Summary
本文的目的是概述从单聚α-合核蛋白中产生纤维所需的步骤、随后的质量控制以及在体内使用预成型纤维。
Abstract
在研究人员中, 使用α-核蛋白预形成纤维 (α-sysyn PFF) 模型的研究人员越来越受到欢迎, 该模型旨在为帕金森病的核细胞病和黑纹状体变性建模。为了确保α-syn PFF 的病理一致、稳健, 将其标准化至关重要。在这里, 我们提出了一个详细的方案, 从单核菌α-syn, 纤维化后的质量控制步骤, 并建议参数, 为神经外科注射α-syn Pff 到大鼠或小鼠成功。从单体α-syn 开始, 在7天的潜伏期内进行灭菌, 同时在最佳缓冲条件、浓度和温度下晃动。通过沉淀法、硫代黄素 t 法在纤维中形成淀粉样蛋白构象以及纤维的电子显微镜可视化, 评估纤维后的质量控制。虽然使用这些检测的成功验证是成功所必需的, 但它们不足以保证 Pff 会在神经元中产生α-syn 内含物, 因为每个 PFF 批次的这种聚集活性应在细胞培养或试验动物队列中进行测试。在使用之前, Pff 必须在精确标准化的条件下进行声纳处理, 然后使用电子显微镜或动态光散射进行检查, 以确认纤维长度在最佳尺寸范围内, 平均长度为50纳米。然后, Pff 可以添加到细胞培养培养基中, 也可以在动物中使用。磷酸化α-syn (心理; 丝氨酸 129) 的免疫染色可检测病理, 在细胞培养和啮齿类动物模型中分别有明显的数天或数周。
Introduction
帕金森病 (PD) 的主要特征是死后有两个主要病理特征: 广泛和渐进的α-核蛋白 (α-sysyn) 病理和黑纹体变性。在野生小鼠或大鼠体内注射α-syn 预知情纤维 (PFFs) 后, 会导致病理α-syn 的逐渐积累, 从而导致黑质 (SNpc) 多巴胺神经元在许多过程中的长期退化月, 以及感官运动赤字 1,2,3,4,5, 6。神经元暴露在α-syn 纤维中, 或者通过直接脑内注射或添加到培养的神经元的培养基中。当 pff 被带入神经元时, pff 通过模板化来 "种子" 内含物的形成, 并将内源性α-syn 积累成磷酸化的夹杂物1,7, 8, 9个。内含物与莱维体具有相似的性质: 含有α-syn 磷酸化在丝氨酸 129 (pSyn)、泛素和 62;具有淀粉样的第四纪结构, 如阳性硫代黄素染色所示;并对蛋白酶 k 消化1,3,5,7, 8,9, 10,11, 12岁Pff 接触导致原代神经元和培养中的一些不朽神经元以及体内的小鼠、大鼠和非人类灵长类动物形成α-syn 包涵形成1、2、3、4、 5,6,7,8,9, 13.需要注意的是, 在所有细胞培养模型中, Pff 不会导致α-syn 包涵形成, 一些培养的神经元种子会比其他神经元更好。
体内α-syn PFF 模型的另一个重要特征是几个月内出现的明显的顺序病理阶段。在啮齿类动物体内注射后, α-syn 包涵形成通常在 SNpc 和许多皮质区域内达到峰值, 在1-2个月内。这个聚集峰之后是小骨纹状体退化, 2-4 后 1,3,5。这些不同的病理阶段为研究人员提供了研究和制定策略的平台, 1) 减少α-syn 聚集, 2) 明确已经形成的α-syn 内含物, 和/或 3) 防止随后的神经退行性变。与神经毒理学、转基因和病毒载体介导的α-syn 过度表达模型相比, PFF 模型具有明显的优点和缺点.应确定采取哪种模式或方法最适合调查人员提出的问题。
虽然 PFF 模型已被许多实验室成功地利用, 但仍有一些群体经历了与产生纤维和产生一致的α-赛恩病理的不一致.不一致的例子包括产生很少或根本没有α-syn 病理的 Pff, 批量到批量播种效率, 甚至是纤维的失败形成。因此, 将α-syn PFF 生成和体内应用标准化至关重要, 以便对新型治疗干预措施的影响做出准确的解释。以下协议概述了从α-syn 单体中生成 Pff 所需的步骤、Pff 一旦形成后的体外质量控制、使用前 Pff 的超声和测量, 以及促进体内注射成功的建议。Pff 进入老鼠或老鼠体内。
