes en el plasma del paciente. Para lograr resultados precisos y minimizar los errores propensos a PCR, es muy recomendable utilizar una polimerasa con actividad de lectura de prueba. Alternativamente, las secuencias pueden ser ordenadas por los servicios comerciales de síntesis de genes. Las secuencias designadas del NCCR se pueden ordenar incluyendo los sitios de restricción AgeI y SpeI para la clonación directa. En este caso, digerir el plásmido paralelo al plásmido de la columna vertebral y reemplazar la plaquita espaciadora con el fragmento NCCR correspondiente de la construcción sintetizada. El ADN se puede aislar alternativamente de muestras de orina. Sin embargo, dado que bkPyV también es secretado en la orina por individuos inmunocompetentes y no necesariamente reflejan la replicación activa, la relevancia clínica es limitada. Idealmente, el ADN también puede aislarse de biopsias renales en las que previamente PVAN podría ser detectado histológicamente (comparar con Korth et al., 201919).
Mediante la medición de la intensidad media de fluorescencia de los células fluorescentes verdes y rojas, este método permite cuantificar la fluorescencia/actividad derivada del NCCR sin el sesgo de la eficiencia de la transfección y los efectos antiproliferativos de los agentes analizados (por ejemplo, mTOR dual inhibidores INK128 o PP242)5.
Otra aplicación del sistema de reporteros es la posibilidad de analizar las consecuencias de inserciones, eliminaciones o duplicaciones en el NCCR que se encuentran en los aislados clínicos de la actividad promotora temprana y tardía. En estudios anteriores, se han estudiado agentes inmunosupresores para modular la actividad del NCCR; sin embargo, no se encontraron mutaciones ni reordenamientos del NCCR que afecten a la susceptibilidad. Sin embargo, las mutaciones pueden afectar la respuesta de nuevas sustancias que podrían ser aprobadas en un futuro próximo.
Esto puede ser relevante ya que, a diferencia de las regiones de codificación, el antígeno T grande o la proteína cápside VP1, el NCCR como su nombre indica representa una región no codificante y, por lo tanto, no subyace a la presión selectiva a nivel de aminoácidos.
En este protocolo, la selección de clones positivos que contienen el NCCR es verificada por la digestión de AgeI y SpeI. Sin embargo, una PCR de colonia podría representar un enfoque alternativo para detectar rápidamente las plaquitas NCCR directamente desde E. coli chapadas en placas de agar. Para este enfoque, utilice el par de imprimación BKV-CR-2-fw-AgeI y EGFP-N (Tabla1). Después de la transfección, las células se comprueban para la fluorescencia roja y verde mediante microscopía de fluorescencia (Figura4). Alternativamente, las células se pueden fijar usando 3% PFA durante 20 min a 22 oC. En este caso, lavar con PBS, añadir un 0,2% de detergente no iónico en PBS e incubar durante 10 minutos. Las células fijas se pueden teñir con DAPI en PBS (1 g/ml) durante 10 min a 22 oC y se someten a un análisis de microscopía de fluorescencia y se pueden visualizar con luz UV (340-380 nm).
Dado que ambos fluoróforos albergan las mismas señales de poliadenilación, se puede descartar un efecto de eficiencia de poliadenilación. Sin embargo, en comparación con eGFP, tdTomato es una proteína dimerica que debe transcribirse correspondientemente en un ARNm más largo (secuencia de codificación: 745 frente a 1431 bp, respectivamente). Sin embargo, dado que la actividad de los promotores de las células tratadas con sustancias interferentes siempre se compara en relación con las células no tratadas (DMSO), esta diferencia juega poco papel. Debido a la presencia del origen de la replicación, la transfección del plásmido reportero en células que expresan establemente el antígeno T grande SV40PyV permite la transferencia de plásmidos a las células hijas. Se ha demostrado que el antígeno T grande derivado sV40 puede transactivar SV40 y BKPyV NCCR y la replicación del ADN viral20. Sin embargo, dado que un antígeno T grande también está involucrado en la transición de la fase temprana a la fase tardía de la infección, se administra una situación artificial. Usando este ensayo, debe tenerse en cuenta que el paso más limitador de replicación es la expresión temprana que conduce a la expresión de antígeno T grande. Con el fin de asignar el ciclo de replicación completo los MRNA tempranos y tardíos deben ser medidos en las células infectadas por qRT-PCR como se describe en otroslugares5,12.
