Summary
Bu protokol, Çift Bioluminesans görüntüleme ile tümör ilerlemesini ve anjiyogenezi gerçek zamanlı olarak izlemek için tümör taşıyan bir fare modelinin kurulması açıklanmaktadır.
Abstract
Anjiyogenezi, tümör ilerlemesinin önemli bir süreci olarak, anti-tümör tedavisinin bir araştırma Hotspot ve hedef haline gelmiştir. Ancak, görsel ve hassas bir şekilde aynı anda tümör ilerlemesi ve anjiyogenezi izlemek için güvenilir bir model yoktur. Bioluminescence görüntüleme, yüksek hassasiyet, güçlü özgüllük ve doğru ölçüm avantajları nedeniyle canlı görüntülemede benzersiz üstünlüğü gösterir. Burada sunulan, anjiyojenez kaynaklı Firefly Lusiferaz ifadesi ile transgenik fare içine Renilla Lusiferaz etiketli murine meme kanseri hücre hattı 4t1 enjekte ederek bir tümör taşıyan fare modeli kurmak için bir protokoldür. Bu fare modeli, tek bir fare içinde çift biyolüminesans görüntüleme tarafından gerçek zamanlı olarak tümör ilerlemesi ve anjiyogenezi aynı anda izlemek için değerli bir araç sağlar. Bu model yaygın anti-tümör ilaç taraması ve onkoloji araştırması uygulanabilir.
Introduction
Angiogenesis, küçük, lokalize neoplazmların daha büyük, potansiyel metastatik tümörlerden1,2' ye kadar kanserin ilerlemesini temel bir süreçtir. Tümör büyüme ve anjiyojenez arasındaki korelasyon Onkoloji araştırması alanında vurgu noktalarından biri haline gelir. Ancak, morfolojik değişikliklerin ölçülmesi için geleneksel yöntemler, görsel bir yaklaşım kullanarak yaşayan hayvanlarda tümör ilerlemesini ve anjiyogenezi aynı anda izlemez.
Tümör hücrelerinde biyoluminesans görüntüleme (Bli), invaziv olmayan, duyarlılık ve özgüllüğü nedeniyle tümör büyümesini izlemek için özellikle uygun bir deneysel yöntemdir3,4,5,6 . Bli teknolojisi, Lusiferaz 'ın biyoluminesans yayan belirli bir substrat oksidasyonunu katalizleştirebilmesine temel alınarak tasarlanmıştır. İmplante edilen tümör hücrelerinde ifade edilen Lusiferaz, yaşayan bir görüntüleme sistemi tarafından tespit edilebilen enjekte edilmiş substrat ile tepki verir ve sinyaller, vivo6,7' deki hücre numarası veya hücre lokalizasyonunda yapılan değişiklikleri dolaylı olarak yansıtır.
Tümör büyümesi dışında, tümör anjiyogenezi (kanser progresyonunda kritik adım) Vegfr2-Fluc-kı transjenik fareler kullanarak Bli teknolojisi ile görselleştirilebilir8,9,10. Vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) reseptör 2 (Vegfr2), bir tür VEGF reseptörü, çoğunlukla yetişkin farelerin vasküler endotel hücrelerinde ifade edilir11. Vegfr2-Fluc-kı transjenik fareler, Firefly Lusiferaz (Fluc) DNA dizisi endojen Vegfr2 dizisinin ilk eXoN içine çarptı. Sonuç olarak, Fluc farelerde anjiyogenez düzeyine benzer bir şekilde (BLı sinyalleri olarak görünür) ifade edilir. Büyüklüğü birkaç milimetre ötesinde büyümek için, tümör mevcut kan damarlarından yeni vasculatures acemi, hangi son derece tümör hücrelerinden büyüme faktörleri tarafından tetiklenen Vegfr2 ifade1. Bu Vegfr2-Fluc-KI transjenik fareler kullanarak olasılığı açar-invazif BLı tarafından tümör anjiyojenezi izlemek.
