Summary
इस अनुच्छेद के लक्ष्य के लिए एकलक अल्फा-synuclein, बाद में गुणवत्ता नियंत्रण से तंतुओं के उत्पादन के लिए आवश्यक कदम रूपरेखा है, और vivo में preformed तंतुओं का उपयोग करें ।
Abstract
में का उपयोग करें vivo अल्फा-synuclein preformed तंतुक (α-syn pff) synucleinopathy के मॉडल मॉडल पार्किंसंस रोग synucleinopathy और nigrostriatal अध: पतन के लिए लक्ष्य शोधकर्ताओं के बीच लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है । एक समान, मजबूत α-सिन विकृति को सुनिश्चित करने के लिए α-syn PFF उत्पादन और vivo अनुप्रयोग में मानकीकरण महत्वपूर्ण है । यहां, हम एकलक α-syn से तंतुओं के उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत, बाद तंतुओं गुणवत्ता नियंत्रण कदम है, और चूहों या चूहों में α-syn pffs के सफल तंत्रिकाशल्यक इंजेक्शन के लिए मानकों का सुझाव दिया । एकलक α-syn के साथ शुरू, fibrilization एक 7 दिन ऊष्मायन अवधि के दौरान होता है, जबकि इष्टतम बफर शर्तों, एकाग्रता में मिलाते हुए, और तापमान । पोस्ट-fibrilization गुणवत्ता नियंत्रण अवसादन परख, एक thioflavin टी परख के साथ fibrilization में amyloid रचना के गठन, और इलेक्ट्रॉन fibrilization के सूक्ष्म दृश्य के द्वारा पेलेटेबल fibrilization की उपस्थिति से मूल्यांकन किया है । सफल सत्यापन इन assays का उपयोग कर सफलता के लिए आवश्यक है, जबकि वे PFFs की गारंटी करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, एक PFFS बैच के इस तरह के एकत्रीकरण गतिविधि कोशिका संस्कृति में परीक्षण किया जाना चाहिए या पायलट पशु साथियों में उपयोग करने से पहले, pffs ठीक मानकीकृत शर्तों के तहत sonicated किया जाना चाहिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग कर परीक्षा के बाद की पुष्टि करने के लिए तंतुक लंबाई इष्टतम आकार रेंज के भीतर हैं, ५० एनएम की औसत लंबाई के साथ । PFFs तो सेल संस्कृति मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है या जानवरों में इस्तेमाल किया । रोगविज्ञान द्वारा detectable के लिए immunostaining फ़ॉस्फोरोलेटेड α-syn (psyn; सेरीन १२९) है स्पष्ट दिनों या सप्ताह बाद में सेल संस्कृति और कृंतक मॉडल में, क्रमशः ।
Introduction
बड़े पैमाने पर और प्रगतिशील अल्फा-synuclein (α-सिन) विकृति विज्ञान, और निग्रोस्ट्रीटल अध: पतन-पार्किंसंस रोग (पीडी) मुख्य रूप से दो प्रमुख रोग सुविधाओं द्वारा पोस्टमार्टम की विशेषता है । Wildtype चूहों या चूहों में इंजेक्शन के बाद, α-syn preformed फाइनेल्स (pffs) रोग α-syn के प्रगतिशील संचय प्रेरित है, जो कई के पाठ्यक्रम पर एक प्रकार का पौधा नाइग्रा परस compacta (snpc) डोपामाइन ंयूरॉंस के दीर्घकालिक पतन में परिणाम कर सकते है महीने, साथ ही ज्ञानेंद्रिय घाटे1,2,3,4,5,6। ंयूरॉंस α-syn fibrils को उजागर कर रहे हैं, या तो प्रत्यक्ष इंट्रा इंजेक्शन के माध्यम से या संवर्धित ंयूरॉंस के मीडिया के लिए कहा । जब pffs ंयूरॉंस में ले रहे हैं, pffs करने के लिए अधिनियम "बीज" templating के माध्यम से inclusions के गठन, और अंतर्जात α-सिन का संचय फॉस्फोलयुक्त inclusions में1,7,8, ९। शामिल Lewy निकायों के लिए इसी तरह के गुणों का हिस्सा: α-syn सेरीन १२९ (pSyn), ubiquitin, और p62 पर फॉस्फोलिलेटेड युक्त; एमीलॉयड चतुष्क संरचनाओं के रूप में सकारात्मक thioflavin धुंधला के साथ दिखाया गया है; और proteinase कश्मीर पाचन के लिए प्रतिरोधी रहे हैं1,3,5,7,8,9,10,11, १२। Pff जोखिम की ओर जाता है α-सिन समावेश निर्माण in the प्राथमिक and कुछ अमर ंयूरॉंस in संस्कृति, साथ ही साथ चूहों, चूहों, and गैर मानव वानरों in वीवो1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13। यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि PFFs करने के लिए नेतृत्व नहीं करेगा α-syn सभी सेल संस्कृति मॉडल और कुछ सुसंस्कृत ंयूरॉंस दूसरों की तुलना में बेहतर होगा में शामिल गठन ।
में vivo α-syn PFF मॉडल की एक अंय महत्वपूर्ण विशेषता अलग अनुक्रमिक रोग चरणों है कि कई महीनों में उभरने है । कृंतकों में, intrastriatal इंजेक्शन के बाद, α-सिन समावेश गठन आम तौर पर snpc और कई वल्कुट क्षेत्रों के भीतर 1-2 महीने के भीतर चोटियों । इस एकत्रीकरण शिखर nigrostriatal अध: पतन ≈ 2-4 महीने बाद1,3,5के बाद है । ये अलग रोग चरणों शोधकर्ताओं मंच के साथ जो अध्ययन करने के लिए और रणनीतियों कि 1) कम α-syn एकत्रीकरण, 2) स्पष्ट पहले से ही बनाया α-syn inclusions, और/ Pff मॉडल के रूप में पहले की समीक्षा की6neurotoxicant, ट्रांसजेनिक, और वायरल वेक्टर मध्यस्थता α-syn overexpression मॉडल की तुलना में विशिष्ट फायदे और नुकसान प्रदान करता है । जो मॉडल या दृष्टिकोण लेने के लिए विकल्प है जो मॉडल सबसे अच्छा सवाल जांचकर्ताओं पूछ रहे हैं सूट द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए ।
हालांकि pff मॉडल सफलतापूर्वक कई प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया गया है, वहाँ अभी भी समूहों है कि तंतुओं पैदा करने और लगातार α-syn विकृति14उत्पादन के साथ असंगतताओं का अनुभव किया है । असंगतताओं के उदाहरण pffs से सीमा है कि उत्पादन कम या कोई α-syn विकृति, बैच बोने दक्षता बैच के लिए, और यहां तक कि तंतुओं की विफलता के लिए फार्म का । इस प्रकार, α-syn PFF पीढ़ी और vivo में आवेदन में मानकीकरण के क्रम में उपंयास चिकित्सीय हस्तक्षेप के प्रभाव के बारे में सटीक व्याख्याओं के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है । निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक चरणों की रूपरेखा α-सिन monomers से PFFs के उत्पादन के लिए, में इन विट्रो की गुणवत्ता नियंत्रण PFFs का गठन एक बार, sonication और PFFs के माप का उपयोग करने से पहले, और सुझावों में सफल होने की सुविधा के लिए vivo के इंजेक्शन चूहों या चूहों में PFFs ।