Protocol
所有涉及动物的方法都已得到密歇根州立大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。
1. 从单体中形成α-共核蛋白预成型纤维 (图 1)
- 在冰上使用α-共核蛋白单体, 通过闪烁试管轻轻重新悬浮, 离心机在4°C 下以 15, 000 x克的速度进行10分钟。
注: α-赛恩单体必须专门用于灭菌。重组单体可以从商业来源购买, 也可以通过站点 4、9、14、15 上的协议生成。如果从商业来源购买, 产品必须说明α-赛恩单体是专门用于产生纤维的。无论单体是在现场购买还是生产, 应在每个批次中执行以下质量控制步骤, 以确保纤维已形成, 并将在实验中使用之前高效播种。 - 将上清液转移到干净的 1.5 mL 微离心管中, 并记录转移量。
注: 请注意避免颗粒, 如果存在, 它将是小的。 - 用标准的双氯酸法 (BCA) 测量转移的上清液的蛋白质浓度, 或用微体积分光光度计测量280纳米的吸收率。
注: BCA 检测对于α-赛恩的具体测量并不准确, 可以产生高估蛋白质浓度的结果。因此, 测量280纳米的吸收率是测定蛋白质浓度的推荐方法。- 用 BCA 法测定, 遵循标准的 BCA 协议, 对α-赛恩单体进行三种不同的稀释。建议稀释是1:25、1:50 和 1: 100。
- 用 A280 法测量, 用无菌 1x Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (dPBS) 空白读取器, 不含钙和镁, 盐浓度约为 100 mM NaCl, pH 值范围为 7.0-7.3 (材料表)。
- 在读取器中添加2μl 的样品, 并读取280纳米的吸收率。
- 使用啤酒兰伯特定律来确定单体的浓度。
注: 人类α-syn 的灭绝系数为 5, 960 M-1cm-1 , 小鼠α-syn 为 7, 450 m-1cm-1.长度以厘米为单位. α-syn (14Kda) 的分子量估计为 1 da = 1 g/mol。
- 用 1x dPBS 稀释单体, 最终浓度为 5 Mg/ml。使用下面的公式计算添加到稀释单体的 1x dPBS 的量。
注: 所有浓度均为 Mg/ml, 体积以μL. 单体稀释剂为单位, 应使用 1x dPBS 进行。用于产生纤维的总体积应在100至500Μl 之间, 以获得可重现的纤维化结果。 - 简单的涡流混合, 离心机收集所有液体在底部的管。1.8.1-1.8.4 步骤中指出的用于质量控制的反液单体与纤维的比较。
- 使用管锁或蜡膜 (材料表) 固定微离心管盖。
- 将管子放置在轨道热管中, 盖子在37°c 下 7天, 在 1, 000 RPM (材料表) 处晃动。
注: 在7天结束时, 管的内容应出现混浊。热敏仪必须有一个盖子, 以防止管盖上形成冷凝。 - 轻轻轻触管, 重新悬浮α-syn 纤维。针对以下质量控制步骤的 alquot 纤维, 如步骤 1.8.1-1.8.4 中所示。
注: 用于质量控制步骤的纤维可以在 RT 上存放一夜。- 为沉淀法测定出6Μl。
- 用于硫代黄素 T 结合试验的5微米。
- 用于纤气可视化的透射电子显微镜的 alquot 2Μl。
- 对于内毒素检测, 至少为10Μl。
注: 对于内毒素检测, 按照制造商的说明 (材料表) 使用商业的脂肪细胞裂解液 (lal)。纤维内毒素水平应≤0.5 内毒素单位。如果不符合此标准, 则可以使用内毒素去除试剂盒。
- 把剩下的纤维和储存。对于长期储存 (12-18), 快速冻结在干冰上, 并在-80°c 下储存。