Bu protokolde, sırasıyla Firefly Lusiferaz (Fluc) ve Renilla Lusiferaz (rluc) görüntüleme ile tek bir fare içinde tümör ilerlemesi ve anjiyojenezi izlemek için bir tümör taşıyan fare modeli kurulmuştur (Şekil 1). Bir 4T1 hücre hattı (4T1-RR), rluc ve kırmızı floresan proteini (RFP) r-görüntüleme ile hücre büyümesini takip etmek için stabil bir şekilde ifade eden oluşturulur. Tümör progresyon ve regresyon anjiyojenik dinamik değişiklikleri daha fazla araştırmak için, başka bir 4T1 hücre hattı (4T1-RRT) intihar gen herpes simpleks virüs kesilmiş tirosin kinaz ifade oluşturulur (HSV-TTK), Rluc, ve RFP. Gansiklovir (GCV) yönetimiyle, hücreleri ifade eden HSV-TTK seçici olarak ablasyona aittir. Bu hücre hatlarına dayanarak, Vegfr2-Fluc-KI farelerinde tümör taşıyan bir model, tümör progresyonu ve tümör anjiyogenezi içinde vivo olarak deneysel bir model olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler, hayvanların araştırma amaçlı kullanımı ile ilgili ulusal ve kurumsal düzenlemelere uymalıdır. Denemeler yürütmek için izinler elde edilmelidir. Hayvanların tedavisi ve çalışmanın deneysel prosedürler Nankai Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi yönergelerine uygun hayvan bakımı için yönergeler Ulusal Sağlık Enstitüsü (NıH) tarafından onaylanmış uyması.
1. LV-Rluc-RFP (RR) ve LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) lentiviral paketleme ve üretim
Not: PLV-RR, Renilla Lusiferaz (rluc) ve kırmızı floresan proteinin (RFP) gen dizilerini promotör EF1α altında taşır, ancak PLV-RRT, rluc, RFP ve herpes simpleks virüsü kesilmiş tirorin kinaz (HSV-TTK) kodlama gen dizileri taşır ( Şekil 2).
- 10% fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (DMEM) ile% 5 CO2 at 37 °c ' de bir nemlendirici inküserde bir gecede 6 kuyu plakası ve kültürüne Iyi başına 293T hücrelerden 1 x 106 tohum.
- Lipoza süspansiyonu hazırlayın: Mix 7,5 μL lipozom ve 0,25 ml asgari temel Orta (MEM) bir 1,5 ml tüp içine 5 dakika oda sıcaklığında (RT) için inkübasyon aşağıdaki eşit dağıtmak için liderecede.
- DNAs çözümünü (DNAs-RR) hazırlayın: ayrı olarak, pLV-RR vektörünün ve yardımcı plazmids 0,25 mL 'ye 1,5 mL 'lik bir tüpte Tablo 1' de açıklandığı şekilde ekleyin.
- Lipozom/DNAS-RR bileşiği edinin: yavaşça DNAS-RR çözümünü hazır lipozom süspansiyon damlası ile damla olarak ekleyin ve RT 'de 20 dakika boyunca inküye yapın, böylece lipid membranına DNA bağlar.
- 293T hücrelerin orta% 10 FBS içeren DMEM 1 mL ile değiştirin ve hafif 293T hücrelerin orta Liposome/DNAs-RR bileşik ekleyin.
- 12 – 16 h için 37 °C ' de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inküserde Insonra, 293T hücrelerin orta içeren Liposome/DNAS-RR bileşiminde,% 10 FBS ve 100 U/ml penisilin − streptomisin Içeren 1 ml dmem ile değiştirin.
- Transfeksiyondan sonra 48 h için nemlendirilmiş kuluçte 293T hücreler kültür devam. Sonra, 293t hücrelerin süpernatant toplamak ve 293t hücreleri Pelet için 5 dakika 300 x g 'de orta santrifüjler. Lentivirus-RR (LV-RR)-süpernatant içeren 1,5 ml steril Polipropilen depolama tüpleri ve mağaza-80 °c ' ye aktarın.
Not: rekombinant Lentivirus ile çalışmak için bir Biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) tesisi gereklidir. - 1.1 – 1.7 adımları yineleyin ve Lentivirus-RRT (LV-RRT) elde etmek için adım 1,3 pLV-RR vektörünün yerine pLV-RRT vektörü kullanın. LV-RRT ' i-80 °C ' de saklayın.
Not: saf olmayan lentiviral stok bazı durumlarda hücre büyümesini inhibe edebilir. Lentiviral stok arındırılmış gerekebilir. LV-RR veya LV-RRT parçacıkları içeren lentiviral stokları 1,5 mL tüpler (tüp başına 1 mL) birden fazla serbest çözülme döngüleri önlemek için depolama için bölünmelidir.
2.4T1 hücrelerinde gen ifadesi için LV-RR ve LV-RRT lentiviral dönüştürücü
- Tohum 4T1 hücreler içine 6-kuyu plaka (5 x 105 hücreler/iyi) ve kültürü Ile Roswell Park Memorial Enstitüsü (rpmı) 1640 orta içeren% 10 FBS gecelik bir nemlendirici kuluçl ile 5% Co2 at 37 °c.
- Kültür plakasını orta çıkarın ve 1 mL taze RPMı 1640 orta yanı sıra 1 mL lentiviral stok (LV-RR veya LV-RRT) her iyi ile değiştirin. 8 μg/mL polybrene ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile lentiviral parçacıklar içeren orta karıştırın.