Protocol
सभी जानवरों को शामिल तरीकों मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. एकाकार से ऐल्फ़ा-सिंयूक्लिइन पूर्वनिर्मित तंतुओं का निर्माण (चित्र 1)
- Ice α-synuclein बर्फ पर मोनोमर्स, धीरे ट्यूब flicking द्वारा फिर से निलंबित, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १५,००० x g पर अपकेंद्रित्र ।
नोट: α-syn एकलक विशेष रूप से fibrilization के लिए तैयार किया जाना चाहिए । पुनर्योगिक मोनोमर्स को वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा जा सकता है या4,9,14,15साइट पर प्रोटोकॉलों द्वारा उत्पन्न किया जाता है । यदि वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा है, उत्पाद राज्य चाहिए कि α-syn एकलक विशेष रूप से fibrils की पीढ़ी के लिए है । भले ही मोनोमर्स खरीदा या साइट पर उत्पंन कर रहे हैं, गुणवत्ता नियंत्रण कदम नीचे उल्लिखित प्रत्येक बैच के साथ किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए तंतुओं का गठन किया है और कुशलता से बीज प्रयोगों में उपयोग करने से पहले होगा । - एक स्वच्छ १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रलाइज ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और हस्तांतरित राशि रिकॉर्ड ।
नोट: गोली, जो, अगर वर्तमान, छोटे हो जाएगा से बचने के लिए सावधान रहें । - स्थानांतरित supernatant के प्रोटीन एकाग्रता को मापने या तो एक मानक bicinchoninic एसिड परख (बीसीए), या एक microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ २८० एनएम पर अवशोषण को मापने ।
नोट: BCA परख के रूप में α-syn के विशिष्ट मापन के लिए सही नहीं है और परिणाम प्रोटीन एकाग्रता overestimating कर सकते हैं । नतीजतन, २८० एनएम पर अवशोषण को मापने प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए सिफारिश की विधि है ।- BCA परख के साथ मापने के लिए, मानक BCA प्रोटोकॉल का पालन करें और α-syn monomer के तीन अलग dilutions के साथ प्रदर्शन करते हैं । सुझाया dilutions रहे है 1:25, 1:50, और 1:100 ।
- A280 विधि के साथ मापने के लिए, खाली रीडर के साथ 1x Dulbecco फॉस्फेट buffered खारा (dPBS) कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना, लगभग १०० मिमी NaCl के एक नमक एकाग्रता के साथ, और पीएच सीमा 7.0-7.3 (सामग्री की मेज).
- पाठक के लिए नमूना के 2 μL जोड़ें और २८० एनएम पर अवशोषण पढ़ें ।
- मोनोमर्स की सांद्रता निर्धारित करने के लिए बीयर-लैम्बर्ट नियम का उपयोग करें ।
नोट: मानव α-syn के लिए विलोपन गुणांक ε ५,९६० उ-1बउ-1 तथा माउस α-सिन के लिए ७,४५० उ1बउ-1है । पथदैर्ध्य को सीएम में मापा जाता है । α-सिन (14 केडीए) के आण्विक भार का अनुमान 1 दा = 1 ह/मोल मान लीजिए ।
- 5 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए 1x dPBS के साथ मोनोमर्स पतला । नीचे दिए गए समीकरण का प्रयोग करें 1x dPBS की राशि की गणना करने के लिए मोनोमर्स पतला जोड़ा ।
नोट: सभी सांद्रता मिलीग्राम/एमएल में हैं, और संस्करणों में μL. Monomer dilutions 1x dPBS के साथ किया जाना चाहिए. कुल मात्रा तंतुओं उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया १०० और ५०० μl के बीच होना चाहिए reproducible तंतुओं परिणाम प्राप्त करने के लिए । - संक्षेप भंवर मिश्रण करने के लिए, और अपकेंद्रित्र ट्यूब के तल पर सभी तरल इकट्ठा करने के लिए । के रूप में कदम 1.8.1-1.8.4 में संकेत के रूप में तंतुओं के साथ गुणवत्ता नियंत्रण तुलना के लिए aliquot मोनोमर्स ।
- माइक्रोसेंट्रलाइज ट्यूब का ढक्कन बंद कर सुरक्षित करने के लिए ट्यूब लॉक या वैक्स/प्लास्टिक फिल्म (सामग्रियों की टेबल) का इस्तेमाल करें ।
- ट्यूब एक कक्षीय thermomixer में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए एक ढक्कन के साथ रखें, १,००० RPM (सामग्री की मेज) पर मिलाते हुए ।
नोट: 7 दिनों के अंत में, ट्यूब की सामग्री turbid दिखाई देनी चाहिए । Thermomixer एक ढक्कन ट्यूब lids पर संघनन गठन को रोकने के लिए होना चाहिए । - ऐल्फ़ा-सिन तंतुओं को पुन: निलंबित करने के लिए नली को धीरे से फ्लिक करें । Aliquot तंतुओं चरण 1.8.1-1.8.4 में इंगित किया गया के रूप में निम्न गुणवत्ता नियंत्रण चरणों के लिए ।
नोट: गुणवत्ता नियंत्रण कदम के लिए Fibrils आरटी रात में संग्रहित किया जा सकता है ।- अवसादन परख के लिए aliquot 6 μL ।
- Thioflavin टी बाध्यकारी परख के लिए aliquot 5 μL ।
- तंतुक दृश्य के लिए संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए aliquot 2 μl ।
- एंडोटॉक्सिन परख के लिए कम से 10 μL aliquot ।
नोट: इंडोटॉक्सिन परख के लिए, एक वाणिज्यिक लिमलस अमेबोसाइट Lysate (लाल) का उपयोग किया जाता है, निर्माता के निर्देशों का पालन (सामग्री की तालिका) । अंतःविष का स्तर ≤ ०.५ endoआविष इकाइयों/ एक एंडोटॉक्सिन हटाने किट अगर इस कसौटी पर नहीं मिला है इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- शेष तंतुओं और स्टोर aliquot । दीर्घकालिक भंडारण के लिए (12-18 महीने), सूखी बर्फ पर तेजी से फ्रीज, और दुकान पर-८० डिग्री सेल्सियस ।
नोट: aliquot करने के लिए राशि वांछित डाउनस्ट्रीम आवेदन पर निर्भर करता है । Vivo में उपयोग आमतौर पर विट्रो उपयोग की तुलना में अधिक सांद्रता में अधिक तंतुओं की आवश्यकता है, और aliquot संस्करणों तदनुसार योजना बनाई जानी चाहिए । Fibrils फ्रीजर के पीछे की ओर संग्रहीत किया जाना चाहिए करने के लिए संभावित फ्रीज से नुकसान को रोकने/ यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है ।
2. अवसादन परख