注: 要达到的金额取决于所需的下游应用。在体内使用通常需要更多的纤维在更高的浓度比在体外使用, 并应相应地规划脂肪体积。纤维应存放在冰柜的背面, 以防止潜在的冻融造成的损坏。协议可以在这里暂停。
2. 沉积试验
- 在干净的微离心管中, 将6μl 的 PFF 添加到54μl 的 dPBS 中, 使纤维稀释 1:10, 并将移液器混合。
- 在单独的管中, 将6Μl 单体添加到54μl 的 dPBS 中作为附加控制。
- 在 RT 以 10, 000 x g的速度离心样品 30分钟, 并将上清液转移到干净的微离心管中。
- 在剩余的颗粒和涡旋中加入60μl 的 dPBS 以重新悬浮。
- 在每个管和涡流中加入30μl 的3x 样品缓冲液 (140μl 的50% 甘油-0.1% 溴酚蓝、40μl 的 10% SDS 和20μl 的β-丙醇) 混合。
- 在100°c 下将样品加氢 10分钟, 并在冰上冷却5分钟。
- 使用标准的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 方案来分离蛋白质的质量。使用范围为 14 kDa (单分子α-syn 的大小带) 的蛋白质阶梯。
- 将凝胶转移到染色盘中, 用 Coomassie 蓝色染色覆盖凝胶 (0.1% Coomassie 明亮的蓝色, 20% 甲醇按体积, 10% 醋酸按体积在 Ddh2o中)。在 RT 时在 RT 下孵化 3小时, 同时晃动。
- 从库马西蓝色污渍中倒出, 加入足够的去污剂 (50% 的甲醇按体积计算, 10% 的醋酸按体积在 ddH2o 中) 覆盖凝胶。在 RT 时在 RT 下孵化 30分钟, 同时晃动。
- 倒掉去地球, 重复下落步骤, 直到凝胶清晰, 带是可见的。
- 用 Ddh2o 晃动凝胶, 每次清洗凝胶3次, 每次5分钟。
3. 用于纤维可视化的透射电子显微镜
- 在微离心管中称量20毫克醋酸铀, 加入1毫升的 Ddh2o,制成2% 的水溶液。涡旋, 直到醋酸铀溶液中, 并允许坐一夜。
注: 醋酸铀应在制备透射电子显微镜样品的前一天制作。暴露在光线或搅拌中会导致醋酸铀沉淀, 因此, 含有醋酸铀溶液的管应覆盖在铝箔中, 保存在黑暗的地方, 在醋酸铀溶液中不摇晃后。 - 加入2μl 的 PFF 到98μl 的 dPBS, 以稀释纤维 1:50, 然后将移液物混合。
- 在台面上准备一个干净的蜡塑薄膜 (材料表) 覆盖表面 (约50毫米 x 50 毫米)。在清洁的蜡塑薄膜 (材料表) 上, 添加以下内容 (图 2)。
- 加入 4 x 10μl 滴的 ddH2o。
- 加入 1 x 10μl 滴稀释纤维或单体样品。
- 加入 2 x 10μl 滴2% 的醋酸铀。
- 使用细尖钳拿起一个双化碳涂层, 网状铜透射电子显微镜网格 (材料表)。
注: 请确保只拿起网格的边缘, 避免在中心的网格部分 (图 2a)。如果钳子接触网格, 则镀锌膜将被损坏, 从而使网格区域的成像成为不可能。 - 在 ddH 2o 的第一滴上漂浮网格形式 (闪亮的一面), 轻轻地用钳子固定网格, 向下推, 以确保整个涂层表面与 ddh2o 接触。让网格浮动1分钟。
- 拿起网格, 不接触网格的网格部分, 灯芯用滤纸离开Ddh2o。
- 在 Ddh2o的第二滴上浮动上面的网格 1分钟, 并将 Ddh2o擦掉.
- 在稀释的纤维滴处漂浮网格 1分钟, 并将多余的纤维擦掉, 如上所示。
- 在醋酸铀的第一滴上浮网格 1分钟, 灯芯清除多余的部分。
- 漂浮在网格上的第二滴醋酸铀 1分钟, 灯芯多余的。
- 短暂地漂浮上述的网格, 并将 Ddh2o擦掉.
- 在上述 Ddh2o的第四滴上短暂地浮动网格, 并将 Ddh2o擦掉, 确保尽可能多地移除 ddh2o.