Not: ortamın, insan hücrelerini aktarabilen lentiviral parçacıklar içerdiğini lütfen unutmayın. - 1.000 de bir santrifüjde spin dönüştürücü çözüm × g 60 dakıka için RT at iletim verimliliği artırmak için. Santrifüjden sonra, 4 – 12 h için kültür 4T1 hücreleri ve 37 °C ' de 5% CO2 ile nemlendirici bir kuluçte koruyun.
Not: bazı hücre hatları Için, polybrene uzun süreli kültür için toksik olabilir. Bu nedenle, farklı hücreler dönüştürücü için kuluçbe süresi değiştirilebilir olabilir. Uygun inkübasyon süresini bulmak için hücre durumunu birden çok kez kontrol edin. - Lentiviral parçacıklar ve polybrene kaldırmak için 10% FBS ve 100 U/mL penisilin − streptomisin içeren 2 mL RPMI 1640 orta ile traned 4T1 hücrelerin orta yenileyin.
3. ilaç taraması ve LV-RR ve LV-RRT dönüştürücü 4T1 hücrelerin tespiti
- LV-RR veya LV-RRT tarafından gerçekleştirilen BSD direnç genine göre aşağıdaki adımlar açıklandığı gibi, orta içeren Blasticidin (BSD) ile transkence hücreleri seçin.
Not: Alternatif olarak, RFP-pozitif olan dönüştürücü hücreler, LV-RR veya LV-RRT tarafından taşınan RFP genine göre Akış sitometrisi tarafından seçilebilir. - 48 h dönüştürücü sonra, geçiş 4T1 hücreler oranı ile 1:3 için 1:4 seçim Orta (RPMI 1640 orta içeren 10% FBS, 100 U/mL penisilin − streptomisin, ve 5 μg/mL BSD). Her 2 veya 3 günde bir ortam değiştirin.
Not: en iyi BSD konsantrasyonu hücre hattına hücre hattına değişebilir. Bu nedenle, ilk deneyden önce BSD 'in optimum konsantrasyonunu belirlemek için öldürme eğrisi pilot deneyi yapılmalıdır. - 7 gün uyuşturucu sonrası tarama, LV-RR dönüştürücü 4T1 hücreler (4T1-RR) ve LV-RRT transkif 4T1 hücreleri (4T1-RRT) floresans ters faz kontrast mikroskop altında gözlemlemek. RFP+ 4t1 hücrelerinin sayısını ve üç vizyon alanında tüm 4t1 hücrelerini sırasıyla RFP-pozitif oranını tahmin etmek için saymak (Şekil 2).
Not: Alternatif olarak, dönüştürücü 4T1 hücrelerinin RFP-pozitif oranı akış sitometri tarafından tespit edilebilir. - Hücre numaraları ve Renilla sinyalleri arasındaki doğrusal ilişkiyi algılamak için canlı bir görüntüleme sistemi kullanarak 4T1-RR hücrelerinin ve 4T1-RRT hücrelerinin Renilla sinyallerini ölçün (Şekil 3).
- 1:3 ile 1:4 arasında bölünmüş oranlarda seçim ortamına sahip BSD-ekranlaştırılmış 4T1-RR ve 4T1-RRT hücrelerini genişletin ve hücre hattı stoklarını sıvı nitrojen içinde saklayın.
4. Vegfr2-Fluc-KI fareler ve tümör taşıyan fare modeli
Not: transgenik Vegfr2-Fluc-kı fareler, 6-8 hafta eski ve dişi, bu deneyde non-invazif takip anjiyogenez in vivo BLI tarafından kullanılır.
- Kültür 4T1-RR hücreleri ve 4T1-RRT hücreleri 60 mm, sırasıyla 37 °C ' de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçte olarak görülmektedir. Hücreleri% 80 konfluence olduğunda, orta çıkarın ve fosfat tamponlu tuzlu (PBS) ile durulayın.
- PBS 'yi çıkarın ve sırasıyla% 0,25 Trypsin-0,53 mM EDTA çözeltisi ek 2 mL ekleyin. Kabı RT (veya 37 °C ' de) hücrelerden ayrılıncaya kadar tutun.
- % 10 FBS içeren taze orta 5 – 10 ml ekleyin, ardından 4t1-RR ve 4t1-RRT hücrelerini 15 ml santrifüjli tüplere sırasıyla pelletini hücreleri Aspire ve dağıtma. Bir sayım odası kullanarak 4T1 hücrelerin iki tür saymak ve RPMı 1640 orta 100 μL başına 1 x 106 konsantrasyonda hücre süspansiyonları hazırlamak.