- एक साफ माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में, pff के 6 μl जोड़ने के लिए dpbs के ५४ μl तंतुओं 1:10 को कमजोर करने के लिए, और पिपेट मिश्रण करने के लिए ।
- एक अलग ट्यूब में, एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में dpbs के ५४ μl करने के लिए एकलक के 6 μl जोड़ें ।
- RT पर 30 मिनट के लिए १०,००० x जी में केंद्रान्तरण नमूने और एक साफ माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण ।
- शेष गोली और भंवर को resuspend करने के लिए dPBS के ६० μL जोड़ें ।
- मिश्रण करने के लिए प्रत्येक ट्यूब और भंवर करने के लिए 3x नमूना बफर के 30 μl (१४० μl ५०% ग्लिसरॉल/0.1% ब्रोमोफीनॉल नीला, ४० μl 10% एसडीएस, और β-mercaptoethanol के 20 μl) जोड़ें ।
- 10 मिनट के लिए १०० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों सेबेट और बर्फ पर 5 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- एक मानक सोडियम डोडेनिल सल्फेट-polyacrylamide जेल का उपयोग करें इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) प्रोटोकॉल द्रव्यमान द्वारा प्रोटीन को अलग करने के लिए । एक प्रोटीन सीढ़ी का उपयोग करें जिसमें 14 केडीए (मोनोमेरिक α-सिन के लिए अपेक्षित आकार बैंड) शामिल हैं ।
- एक धुंधला पकवान में जेल स्थानांतरण और coomassie नीले दाग के साथ जेल को कवर (०.१% coomassie शानदार नीले, 20% मात्रा से मेथनॉल, और 10% मात्रा द्वारा एसिटिक एसिड ddh2हे में) । मिलाते समय आरटी में 3 एच के लिए सेबेट ।
- बंद Coomassie नीले दाग डालना और पर्याप्त destain जोड़ने (५०% मात्रा से मेथनॉल, और 10% में मात्रा द्वारा एसिटिक एसिड ddH2हे) जेल को कवर करने के लिए । आर टी पर 30 मिनट के लिए इंक्यूबेट जबकि मिलाते हुए ।
- बंद destain डालो और destain कदम दोहराने जब तक जेल स्पष्ट है और बैंड दिखाई दे रहे हैं ।
- 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार जेल धोने ddH2O में मिलाते हुए और जेल छवि ।
3. तंतुक विज़ुअलाइज़ेशन के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
- एक माइक्रोसेंट्रलाइज ट्यूब में यूरेनिल एसीटेट के 20 मिलीग्राम वजन और ddh2O के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक 2% जलीय घोल बनाने के लिए । भंवर जब तक यूरेनिल एसीटेट समाधान में है, और रात भर बैठने के लिए अनुमति देते हैं ।
नोट: Uranyl एसीटेट ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने तैयार करने से पहले दिन बनाया जाना चाहिए । प्रकाश या आंदोलन के लिए जोखिम यूरेनिल एसीटेट के लिए वेग पैदा कर सकते हैं, इस तरह के रूप में, यूरेनिल एसीटेट समाधान युक्त ट्यूब एल्यूमीनियम पंनी में शामिल किया जाना चाहिए, एक अंधेरी जगह में रखा, और यूरेनिल एसीटेट के बाद हिल नहीं समाधान में है । - Pff के 2 μl जोड़ने के लिए dpbs के ९८ μl तंतुओं 1:50 तनु, और फिर मिश्रण करने के लिए पिपेट ।
- एक क्लीन वैक्स/प्लास्टिक फिल्म (सामग्री की तालिका) कवर सतह (लगभग ५० मिमी x ५० मिमी) बेंच टॉप पर तैयार करें । क्लीन वैक्स/प्लास्टिक फिल्म (सामग्री की तालिका) पर, निंनलिखित जोड़ें (चित्रा 2) ।
- DdH2O के 4 x 10 μl बूंदें जोड़ें ।
- पतला तंतुओं या मोनोमेर नमूना के 1 x 10 μl ड्रॉप जोड़ें ।
- 2% यूरेनिल एसीटेट की 2 x 10 μl बूंदें जोड़ें ।
- एक फार्मवर/कार्बन कोटेड, मेश कॉपर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड (सामग्रियों की तालिका) लेने के लिए फाइन-इत्तला संदंश का प्रयोग करें ।
नोट: केवल किनारे से ग्रिड लेने के लिए सुनिश्चित हो, केंद्र में जाल भाग से परहेज (चित्रा 2ए). यदि संदंश जाल को छूते हैं, तो फार्मवर/कार्बन कोटेड फिल्म क्षतिग्रस्त हो जाएगी, जिससे ग्रिड के उस क्षेत्र में इमेजिंग असंभव हो जाएगा । - डीडीएच2ओ की पहली बूंद पर ग्रिड फार्मवर/कार्बन कोटेड साइड (चमकदार ओर) को फ्लोट करें । धीरे से ग्रिड पकड़ और नीचे पुश करने के लिए पूरी लेपित सतह ddh2o के साथ संपर्क में है यह सुनिश्चित करने के लिए संदंश का उपयोग । ग्रिड को 1 मिनट के लिए तैरने दें ।
- ग्रिड उठाओ, और ग्रिड के जाल भाग को छूने के बिना, दूर डीडीएच फिल्टर कागज के साथ2ओ बाती ।
- 1 मिनट के लिए ddH2o की दूसरी बूंद पर ऊपर के रूप में ग्रिड फ्लोट और ddh2o दूर बाती ।
- 1 मिनट के लिए पतला तंतुओं की बूंद पर ग्रिड फ्लोट और ऊपर के रूप में अधिक दूर बाती ।
- 1 मिनट के लिए यूरेनिल एसीटेट की पहली बूंद पर ग्रिड फ्लोट और अधिक दूर बाती ।
- 1 मिनट के लिए यूरेनिल एसीटेट की दूसरी बूंद पर ग्रिड फ्लोट, अधिक दूर बाती ।
- ऊपर के रूप में ddH2o के तीसरे ड्रॉप पर ग्रिड फ्लोट संक्षिप्त और ddh2o दूर बाती ।
- ऊपर के रूप में ddH2o के चौथे ड्रॉप पर ग्रिड फ़्लोट करें और ddh2o दूर बाती, के रूप में ज्यादा ddh2o के रूप में संभव के रूप में दूर करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है ।
- इमेजिंग तक भंडारण के लिए एक ग्रिड बॉक्स में स्थानांतरित करें ।
नोट: ग्रिड इमेजिंग से पहले कम से 5 मिनट के लिए सूखी चाहिए । ग्रिड को तैयार करने के बाद एक साल के लिए imaged किया जा सकता है और एक शुष्क वातावरण में रखा जाना चाहिए ।
4. thioflavin टी परख
- एक साफ माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में, pff के 5 μl जोड़ने के लिए dpbs के २४५ μl तंतुओं 1:50 को कमजोर करने के लिए, और पिपेट मिश्रण करने के लिए ।
- एक अलग microcentrifuge ट्यूब के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए dPBS के २५० μL जोड़ें ।
- मोनोमेर नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए dPBS के २४५ μL में मोनोमेर के 5 μL जोड़ें ।
- Glycine बफर में thioflavin टी के २५० μL जोड़ें (25 μM thioflavin टी, १०० मिमी glycine, 1% ट्राइटन एक्स-१००, पीएच ८.५) प्रत्येक नमूना और धीरे मिश्रण करने के लिए.