- 传输到网格框进行存储, 直到映像。
注: 栅格应在成像前干燥至少5分钟。网格在准备后至少可以成像一年, 应该保存在干燥的环境中。
4. 硫代黄素 T 检测
- 在干净的微离心管中, 将5μl 的 PFF 添加到245μl 的 dPBS 中, 使纤维稀释 1:50, 并将移液器混合。
- 在单独的微离心管中添加250μl 的 dPBS, 作为负控制。
- 在245μl 的 dPBS 中加入5μl 的单体, 作为单体控制。
- 在甘氨酸缓冲液中加入250μl 硫代黄素 T (25μm 硫代黄素 T, 100 mM 甘氨酸, 1% triton X-100, pH 8.5), 然后轻轻混合。
- 皮包2复制, 每个 200Μl, 成一个黑色96井板。将板材保持在黑暗中, 以防止光漂白。
- 在 RT 中孵化 1小时, 并使用 450 nm 的激发和 510 nm 的发射读取板材。
注: 硫黄素 T 读数会随着时间的推移而波动。样品应在相同的孵化时间阅读。如果需要, 可以在一小时的孵育过程中进行多次读数, 并随着时间的推移进行绘制。
5. α-共核蛋白预成型纤维的超声治疗
注意: 声纳器和所有声纳步骤都是在培养罩中进行的, 以防止暴露在超声过程中可能会气化的纤维。执行声纳步骤的人员应佩戴个人防护设备, 包括手套、实验室外套形式的衣物防护和声纳操作时的面罩。使用杯式喇叭声纳进行声纳处理可以降低纤维暴露的风险, 从而使含有纤维的管在超声过程中保持闭合。
注: 纤维的最佳超声参数取决于所使用的声纳模型。因此, 需要进行一些优化, 以确保纤维的大小正确。使用的声纳可以在材料表中找到, 概述的参数是基于以前的结果与该模型的声纳。以下参数适用于200-400μl 溶液中的2-4μμμl。应与仪器进行测试超声检查, 并对纤维进行分析, 以确保在实验中使用 Pff 之前达到预期的结果。
- 将直径 3.2 mm 的探头 (材料表) 连接到转换器, 并设置如下步骤 5.1.1 5.1.3 中所述的声纳参数。
- 将振幅设置为30%。
- 将脉冲设置为 01 01 (1秒打开; 1秒关闭)。
- 将时间设置为 0:01:00。
注: 1分钟的脉冲相当于60个脉冲, 这个模型的声纳 (材料表) 将自动停止。对于其他声纳模型, 脉冲的数量需要计算。
- 在 RT 解冻纤维, 并在培养罩中使用无菌 dPBS 稀释。
注: 透明 0.6 mL 微离心管最适合超声, 最终的纤维浓度取决于预期用途。所显示的代表性结果来自于最终纤维浓度为4μμl。 - 用70% 乙醇浸湿的实验室组织擦拭声纳器的探头, 以清洁探头。将探针的尖端浸入 ddh2o,并将脉冲 10次, 以进一步清洁探头, 然后用实验室组织擦干。
- 将探针尖端放入稀释纤维的管内, 并将探针放置在管的底部。
- 为60个脉冲 (1秒; 1秒关闭) 提供松编。在每个脉冲过程中上下移动探头, 以确保液体中的所有纤维都被声纳化。和清洁。
- 在60个脉冲后, 从 Pff 中取出探针, 并在干净的微离心管中加入2μl 的 PFF 至98μl 的 dPBS, 以稀释纤维 1:50, 以便用电子显微镜测量声纳纤维。
注: 理想情况下, 应在体内注射之前测量一小群纤维, 并在时间允许的情况下对纤维进行更全面的测量。 - 超声后, 以 2, 000 x克的速度短暂离心 pff, 以收集管内两侧的所有液体。
注意: 如果管变得热接触, 停止超声对30脉冲后, 等待 1分钟, 并超声为最后30个脉冲。
注: 在超声作用时, 将探针尖端保持在每个脉冲开始处的底部, 过于靠近液体顶部会导致样品损失。 - 将探头尖端浸入 1% SDS, 并将脉冲10次淹没以清洁探头。从 SDS 中取出尖端, 浸入 Ddh2o并脉冲10次。