Los grupos suizos y alemanes ya han utilizado un método comparable para analizar actividades promotoras arquetípicas y reorganizadas derivadas de BKPyV NCCR, aunque con sistemas vectoriales clonados de forma independiente5,9. Gosert y sus colegas de Basilea utilizaron un método similar para determinar la actividad promotora del NCCR de las cepas BKPyV y JCPyV9,10,11. Ambos métodos utilizaron eGFP para la fluorescencia verde; sin embargo, el grupo de Basilea utilizó RFP mientras que en el protocolo actual tdTomato se utilizó para la fluorescencia roja. La ventaja de tdTomato sobre RFP es la fotoestabilidad mucho mayor; sin embargo, la proteína dimerica está codificada por una secuencia que es el doble de tiempo que RFP21. Además, la vida media de las proteínas puede ser diferente, lo que resulta en una concentración desigual 72 h después de la transfección. Sin embargo, este problema sólo podría ser relevante cuando se comparan directamente ambas intensidades de fluorescencia. Los sitios de restricción de BamHI y NotI utilizaron BamHI y NotI mientras que en el protocolo actual AgeI y SpeI están flanqueando la secuencia NCCR. Utilizando ambos métodos, la cepa DUNLOP de referencia16 produjo patrones de fluorescencia comparables con una fuerte actividad promotora tardía temprana pero débil9,10. En otro acuerdo, los reordenamientos del NCCR con las inserciones en la región P dieron lugar a un aumento significativo de la actividad del promotor temprano y tardío en comparación con el wt-NCCR5,9.
Aunque se ha demostrado que el antígeno T grande derivado de SV40 puede transactivar los NCCR derivados sV40 y BKPyV20,podría ser interesante utilizar células humanas que expresan fácilmente el antígeno T grande del BKPyV y no el prototipo del virus SV40 en futuros estudios . Sin embargo, en este caso la línea celular tiene que ser fácil de transfectar (por ejemplo, HEK293).
Dado que los promotores del NCCR de los poliomavirus son muy similares, este método también se puede utilizar (con pequeña adaptación en las secuencias de imprimación) para investigar la actividad promotora y la influencia de potentes agentes antivirales en la actividad del poliomavirus JC (JCPyV) regiones de control de no codificación derivadas11. Dado que el JCPyV es el agente causal de la leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), una rara enfermedad del sistema nervioso central que rara vez puede ocurrir en pacientes con inmunodeficiencias que resultan en neuropatología grave, también hay una necesidad apremiante de encontrar sustancias antivirales de acción directa para tratar a pacientes inmunes comprometidos. Curiosamente, los reordenamientos también se encuentran en JC NCCRs11. Dado que jcPyV ha pronunciado neurotropismo y por lo tanto grandes cantidades de virus se encuentran en el licor, la adquisición de muestras tiene que ajustarse al ADN derivado del licor. Sin embargo, los pasos posteriores se pueden adaptar fácilmente.
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Disclosures
Johannes Korth ha recibido subvenciones por honorarios de oradores y gastos de viaje de Astellas y Novartis. Marek Widera ha recibido honorarios de consultoría de Novartis. Oliver Witzke ha recibido subvenciones para estudios clínicos, honorarios de oradores, honorarios y gastos de viaje de Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. K-hler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi y TEVA.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Barbara Bleekmann por su excelente asistencia técnica. Estos estudios fueron apoyados por el programa IFORES de la Facultad de Medicina de la Universidad de Duisburg-Essen y el programa RIMUR de la Alianza Universitaria Ruhr y Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Los autores agradecen a los J. Manchot-Stiftung por la beca de doctorado de Helene Sertznig y el apoyo constante. La recolección y el uso de material para pacientes ha sido aprobado por el comité de ética de la facultad de medicina de la Universidad Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
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