- Pipet 2, २०० μL एक, एक काला ९६ अच्छी तरह से थाली में replicates । फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए थाली को अंधेरे में रखें ।
- RT पर 1 ज के लिए सेक्यूबेट और ४५० एनएम के एक उत्तेजना और ५१० एनएम के उत्सर्जन का उपयोग कर थाली पढ़ें ।
नोट: Thioflavin टी रीडिंग समय के साथ उतार चढ़ाव होगा । नमूने एक ही ऊष्मायन समय पर पढ़ा जाना चाहिए । यदि वांछित, कई रीडिंग घंटे ऊष्मायन के दौरान लिया जा सकता है और समय के साथ साजिश रची ।
5. Sonication के α-सिंयूक्लिन पूर्वनिर्मित तंतुओं
चेतावनी: sonicator और सभी sonication कदम तंतुओं कि sonication के दौरान aerosolize सकता है के लिए जोखिम को रोकने के लिए एक संस्कृति हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं । Sonication चरणों का प्रदर्शन कर रहे कर्मियों को एक प्रयोगशाला कोट के रूप में दस्ताने, कपड़े संरक्षण, और एक चेहरा ढाल, जबकि sonicating सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना चाहिए । तंतुक जोखिम का खतरा एक कप सींग sonicator के साथ sonicating द्वारा कम किया जा सकता है, के लिए sonication के दौरान बंद रहना फाइब्रिल्स युक्त ट्यूब की अनुमति ।
नोट: तंतुओं के इष्टतम sonication मापदंडों इस्तेमाल किया sonicator के मॉडल पर निर्भर हैं । इस कारण से, कुछ अनुकूलन के लिए किया जा करने की आवश्यकता होगी सुनिश्चित करने के लिए तंतुओं सही आकार रहे हैं । इस्तेमाल किया sonicator सामग्री की मेज में पाया जा सकता है और रेखांकित मापदंडों sonicator के इस मॉडल के साथ पिछले परिणामों पर आधारित हैं । नीचे दिए गए पैरामीटर, समाधान के 200-400 μL में PFFs के 2-4 μg/μL के लिए काम करेंगे । उपकरण के साथ परीक्षण sonication प्रदर्शन किया जाना चाहिए और तंतुओं वांछित परिणाम सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण प्रयोगों में pffs के उपयोग करने से पहले प्राप्त कर रहे हैं ।
- कनवर्टर करने के लिए एक ३.२ मिमी व्यास जांच (सामग्री की तालिका) संलग्न है, और चरण 5.1.1-5.1.3 में नीचे कहा गया के रूप में sonicator मापदंडों सेट करें ।
- आयाम 30% करने के लिए सेट करें ।
- पल्स सेट करने के लिए ०१ ०१ (1 s पर; 1 s बंद).
- 0:01:00 करने के लिए समय सेट करें ।
नोट: स्पंदन के 1 मिनट ६० दालों के लिए equates, और sonicator के इस मॉडल (सामग्री की मेज) स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा । अन्य sonicator मॉडल के साथ, दालों की संख्या की गणना करने की आवश्यकता होगी.
- आरटी में पिघलना तंतुओं और एक संस्कृति हुड में बाँझ dpbs के साथ तनु ।
नोट: एक स्पष्ट ०.६ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रलाइज ट्यूब sonication के लिए सबसे अच्छा काम करता है और अंतिम तंतुक एकाग्रता इरादा उपयोग पर निर्भर करता है । प्रतिनिधि दिखाया परिणाम 4 μg/μL की एक अंतिम तंतुक एकाग्रता से कर रहे हैं । - एक प्रयोगशाला ७०% इथेनॉल से जांच साफ करने के साथ घटा ऊतक के साथ sonicator की जांच पोंछ । जांच की टिप को डीडीएच2ओ और पल्स में 10 बार आगे की सफाई के लिए जलमग्न करें, और फिर एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ सूखी पोंछ ।
- जांच टिप पतला fibrils की ट्यूब में रखें, और ट्यूब के तल पर टिप की स्थिति ।
- ६० दालों के लिए sonicate (1 एस पर; 1 एस ऑफ) । प्रत्येक नाड़ी के दौरान जांच ऊपर और नीचे ले जाएँ तरल में फाइब्रिल्स के सभी सुनिश्चित करने के लिए sonicated हैं । और साफ ।
- ६० दालों के बाद, pffs से जांच को हटा दें, और pffs के 2 μl जोड़ने के लिए ९८ μl dpbs की एक साफ microcentrifuge ट्यूब में करने के लिए कम तंतुओं ils के लिए sonicated फाइब्रिल माप के लिए इलेक्ट्रॉन microscopy द्वारा ।
नोट: आदर्श रूप में, तंतुओं के एक छोटे सबसेट को vivo इंजेक्शन में पहले मापा जाना चाहिए और जब समय परमिट प्रदर्शन तंतुओं के एक अधिक व्यापक माप । - Sonication के बाद, संक्षेप में 1 एस के लिए २,००० x g पर अपकेंद्रित्र pffs ट्यूब के पक्षों से सभी तरल इकट्ठा करने के लिए ।
चेतावनी: यदि ट्यूब स्पर्श करने के लिए गर्म हो जाता है, 30 दालों के बाद sonicating बंद करो, 1 मिनट रुको, और अंतिम 30 दालों के लिए sonicating ।
नोट: जबकि sonicating, प्रत्येक पल्स के शुरू में तरल के नीचे की ओर जांच टिप रखने के लिए, भी तरल के शीर्ष के पास नमूना नुकसान का कारण होगा । - 1% एसडीएस और पल्स में जांच टिप डूब 10 बार जांच को साफ करने के लिए । एसडीएस से टिप निकालें, ddH2O और नाड़ी 10 बार में डूब ।
- एक प्रयोगशाला ७०% इथेनॉल के साथ घटा ऊतक के साथ जांच पोंछ, और फिर एक सूखी प्रयोगशाला ऊतक के साथ जांच पोंछ । कनवर्टर और स्टोर से जांच अलग ।
- 1% एसडीएस, ७०% इथेनॉल के बाद के साथ हुड में सभी सतहों नीचे पोंछ ।
नोट: 1% एसडीएस समाधान तंतुओं और साफ सतहों और उपकरणों को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है16.