- 用70% 乙醇浸湿的实验室组织擦拭探针, 然后用干燥的实验室组织擦拭探针。从转换器中分离探头并存储。
- 用1% 的 SDS 擦拭引擎盖中的所有表面, 然后使用70% 的乙醇。
注: 1% SDS 解决方案用于分离纤维和清洁表面和设备16。
6. 超声纤维测量用透射电子显微镜
注: 如果电子显微镜不可行, 硫代黄素 t 动力学分析和动态光散射可作为播种效率和纤维大小4,14的间接测量。
- 使用上面 "用于纤维可视化的电子显微镜" 部分中的协议准备样品。
- 使用透射电子显微镜拍摄6到10个不同栅格开口的纤维图像。
注: 图像应具有足够高的放大倍率来测量纤维, 但足够低, 可以同时显示多个纤维。大约 75, 000x 的最终放大倍率应该就足够了。 - 在实验中使用纤维之前, 测量至少25个纤维的一小子集的长度。
注: 这些测量通常可以使用与显微镜相关的成像软件进行。为了快速验证, 测量人员应选择具有代表性的纤维并计算平均尺寸。纤维长度应平均在50纳米或更小, 并遵循更准确的测量。 - 测量 500 + 纤维的长度, 以获得更全面的结果。
注: 与显微镜相关的成像软件可用于纤维测量。或者, 可以使用图像处理软件打开图像并测量纤维, 使用与每个图像关联的刻度栏作为大小参考, 以比较纤维长度。
7. 用于立体定向注射的定制玻璃针管的制备 (图 3)
- 在清洁的50毫升烧杯中加入约10毫升的硅化试剂 (材料表)。
- 将玻璃毛细管 (长度为54毫米; 外径: 0.86 毫米; 内径0.86 毫米) 垂直放置在硅化试剂的烧杯中, 并允许毛细管作用通过淹没在水下的管开口将硅化试剂拉上管。硅化试剂。
- 将附加硅化试剂输送到上管开口, 而不浸入硅化试剂中, 以完全填充玻璃毛细管。
- 从硅化试剂中取出毛细管, 并将管的开口两端涂在纸巾上, 以去除管内的硅化试剂。允许毛细管干燥至少8小时。
- 将硅化玻璃毛细管放入玻璃针头拉拔器 (材料表) 中。
- 打开加热元件, 并允许附加的重量拉伸加热玻璃毛细管。
- 用剪刀将拉好的玻璃毛细管在中间最薄的地方切割, 并从玻璃针拉拔器中取出玻璃针。
注: 拉针内径和外径应分别约为80微米和100μm。可以一次制作多个玻璃针并将其储存, 直到准备好连接到带有金属针的玻璃注射器 (材料表)。 - 用剪刀将收缩包管的长度 (平均内径 0.021 "和平均壁厚 0.001") 切割到约40毫米。将收缩包装滑动到10μl 斜面注射器 (材料表) 的金属针头上。
- 使用明火加热, 并将收缩包裹粘在针头上, 同时旋转针头以均匀地施加热量。
- 小心地将拉好的玻璃针头的较大端滑过注射器的金属针。
- 用剪刀将收缩包管的长度 (平均内径 0.36 "和平均壁厚 0.005") 切割到约40毫米, 并小心地滑过玻璃针, 使玻璃针的底部和注射器的金属针重叠 (表材料)。使用明火加热收缩包装, 将玻璃针固定在金属针头上。
- 添加额外的收缩包装层, 以确保玻璃针的安全。用剪刀将收缩包管的长度 (平均内径 0.044 "和平均壁厚 0.005") 切割到约40毫米, 并小心地滑过玻璃针, 使玻璃针的底部和注射器的金属针重叠 (表材料)。使用明火加热收缩包装, 将玻璃针固定在金属针头上。
- 用剪刀修剪玻璃针, 使尖端长约8毫米。
注: 针头需要足够长的时间来瞄准所需的大脑区域 (所需的长度取决于背侧坐标)。 - 使用步骤 7.14.1-7.14.3 测试针头, 以确保没有泄漏, 并有足够的流量, 从玻璃针提取和分配液体。
- 用带有 Dh2o 的连接26规格针填充1毫升注射器.