6. sonicated फाइब्रिल्स के मापन के लिए पारेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
नोट: यदि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संभव नहीं है, एक thioflavin टी कैनेटीक्स परख, और गतिशील प्रकाश बिखरने दक्षता बोने के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और तंतुक आकार4,14।
- ऊपर "इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए तंतुक विज़ुअलाइज़ेशन" अनुभाग से प्रोटोकॉल का उपयोग कर नमूने तैयार करें ।
- एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए 6 से 10 विभिंन ग्रिड के उद्घाटन से फाइल्स की एक छवि ले ।
नोट: छवियों के लिए एक उच्च पर्याप्त एक तंतुओं उपाय इज़ाफ़ा होना चाहिए, लेकिन काफी कम करने के लिए कई तंतुओं एक साथ कल्पना । लगभग 75, 000x की एक अंतिम आवर्धन पर्याप्त होना चाहिए । - एक प्रयोग में फाइबुल्स का उपयोग करने से पहले कम से 25 तंतुओं के एक छोटे सबसेट की लंबाई को मापने ।
नोट: इन माप आमतौर पर इमेजिंग माइक्रोस्कोप के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है । त्वरित सत्यापन के लिए, मापने व्यक्ति प्रतिनिधि तंतुओं का चयन करें और औसत आकार की गणना करनी चाहिए । Fibril लंबाई के आसपास ५० एनएम या कम औसत चाहिए, एक अधिक सटीक माप के साथ पालन करने के लिए । - अधिक व्यापक परिणाम के लिए 500 + तंतुओं की लंबाई को मापने ।
नोट: माइक्रोस्कोप से जुड़े इमेजिंग सॉफ्टवेयर को फाइनिल मापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, छवियों को खोला और तंतुओं छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ मापा जा सकता है, पैमाने पर एक आकार संदर्भ के रूप में एक छवि के साथ जुड़े बार का उपयोग कर, जिसके साथ तंतुओं लंबाई की तुलना करने के लिए ।
7. स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के लिए कस्टम ग्लास सुई सीरिंज की तैयारी (चित्रा 3)
- लगभग 10 मिलीलीटर सिलिकोनाइजिंग अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) को एक स्वच्छ ५० मिलीलीटर बीकर में जोड़ें ।
- जगह ग्लास केशिका ट्यूब (५४ मिमी की लंबाई, बाहरी व्यास: ०.८६ मिमी; भीतरी व्यास ०.५९ मिमी) सिलिकोनाइजिंग अभिकर्मक के बीकर में खड़ी है और केशिका कार्रवाई की अनुमति के लिए नीचे ट्यूब खोलने सिलिकानीकरण अभिकर्मक
- ऊपरी ट्यूब खोलने कि सिलिकोनाइजिंग अभिकर्मक में पूरी तरह से ग्लास केशिका ट्यूब को भरने के लिए जलमग्न नहीं है में pipet अतिरिक्त सिलिकोनाइजिंग अभिकर्मक ।
- केशिका ट्यूबों सिलिकोनाइजिंग अभिकर्मक से निकालें और एक कागज तौलिया पर ट्यूबों के खुले सिरों धब्बा ट्यूबों में सिलिकोनाइजिंग अभिकर्मक को दूर करने के लिए । केशिका ट्यूबों के लिए सूखी अनुमति दें कम से 8 घंटे ।
- एक ग्लास सुई खींचने (सामग्री की मेज) में एक सिलिकोराइज्ड ग्लास केशिका ट्यूब रखें ।
- हीटिंग तत्व पर मुड़ें और संलग्न वजन की अनुमति के लिए गर्म ग्लास केशिका ट्यूब खिंचाव ।
- बीच में पतले बिंदु पर कैंची से खींचा ग्लास केशिका ट्यूब कट और ग्लास सुई खींचने से गिलास सुई हटा दें ।
नोट: खींचा सुई इनर और बाहरी व्यास लगभग ८० और १०० μm, क्रमशः होना चाहिए । एकाधिक गिलास सुई एक समय में बनाया जा सकता है और संलग्न धातु सुई (सामग्री की मेज) के साथ एक गिलास सिरिंज के लिए संलग्न करने के लिए तैयार जब तक संग्रहीत । - हटना लपेटो ट्यूबिंग की लंबाई में कटौती (औसत भीतरी व्यास ०.०२१ "और औसत दीवार मोटाई ०.००१") के लिए लगभग ४० mm कैंची के साथ । एक 10 μL beveled सिरिंज की धातु सुई पर हटना लपेटो स्लाइड (सामग्री की मेज) ।
- गर्मी और समान रूप से गर्मी लागू करने के लिए सुई घूर्णन जबकि सुई करने के लिए हटना लपेटो का पालन करने के लिए एक खुली लौ का प्रयोग करें ।
- खींचा ग्लास सुई का बड़ा अंत ध्यान से सिरिंज की धातु सुई पर स्लाइड.
- हटना लपेटो ट्यूबिंग की लंबाई में कटौती (औसत भीतरी व्यास ०.०३६ "और औसत दीवार मोटाई ०.००५") करने के लिए लगभग ४० mm कैंची के साथ और कांच की सुई पर ध्यान से स्लाइड करने के लिए ग्लास सुई के आधार और सिरिंज की धातु सुई पर ओवरलैप (तालिका सामग्री) । कांच की सुई को धातु की सुई से सुरक्षित करने के लिए सिकुड़न-लपेट को गर्म करने के लिए खुली लौ का उपयोग करें ।
- कांच की सुई को सुरक्षित करने के लिए सिकोड़ें-रैप की एक अतिरिक्त परत जोड़ें । हटना लपेटो ट्यूबिंग की लंबाई में कटौती (औसत भीतरी व्यास ०.०४४ "और औसत दीवार मोटाई ०.००५") करने के लिए लगभग ४० mm कैंची के साथ और कांच की सुई पर ध्यान से स्लाइड करने के लिए ग्लास सुई के आधार और सिरिंज की धातु सुई पर ओवरलैप (तालिका सामग्री) । कांच की सुई को धातु की सुई से सुरक्षित करने के लिए सिकुड़न-लपेट को गर्म करने के लिए खुली लौ का उपयोग करें ।
- कैंची के साथ गिलास सुई इतना है कि टिप लगभग 8 मिमी लंबी है ट्रिम कर दीजिए ।
नोट: सुई वांछित मस्तिष्क क्षेत्रों (आवश्यक लंबाई पृष्ठीय/अधर निर्देशांक पर निर्भर है) को लक्षित करने के लिए पर्याप्त समय होने की जरूरत है. - का प्रयोग करें कदम 7.14.1-7.14.3 सुई का परीक्षण करने के लिए बीमा वहां कोई लीक कर रहे है और वहां दोनों वापस लेने और गिलास सुई से तरल वितरण में पर्याप्त प्रवाह है ।
- डीएच2ओ के साथ संलग्न 26 गेज सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें ।
- कस्टम ग्लास सुई सिरिंज से धातु प्लंजर निकालें और dH2ओ भरी सिरिंज की सुई को सिरिंज के बेस में डालें । कांच की सुई से डीएच2ओ को बांटने का दबाव लगाएं । कांच की सुई के इंटरफेस का निरीक्षण और लीक के लिए धातु सुई और एक स्थिर dH2हे प्रवाह की पुष्टि करें ।
नोट: यदि आवश्यक हो, गिलास सुई प्रवाह की आसानी बढ़ाने के लिए छंटनी की जा सकती है और हटना लपेटो के अतिरिक्त परतों ग्लास सुई के आधार से किसी भी लीक पैच करने के लिए जोड़ा । - DH2ओ के साथ एक microcentrifuge ट्यूब भरें. डीएच2ओ में ड्रा करने के लिए कस्टम ग्लास सुई सिरिंज का उपयोग करें. सुई की पुष्टि करने के लिए निरीक्षण करने के लिए तरल सिरिंज में लिया जा रहा है और कि वहाँ कोई बुलबुले हैं.
नोट: यदि बुलबुले या डीएच2ओ सुई में तैयार नहीं किया जा रहा है, सुई trimming दबाव को कम करने में मदद कर सकते हैं ।
- ध्यान से सर्जरी के लिए आवश्यक जब तक सिरिंज बक्से में संलग्न गिलास सुई के साथ सिरिंज की दुकान ।
- चूहों में अनुकूलित निर्देशांक में PFFs के intrastriatal प्रसव के लिए मानक stereotaxic सर्जरी के तरीकों का प्रयोग करें (एक साइट: एपी + ०.२ मिमी और एमएल + २.० mm से bregma, डीवी-२.६ dura से mm) या चूहों में (दो साइटें: एपी + १.६ mm और एमएल + २.० मिमी से bregma, डीवी-४.० ड्यूरा से; एपी + ०.१ mm और एमएल + ४.२ mm से bregma, डीवी-५.० dura से)1,14,17।
नोट: इन निर्देशांक C57BL6 में इस्तेमाल किया गया है/C3H चूहों और फिशर ३४४ चूहों. जब अंय उपभेदों का उपयोग कर, निर्देशांक अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
Representative Results
Α-सिन मोनोमर्स से फाइनेल्स का उत्पादन मोनोमर्स की सांद्रता निर्धारित करने के साथ शुरू होता है । दोनों बीसीए परख और २८० एनएम (A280) पर अवशोषण की माप के लिए प्रोटीन की सामग्री को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; बीसीए परख परिणाम, तथापि, A280 विधि की तुलना में एक उच्च एकाग्रता का सुझाव दिया । माउस α से व्युत्पन्न pffs-syn एकलक १४.०५ ± ०.२२ की एक बीसीए मूल्य और ८.०५ ± ०.०३ μg/μl के एक A280 था (चित्रा 1) । इसी तरह, मानव α-syn एकलक से व्युत्पंन pffs भी एक उच्च एकाग्रता में दिखाई दिया, १२.९५ ± ०.३८ की एक बीसीए मूल्य और ७.८३ ± ०.०५ μg/ A280 मापन α-syn के लिए विशिष्ट है विलुप्त होने गुणांक के शामिल किए जाने के आधार पर और इन परिणामों के लिए 7 दिवसीय ऊष्मायन से पहले मोनोमर्स को कमजोर करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।
ऊष्मायन से पूर्व ऐल्प़्फा़ा-सिन मोनोमर्स युक्त द्रव स्पष्ट था, परंतु उसे तंतुक निर्माण के बाद ही प्रकट होना चाहिए । संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ परीक्षा लंबे समय फाइल्स की उपस्थिति की पुष्टि की, मापने 10-20 एनएम वाइड (चित्रा 4) । इसकी तुलना में α-सिन मोनोमर्स बमुश्किल दृश्यमान आकृति स्पष्ट नहीं थे (चित्र 4) । रेशकीय संरचनाओं के दृश्य पुष्टि के साथ, तंतुओं के amyloid रचना pffs की अगली विशेषता है कि एक thioflavin टी परख का उपयोग करने की पुष्टि करनी चाहिए है । Thioflavin टी जब एमीलॉयड के लिए बाध्यकारी प्रतिदीप्ति बढ़ाया प्रदर्शित; इस प्रकार, नमूनों से बढ़ी हुई फ्लोरोसेंट संकेत एमिलॉयड की उपस्थिति को दर्शाता है । एक उदाहरण के रूप में, dpbs में thioflavin ३,२८७ ± ५८० रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों (rfu), माउस α-syn एकलक ४,१७४ ± १५८ rfu के एक संकेत का उत्पादन किया, और माउस pffs के एक संकेत का उत्पादन ५९,७५४ ± ६,२२४ rfu (चित्रा 5) के एक संकेत का उत्पादन किया । इसकी तुलना में, मानव α-syn एकलक ४,१५८ ± १०५ rfu के एक समान संकेत के लिए माउस एकलक का उत्पादन किया, और मानव pffs के एक उच्च संकेत का उत्पादन १,२३५,९६७ ± ११३,७४७ rfu के रूप में माउस pffs की तुलना में (चित्रा 5) । पेलेटेबल फाइवल्स की उपस्थिति का आकलन करने के लिए, एक अवसादन परख किया गया था । Fibrils केंद्रायन के साथ गोली जाएगा । माउस और ह्यूमन पीएफएफ के नमूनों दोनों में सुपरनैंट के अंश में पेलेट में सुपरनेटंट (अंक 6) से अधिक प्रोटीन होना चाहिए । इसके विपरीत, चूहे और मानव मोनोमर्स से प्रोटीन के बहुमत supernatant में मौजूद था, के साथ कम गोली में मौजूद (चित्रा 6) । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई PFFs के साथ, amyloid संरचनाओं मौजूद है, और फाइल्स pelletable, PFFs सभी इन विट्रो गुणवत्ता नियंत्रण कदम पारित कर दिया ।
दोनों माउस और मानव pffs को α-सिन बीजारोपण4,18बोने के लिए उपयुक्त लंबाई की pffs का उत्पादन sonicated थे । PFFs 4 μg/μL और sonicated की वांछित एकाग्रता को पतला किया गया । सर्जरी के तुरंत पहले, 25 प्रतिनिधि तंतुओं इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged और तंतुओं आकार की जांच हाजिर करने के लिए मापा गया । Sonicated माउस PFFs मापा ४८.८ ± ३.१ एनएम, जबकि मानव PFFs मापा ५२.१ ± ४.४ लंबाई में एनएम; दोनों प्रजातियों में से PFFs इसलिए उपयुक्त लंबाई (५० एनएम या उससे कम) बोने गतिविधि प्रेरित थे । लगभग ५०० तंतुओं की अधिक व्यापक परीक्षा औसत लंबाई और sonicated माउस तंतुओं की लंबाई वितरण से पता चला । औसत लंबाई ४४.४ ± ०.६ एनएम था, ८६.६% की PFFs मापने के साथ ६० एनएम या कम (चित्रा 4) । इसकी तुलना में, मानव PFFs का औसत ६० एनएम या इससे कम (चित्रा 4) को मापने pffs के ६९.६% के साथ ५५.९ ± १.१ एनएम ।
के रूप में पहले वर्णित3,5, ऊतक वर्गों की एक श्रृंखला के रूप में चूहों में sonicated माउस pffs के intrastriatal इंजेक्शन के बाद 2 महीने में संसाधित किया गया सर्जरी, जब शामिल किए जाने की संख्या ंयूरॉंस युक्त में चोटी के लिए जाना जाता है एसएनपीसी ने फॉस्फोलनीकृत α-सिन के पुष्टीकरण के लिए5का समावेशन किया । अंतर्वेशन असर ंयूरॉंस, के रूप में immunohistochemical के लिए धुंधला द्वारा संकेत ( सामग्री की तालिकामें एंटीबॉडी) snpc के भीतर मौजूद है (चित्रा 7), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मस्तिष्क में अंय क्षेत्रों में जो striatum अंदर आना (पूर्वकाल घ्राण नाभिक, मोटर, सिंगोलेट, पिरीफार्म, prelimbic, सोमेटोसंवेदी, entorhinal, और द्वीपीय cortices, amygdala, striatum)1,3,4,5,19। ये inclusions के रूप में Lewy निकायों, के साथ समान गुण साझा करें thioflavin S बंधन, और प्रतिरोध के लिए कुल α-syn के proteinase K (चित्रा 7), के रूप में immunohistochemical धुंधला द्वारा दिखाया गया (एंटीबॉडी और Proteinase कश्मीर सामग्री की तालिकामें) . मस्तिष्क के भीतर बोने की पुष्टि vivo गुणवत्ता नियंत्रण में पारित किया गया है इंगित करता है, और पहले से जमे हुए और एक ही बैच से बचाया PFFs के aliquots लंबाई मान्य के साथ एक समान मापदंडों के तहत sonicated किया जा सकता है, बड़े प्रयोगों में.