- 从定制的玻璃针头注射器中取出金属柱塞, 并将填充 Dh2 o 的注射器的针头插入注射器的底部。施加压力, 从玻璃针上分配Dh2o.检查玻璃针和金属针的界面是否有泄漏, 并确认Dh2o 流量稳定。
注: 如有必要, 可以修剪玻璃针, 以增加流量的易用性, 并添加额外的收缩包装层, 以修补玻璃针底部的任何泄漏。 - 用Dh2o 填充微离心管. 使用定制的玻璃针头注射器在 dh2o中绘制. 检查针头以确认液体是否被带入注射器, 并且没有气泡。
注: 如果有气泡或Dh2o 未被吸引到针头, 修剪针头可以帮助减轻压力。
- 小心地将注射器与连接的玻璃针放在注射器盒中, 直到手术所需。
- 使用标准立体定向手术方法在小鼠的优化坐标下进行产后 Pff 的产后分娩 (一个部位: AP + 0.2 毫米和 ML + 2.0 毫米从布雷格玛, DV-2.6 毫米从 dura) 或在大鼠 (二个站点: AP + 1.6 毫米和 ML + 2.0 毫米从 bregma, DV-4.0 从 dura;Ap + 0.1 毫米和 ml + 4.2 毫米从布雷格玛, dv-5.0 从 dura)1,14,17。
注: 这些坐标已用于 c57bl6ch 小鼠和 Fischer 344只大鼠。使用其他菌株时, 应优化坐标。
Representative Results
从α-syn 单体中产生纤维, 首先要确定单体的浓度。BCA 测定和测量280纳米 (A280) 的吸收率均可用于测定蛋白质含量;然而, BCA 检测结果表明, 浓度高于 A280 方法。从小鼠α-syn 单体中提取的 Pff 的 BCA 值为 14.05±0.22, A280 值为 8.05±0.03Μμl (图 1)。同样, 从人α-syn 单体中提取的 Pff 似乎也浓度较高, BCA 值为 12.95±0.38, A280 值为7.83 ±0.05μμμl (图 1)。A280 测量是根据消光系数的加入而特有的α-syn, 这些结果被用来在7天孵育之前稀释单体。
在孵育之前, 含有α-syn 单体的液体是透明的, 但在纤维形成后应该会出现混浊。透射电子显微镜检查证实存在长纤维, 宽10-20 纳米 (图 4)。相比之下, α-syn 单体几乎不可见, 没有明显的形状 (图 4)。随着纤维结构的视觉确认, 纤维的淀粉样构象是 Pff 的下一个特征, 应该用硫代黄素 T 检测证实。硫代黄素 T 在与淀粉样蛋白结合时表现出增强的荧光;因此, 来自样本的荧光信号的增加表明存在淀粉样蛋白。例如, dPBS 中的硫氧黄素产生了 3, 287±580相对荧光单位 (RFU) 的信号, 小鼠α-syn 单体产生了 4, 174±158 rfu 的信号, 小鼠 Pff 产生了 59, 75±24 6千u 的信号 (图 5)。相比之下, 人类α-syn 单体产生的信号与小鼠单体的信号相似, 为 4, 158±105 rfu, 与小鼠 Pff 相比, 人类 Pff 产生的信号更高, 为 1, 235, 967±113 747 RFU (图 5)。为了评估可球纤维的存在, 进行了沉淀试验。纤维颗粒会与离心。在小鼠和人的 PFF 样本中, 上清液部分的颗粒中的蛋白质含量应大于上清液 (图 6)。相反, 来自小鼠和人类单体的蛋白质大多存在于上清液中, 而颗粒中几乎不存在 (图 6)。由于 Pff 明显地存在电子显微镜, 淀粉样蛋白结构存在, 纤维可循环, Pff 通过所有的体外质量控制步骤。
对小鼠和人的 pff 进行了超声处理, 产生了适合种子α-syn 内含物 4,18的合适长度的 pff。Pff 被稀释到所需的4μμl 浓度和声纳。手术前, 用电子显微镜对25种有代表性的纤维进行了成像, 并对其进行了测量, 以抽查纤维的大小。超声小鼠 Pff 的长度为 48.8±3.1 nm, 而人类的 Pff 长度为52.1 ±4.4 nm;因此, 这两个物种的 Pff 是诱导播种活动的适当长度 (50 纳米或更小)。对大约500块纤维进行更全面的检查, 发现了超声小鼠纤维的平均长度和长度分布。平均长度为4.4 ±0.6 nm, 其中26.6% 的 Pff 为 60 nm 或更小 (图 4)。相比之下, 人工 Pff 的平均能力为 55±1.1 nm, 其中606% 的 Pff 为 60 nm 或更小 (图 4)。