चित्रा 1 . Α-सिन तंतुओं की पीढ़ी के लिए विधियाँ । Α-सिन मोनोमर्स से फाइबुल्स का उत्पादन करने के लिए आवश्यक चरणों की रूपरेखा । मोनोमर्स 10 मिनट (१५,००० x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए अपकेंद्री होते हैं । Supernatant एक साफ ट्यूब को हस्तांतरित कर दिया है और प्रोटीन एकाग्रता या तो २८० एनएम, या एक बीसीए परख पर अवशोषण द्वारा निर्धारित किया जाता है । ग्राफ मानव और माउस α-syn monomers से सांद्रता से पता चलता है । स्तंभों से संकेत मिलता है कि समूह का अर्थ है, त्रुटि पट्टियां माध्य के ± 1 मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । प्रोटीन सांद्रता निर्धारित होने के बाद, α-सिन मोनोमर्स को पतला किया जाता है, संक्षेप में ३७ ° c के लिए 7 दिनों के लिए, और १,००० RPM पर सेट एक कक्षीय मिक्सर पर मिलाते हुए, के लिए इनक्यूबिटेड । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 . इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संचरण के लिए धुंधला तरीके । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नकारात्मक धुंधला का आरेख । एक) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूना ग्रिड चित्रण छवियों । ग्रिड एक सुस्त या हल्का पक्ष और एक चमकदार या अंधेरे पक्ष है । चमकदार/अंधेरे पक्ष एक formvar/कार्बन समर्थन फिल्म के साथ लेपित है । ख) धुंधला प्रक्रिया का चित्रण । ग्रिड एक मिनट के लिए और अधिक दुष्ट दूर फिल्टर कागज के साथ है ddH2ओ की पहली बूंद पर चमकदार/ प्रक्रिया ddh2o, पतला pffs या मोनोमर्स की दूसरी बूंद के साथ दोहराया जाता है, यूरेनिल एसीटेट की दो बूंदें, और ddh2ओ ग्रिड के दो अतिरिक्त बूंदें imaged जब तक एक ग्रिड बॉक्स में संग्रहित किया जा सकता है । स्केल बार = 3 मिमी इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 . कस्टम ग्लास सुई सीरिंज के विधानसभा । कांच की सुई संलग्न सिरिंज को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक चरणों का आरेख. सिलिकोनीकृत कांच केशिका ट्यूबों को खींचा जाता है और बीच में काटकर कांच की सुई का उत्पादन किया जाता है । हटना लपेटो टयूबिंग धातु सुई तैयार है और एक आंतरिक सील फार्म का प्रयोग किया जाता है जब गिलास सुई धातु सुई पर गिरावट है । सिकुड़न-आवरण टयूबिंग की दो अतिरिक्त परतें जो कांच की सुई के आधार को अतिव्यापित करते हैं और धातु की सुई को लगातार जोड़ा जाता है और कांच की सुई को सुरक्षित करने के लिए ऊष्मा का प्रयोग किया जाता है और एक जल-तंग सील बनाती है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 . Α-सिन मोनोमर्स और α-सिन फाइनेल्स के माध्यम से संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के द्वारा दृश्य । Α-सिन मोनोमर्स और फाइनेल्स का प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ । शीर्ष पैनलों: माउस और मानव α-syn monomer । मध्य पैनलों: पूर्ण लंबाई माउस और मानव α-syn PFFs. बॉटम पैनलों: माउस और मानव α-syn sonication के बाद PFFs । नीचे ग्राफ: sonicated माउस और मानव α-syn PFF लंबाई के वितरण । स्केल पट्टी = ५०० एनएम । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 . थायोफ्लेविन टी परख द्वारा amyloid संरचनाओं की पुष्टि । माउस और मानव α-syn एकलक और pff नमूनों से फ्लोरोसेंट संकेत की माप । वाम: माउस α-syn मोनोमर्स और α-syn pffs से परिणाम । सही: मानव α-सिन मोनोमर्स और α-syn PFFs से परिणाम । एक dPBS नकारात्मक नियंत्रण प्रत्येक ग्राफ में दिखाया गया है । सभी माप रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों (RFU) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । स्तंभों से संकेत मिलता है कि समूह का अर्थ है, त्रुटि पट्टियां माध्य के ± 1 मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6 . अवसादन परख pelletable α के लिए -Syn. Coomassie से सना हुआ जैल । दिखाया बैंड लगभग 14 प्रोटीन सीढ़ी के आधार पर केडीए में हैं । वाम: माउस एकलक और pffs । सही: मानव मोनोमर्स और PFFs. सभी एकलक और pff नमूनों के लिए, resuspended गोली (पी) और supernatant (S) दिखाए जाते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7 . Α-syn विकृति की पुष्टि चूहा मॉडल में inclusions की विशेषताएं । 2 महीने के बाद इंजेक्शन के रूप में ठोस रूप से एक-दूसरे के साथ सूक्ष्म रेखांकन । वाम: ंयूरॉंस वाले psyn और क्रेसिल वायलेट के साथ प्रतिदाग । मध्य: थायोफ्लेविन एस सकारात्मक ंयूरॉंस । दाएं: α-सिन-युक्त inclusions के लिए प्रतिरोधी proteinase के पैमाने पर पट्टी = ५० μm. कृपया इस आंकड़े का कोई बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
Α-सिन पफ्स का उत्पादन न्यूरॉन्स बोने में सक्षम होता है तथा लेवी शरीर जैसे समावेशन के लिए अग्रणी होता है, जो अनेक कारकों और चरणों पर निर्भर करता है । एक महत्वपूर्ण कारक यह है कि तंतुओं पैदा करने के लिए इस्तेमाल मोनोमर्स विशेष रूप से4,9,14,15तंतुओं के लिए तैयार की जरूरत है । यदि मोनोमर्स फाइनेसिरेनीकरण के लिए तैयार नहीं किए जाते हैं, तो फाइनेल्स फार्म नहीं हो सकते हैं या ऐसा करने वाले फाइनेल्स α-सिन विकृति उत्पन्न नहीं कर सकते हैं । इसी प्रकार, वह बफर जो मोनोमर्स में भी फाइनेरेयीकरण को प्रभावित करता है । इस प्रकार, सबसे अच्छा परिणाम के लिए, नमक एकाग्रता लगभग १०० mM NaCl और पीएच ७.० और ७.३ के बीच होना चाहिए । एक आरंभिक चरण जो परिवर्तनीयता का परिचय देता है वह विधि है जिसके द्वारा आरंभिक प्रोटीन सामग्री निर्धारित की जाती है, A280 पर मापन के साथ अधिक सटीक परिणाम उत्पन्न करने की संभावना होती है और इसलिए यह पसंदीदा विधि है । प्रोटीन एकाग्रता में विसंगति fibrilization प्रक्रिया की प्रभावकारिता को कम कर सकते हैं, साथ ही साथ कल्पित PFF एकाग्रता प्रयोगों में इस्तेमाल किया बदल । दोनों प्रयोगों के बीच दक्षता और बैच भिन्नता बोने में कमी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण कदम PFFs के महत्वपूर्ण विशेषताओं की पुष्टि करेंगे, विशेष रूप से है कि वे एक रेशेदार संरूपण (इलेक्ट्रॉन microscopy), amyloid संरचनाओं (thioflavin T परख) होते हैं, और pelletable (अवसादन परख) हैं । यह ध्यान दें कि thioflavin T परख के परिणाम समय के साथ उतार चढ़ाव और amyloid वर्तमान संरचनाओं की राशि का एक सीधा उपाय नहीं कर रहे है महत्वपूर्ण है, बल्कि, thioflavin टी परख केवल amyloid संरचनाओं के भीतर उपस्थिति का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए नमूना है । Thioflavin टी आम तौर पर में प्रयोग किया जाता है इन विट्रो assays हैं, जैसे aforementioned परख के रूप में दिखाने के लिए तंतुओं amyloid संरचनाओं होते हैं । वैकल्पिक रूप से, thioflavin S ऊतक में प्रयोग किया जाता है amyloid संरचनाओं का पता लगाने के लिए, के रूप में चित्र 7में दिखाया गया है । में अवसादन परख करने का संबंध है, परिणाम ही पता चलता है कि PFFs मुख्यतः pelletable अंश में पाए जाते हैं । जैसा कि नमूनों को विकृत स्थितियों में चलाया जाता है, लगभग 14 केडीए का एक प्रमुख बैंड, α-सिन मोनोमर्स का आकार जैल पर मौजूद होता है । यह कई उच्च आणविक वजन है कि PFFs के साथ की उंमीद की जाएगी पर मौजूद बैंड के विपरीत है अगर एक देशी या गैर denaturing जेल का इस्तेमाल किया गया था । अंत में, इन सभी प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण कदम के सफल पासिंग α-syn शामिल बोने की क्रिया गतिविधि की गारंटी नहीं है । इस कारण से, सेल संस्कृति प्रयोगों या एक छोटा सा सहचर शल्य चिकित्सा इंजेक्शन जानवरों के लिए बड़े प्रयोगों में उपयोग करने से पहले PFFs की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
Sonication प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है और मानकों का इस्तेमाल किया sonicator के मॉडल के आधार पर अलग होगा । Sonication के मापदंडों को लागू किया जाना चाहिए और कि कम PFF टुकड़े का उत्पादन किया गया है दिखाने के लिए सत्यापित । Fibril आकार बोने पर असर पड़ता है, कम fibril अधिक कुशलता से बोने के साथ । हालांकि छोटे तंतुओं बीज और अधिक कुशलता से, इस प्रभाव पठारों और इष्टतम pff लंबाई लगभग ५० एनएम4,18है । यह भी महत्वपूर्ण है नहीं करने के लिए नमूने sonicate और अत्यधिक गर्मी के लिए PFFs बेनकाब, के रूप में यह बीज बोने की क्षमता कम हो सकती है । इन sonicated PFFs छोटे सेल संस्कृति में प्रभावकारिता के लिए या vivo प्रयोगों में बड़े पैमाने पर प्रयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए । विभिन्न sonication सत्र परिवर्तनशीलता को लागू करने की क्षमता है के रूप में, प्रयोगात्मक उपचार समूहों तदनुसार योजना बनाई जानी चाहिए ।
जब vivo में pffs पहुंचाने, इंजेक्शन साइट (ओं) का स्थानीयकरण और कुल राशि का उपयोग किया जाता है कि ंयूरॉंस की संख्या को प्रभावित कर सकते है inclusions के रूप में के रूप में अच्छी तरह से neuroव्यपजनन की हद तक7,14। प्रोटोकॉल में निर्देशांक एक जगह शुरू करने के लिए प्रदान करते हैं, लेकिन प्रयोगशाला के भीतर परीक्षण किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए वांछित लक्ष्य क्षेत्र में विकसित α-syn विकृति पहले बड़े पैमाने पर प्रयोग में उपयोग करने के लिए । यदि इच्छित, ट्रैकिंग डाई या फ्लोरोसेंट मोती एक तरह से PFFs का उपयोग करने से पहले क्षेत्रीय लक्ष्यीकरण का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Vivo में इस्तेमाल किया pffs की राशि समूहों के बीच बदलता है, अधिकांश समूहों के बीच एक पर pffs के 5 से 20 माइक्रोग्राम के बीच कुल का उपयोग कर या दो इंजेक्शन साइटों के बीच विभाजित1,2,3,4,5 , 6 । , 7 । , 14. इंजेक्शन साइटों की संख्या के रूप में, इंजेक्शन साइटों की जगह है, और इंजेक्शन pffs की राशि प्रभाव परिणाम और synucleinopathy की प्रगति कर सकते हैं, इस्तेमाल किया मापदंडों के डाउनस्ट्रीम परिणामों के लिए मॉडल का उपयोग करने से पहले विशेषता होना चाहिए संभावित हस्तक्षेपों का परीक्षण या मॉडल की लौकिक सुविधाओं की जांच ।
जब एक मॉडल का चयन करने के लिए चिकित्सा विज्ञान के परीक्षण या रोग प्रगति का अध्ययन करने के लिए उपयोग करते हैं, का उपयोग किया मॉडल सबसे अच्छा सवाल का जवाब के लिए चुना जाना चाहिए पूछा । नहीं सभी मॉडलों पीडी के कुछ रोग सुविधाओं के अधिकारी, या संभावित हस्तक्षेपों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक समय सीमा की पेशकश करेगा । PFF मॉडल पीडी की प्रमुख विशेषताओं जैसे α-syn विकृति और neuroव्यपजनन, और मामूली मोटर impairments के लिए नेतृत्व कर सकते हैं recapitulates । मॉडल एक उंमीद के मुताबिक और लंबी समय पाठ्यक्रम है, जहां neuroव्यपजनन से पहले फार्म का महीने inclusions प्रदान करता है । यह शोधकर्ताओं की जांच करने के लिए और synucleinopathy की लंबी प्रगति भर में विभिंन चरणों का फायदा उठाने की अनुमति देता है । इस मॉडल के वर्तमान और भविष्य के उपयोग के लिए रोग प्रगति और उपंयास चिकित्सा के विकास के अध्ययन में फायदेमंद होने की उंमीद है ।
Disclosures
यूसुफ पैटरसन, केल्विन Luk, और Caryl Sortwell वर्तमान में माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन गुणवत्ता नियंत्रण α-सिन प्रोटिओस द्वारा उत्पंन सामग्री के साथ संविदात्मक व्यवस्था में शामिल हैं, Inc Coauthor निकोल Polinski, माइकल जे फॉक्स के एक कर्मचारी है नींव, जो Proteos अनुबंधित किया है, Inc α-syn monomer उत्पादन के लिए । Coauthors Megan डफी, लौरा Volpicelli-Daley, और निकोलस Kanaan कुछ भी नहीं खुलासा किया है ।
Acknowledgments
इस शोध को माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (NS099416) और वेस्टन ब्रेन इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
| Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
| Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
| Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
| Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
| Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
| Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
| Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
| Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
| Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
| Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
| Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
| Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
| ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
| Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).
- Paumier, K. L., et al. Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration. Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).
- Abdelmotilib, H., et al. alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
- Duffy, M. F., et al. Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration. Journal of Neuroinflammation. 15, 129 (2018).
- Duffy, M. F., et al. Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease. Frontiers in Neuroscience. 12, 621 (2018).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).
- Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies. Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).
- Neumann, M., et al. Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies. The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).
- Li, J. Y., et al. Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).
- Shimozawa, A., et al. Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain. Acta Neuropathologica Communications. 5, 12 (2017).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).
- Fares, M. B., et al. Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).
- Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Scientific Reports. 8, 10788 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. , (2008).
- Tarutani, A., et al. The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation. Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).
- Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons. Neuron. 79, 347-360 (2013).