在出生内注射超声状小鼠 pff 到大鼠之前所述的 3, 5 后, 一系列的组织切片在手术后2个月进行处理, 当含有神经元的包涵数量已知达到高峰时,SNpc, 为磷酸化α-syn 夹杂物的确认 5。包含轴承神经元, 如免疫组织化学染色的 pSyn (材料表中的抗体) 显示存在于 Snpc (图 7), 以及整个大脑的其他区域, 神经纹状体 (前嗅觉核, 运动, 扣状, 虹膜, 初步, 体感, 内皮, 和岛屿皮质, 杏仁核, 纹状体)1,3, 4, 5,19。这些内含物与 Lewey 体具有相似的性质, 如结合硫代黄素 S, 以及总α-syn 对蛋白酶 K 的抵抗力 (图 7), 如免疫组织化学染色 (材料表中的抗体和蛋白酶 k) 所示).大脑内播种的确认表明, 体内的质量控制已经通过, 以前冻结并从同一批中保存的 Pff 的等价物可以在相同的参数下进行重复, 并在经过验证的长度下进行更大的实验。
图 1.Α-syn 纤维的产生方法.从α-syn 单体中产生纤维所需的步骤概要。单体在4°C 下离心 10分钟 (15, 000 x 克, 4°c)。上清液被转移到干净的管中, 蛋白质浓度是通过280纳米的吸收率或 BCA 检测来确定的。图表显示了人类和老鼠α-赛 n 单体的浓度。列表示组均值, 误差线表示平均值的±1标准误差。在确定蛋白质浓度后, α-syn 单体被稀释, 短暂涡旋并孵育 37°C 7天, 而在设置为 1, 000 RPM 的轨道混合器上晃动。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2.透射电子显微镜的染色方法.电子显微镜阴性染色示意图。A)描绘电子显微镜样品网格的图像。网格有一个沉闷或轻的一面和一个闪亮或黑暗的一面。在薄片/黑暗面上涂有一种双碳支撑膜。B)染色程序的说明。网格在 Ddh2o的第一滴上漂浮着闪亮的--阴暗面, 时间为 1分钟, 多余的带有滤纸是邪恶的。该过程重复与第二滴 ddH 2o,稀释的 pff 或单体, 两滴醋酸铀, 和另外两滴 dh2o.网格可以存储在一个网格盒, 直到成像。刻度栏 = 3 毫米. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.定制玻璃针管的组装.组装玻璃针头连接注射器所需步骤的示意图。硅化玻璃毛细管被拉扯和削减在中间, 以产生玻璃针。收缩包管用于准备金属针, 并在玻璃针滑到金属针上时形成内封。另外两层收缩包裹管重叠的底部的玻璃针和金属针连续添加和热应用, 以确保玻璃针, 并形成防水密封。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4.通过透射电子显微镜对α-syn 单体和α-syn 纤维进行可视化 .具有代表性的α-赛恩单体和纤维的显微图像。顶部面板: 鼠标和人α-syn 单体。中间面板: 全长小鼠和人α-syn Pff. 底部面板: 老鼠和人α-syn Pff 超声。下图: 超声小鼠和人α-syn PFF 长度的分布。刻度柱 = 500 纳米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5.硫代黄素 T 法测定淀粉样蛋白结构.测量来自小鼠和人α-syn 单体和 PFF 样品的荧光信号。左: 来自小鼠α-syn 单体和α-syn Pff 的结果。右: 人类α-syn 单体和α-syn Pff 的结果。每个图形中都显示了一个 dPBS 负控件。所有测量均以相对荧光单位 (RFU) 表示。列表示组均值, 误差线表示平均值的±1标准误差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6.可球化α-syn.库马西染色凝胶图像的沉淀法。根据蛋白质梯子显示的波段约为 14 kDa。左: 鼠标单体和 Pff。右: 人类单体和 Pff。对于所有单体和 PFF 样品, 显示了重新悬浮颗粒 (P) 和上清液 (S)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7.证实α-syn 病理学的大鼠模型中的内含物特征.在注射后2个月时, 从黑质中的代表性显微镜。左: 含有 pSyn 的神经元, 用紫罗兰色进行反污。中: 硫黄素 S 阳性神经元。右: 含有α合成的内含物抗蛋白酶 K. 刻度条 = 50μm. 请点击此处查看此图的较大版本.
Discussion
Α-syn Pff 的生产能够播种神经元并导致莱维身体样的内含物取决于多种因素和步骤。一个关键因素是用于产生纤维的单体需要专门用于纤维化4、9、14、15。如果单体不是为纤维化而配制的, 纤维可能不会形成, 或者形成的纤维可能不会产生α-syn 病理。同样, 单体所处的缓冲液也会影响纤维化。因此, 为了获得最佳效果, 盐浓度应在约 100 mM 氯化钠, pH 值在7.0 至7.3 之间。引入可变性的第一步是确定初始蛋白质含量的方法, 在 A280 测量可能会产生更准确的结果, 因此是首选方法。蛋白质浓度的差异会降低纤维化过程的疗效, 也会改变实验中假定的 PFF 浓度。两者都可能导致播种效率的下降和实验之间的批次变化。
最初的质量控制步骤将确认 Pff 的关键特征, 特别是它们具有纤维状形成 (电子显微镜), 含有淀粉样蛋白结构 (硫代黄素 t 法), 并且是可造的 (沉淀法)。需要注意的是, 硫代黄素 t 检测的结果会随着时间的推移而波动, 并不是对存在的淀粉样蛋白结构量的直接衡量, 相反, 硫代黄素 T 检测只能作为淀粉样蛋白结构存在的指标。样品。硫黄素 T 通常用于体外检测, 如上述检测, 以显示纤维含有淀粉样结构。或者, 硫代黄素 S 用于组织中检测淀粉样蛋白结构, 如图 7所示。关于沉降分析, 结果显示, Pff 主要存在于可球化分数中。由于样品是在变性条件下运行的, 凝胶上存在一个大约 14 kDa 的突出带, 即α-syn 单体的大小。这与在使用原生凝胶或非变性凝胶时 Pff 具有较高分子量的多个波段不同。最后, 所有这些初始质量控制步骤的成功通过并不能保证α-syn 包涵播种活动。因此, 细胞培养实验或一小群注射手术的动物在使用大型实验之前, 应用于测试 Pff 的疗效。
超声速是工艺中的关键一步, 参数将因使用的声纳模型而异。必须应用和验证声参数, 以证明已生成了较短的 PFF 片段。纤维的大小对播种有影响, 较短的纤维播种效率更高。虽然较短的纤维种子更有效, 这种效果高原和最佳的 pff 长度约为50纳米4,18。同样重要的是, 不要对样品进行过长的处理, 并使 Pff 暴露在过热的环境中, 因为这可能会降低播种效率。在大规模实验中使用之前, 应测试这些超声 Pff 在小细胞培养或体内实验中的有效性。由于不同的超声检查有可能引入变异性, 因此应相应地规划实验治疗组。
在体内提供 pff 时, 注射部位的定位和使用的 pff 总量会影响产生夹杂物的神经元数量以及神经退行性变的程度 7,14。协议中的坐标提供了一个起点, 但应该在实验室内进行测试, 以确保所需的目标区域在大规模实验中使用之前发展α-syn 病理学。如果需要, 跟踪染料或荧光磁珠可作为在使用 Pff 之前测试区域定位的一种方式。体内使用的 pff 数量因群体而异, 大多数群体在一个注射部位使用的 pff 总数在5至20μg 之间, 或在两个注射部位1、2、3、4、5之间进行划分,6,7.,14. 由于注射部位的数量、注射部位的位置和注射的 pff 的数量会影响核源病的结果和进展, 因此, 在使用该模型之前, 应确定所使用参数的下游结果。测试潜在的干预措施或检查模型的时间特征。
在选择用于测试治疗方法或研究疾病进展的模型时, 应选择所使用的模型, 以最好地回答所提出的问题。并非所有模型都具有 PD 的某些疾病特征, 或提供测试潜在干预措施所需的时间框架。PFF 模型概述了 PD 的主要特征, 如α-syn 病理和神经退行性变, 并可导致轻微的运动损伤。该模型提供了一个可预测的和持久的时间过程, 其中内含物形成前几个月神经退行变。这使得研究人员能够在整个系统核病的长期进展过程中检查和利用不同的阶段。该模型目前和未来的总体应用有望有利于疾病进展和新疗法的发展研究。
Disclosures
约瑟夫·帕特森、开尔文·卢克和卡丽尔·索特威尔目前正在与迈克尔·福克斯基金会签订合同, 以控制 Protios 公司生产的α-syn 材料, 他是 Michael J. fox 的雇员基金会与 Protios 公司签订了生产α-syn 单体的合同。合著者梅金·达菲、劳拉·沃尔皮克利-戴利和尼古拉斯·卡南没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了 Michael J. Fox 基金会、国家神经疾病和中风研究所 (NS099416) 和韦斯顿大脑研究所的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
| Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
| Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
| Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
| Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
| Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
| Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
| Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
| Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
| Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
| Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
| Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
| Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
| ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
| Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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