- Anestezize Vegfr2-Fluc-KI fareler ile 1%-3% Isoflurane içinde 100% oksijen bir akış oranı ile anestezi indüksiyon odasında 1 L/dak. Izleme, anestezi durumunu onaylamak için farenin parmak tutam yanıtı. Daha sonra, dehidrasyon önlemek için fare gözlerine oftalmik merhem uygulayın.
- Nosecone Oda ve pozisyonda fareyi kaldırın. Tamamen cerrahi alan iyi bir görünüm sağlayabilir ve takip deneyler BLı sinyalleri engelleme önlemek, elektrikli tıraş makinesi ve epilasyon krem kullanarak fare omuz saç kaldırmak.
- Sırasıyla her bir farenin sol ve sağ omuzlarında 4T1-RR hücreleri (100 μL toplam hacimde 1 x 106 hücre) ve 4T1-RRT hücreleri (100 μL toplam hacimde 1 x 106 hücre) (0 gün olarak kayıt) subkutan enjekte edilir. Tam olarak kurtarılana kadar ısı desteği ile kurtarma alanına fareler yerleştirin.
- 4T1-RR ve 4T1-RRT hücrelerinin implantasyonu sonrasında, farelerin her gün tümör taşıyan olup olmadığını kontrol etmek için tümör kitlelerine dokunun (Şekil S1). Günde 7 implantasyon sonrası, intraperitoneal enjekte 50 mg/kg Gansiklovir (GCV) tümör taşıyan fareler günde iki kez deney sonuna kadar.
Not: Bu deneyden önce, 4T1-RRT hücrelerinde GCV 'nin sitotoksissi tespit edilmelidir. GCV 'nin öldürme verimliliği, GCV 'nin farklı konsantrasyonu ile hücre sayımı tahlili ile değerlendirilebilir (Şekil S2). - 4T1 İmplantasyondan sonra 0, 3, 7, 14 ve 21 gününde, tümör taşıyan farelerin tümör büyümesini ve anjiyogenezini izleyin ve hem Rluc hem de Fluc görüntüleme tarafından değerlendirin (Şekil 4).
5. tümör (rluc) ve anjiyogenezi (Fluc) çift biyolüminesans görüntüleme
- Canlı görüntüleme sistemini açın, canlı görüntüleme yazılımını başlatın ve sonra sistemi başlatın.
Not: sistem başlatılması, görüntü almaya başlamadan önce-90 °C ' ye kadar şarj cihazı (CCD) kamerayı soğutmak için birkaç dakika sürer. CCD kamera soğutulur zaman sıcaklık yeşil dönecek. - Aşağıdaki kamera ayarlarını kullanın:
Luminescence ve fotoğrafı kontrol edin.
Yerleşimi denetle.
Işıldama ayarları:
Pozlama süresi normal koşullarda AUTO ayarlar.
Binning 8 ' e ayarlar.
F/stop 1 olarak ayarlar.
Emisyon filtresi açık olarak ayarlar.
Fotoğraf ayarları:
Binning orta olarak ayarlar.
F/stop 8 ' e ayarlar.
IVıS sistem ayarları:
Görünüm alanı: C = 1 fare görünümü, D = 5 fare görünümü.
Konu yükseklik setleri 1,5 cm. - Tartmak ve fareler kaydetmek ve coelenterazine hacmi hesaplamak (CTZ; 2,5 mg/kg) ve D-Luciferin (150 mg/kg) gerekli.
- Anestezi indüksiyon odasında 1 L/dak. ' nın% 100 ' inde% 1 ' inde% 3 ' e kadar kanserli tümör taşıyan fare, anestezinin durumunu onaylamak için farenin ayak tutam yanıtı Izleyin. Daha sonra, kornea hasarını önlemek için her iki gözün üzerine bir damla yağlama göz merhem dağıtınız.
- Enjekte 2,5 mg CTZ (3,33 mg/ml) fare retrobulber içine kilogram vücut ağırlığı başına (örneğin, bir 20 g fare, enjekte 15 μL CTZ 50 μg teslim etmek için) bir insülin şırınga iğne kullanarak.
- Tümör taşıyan fareyi, anestezi koni yavaşça burun ile kamera odasına taşıyın ve BLı sinyalleri fade away kadar 4T1 hücrelerden Rluc sinyalleri almak için hemen fare dorsal birkaç resim elde.
Not: CTZ yarı ömrü çok kısa ve Rluc damlası sinyallerini çökeltir ~ 30 s. Rluc sinyalinin dağıldığından ve Rluc ile Fluc görüntüleme arasındaki aralığın 10 dakikadan fazla olması gerekir. - İntraperitoneally enjekte 150 mg/kg D-Luciferin (30 mg/mL) bir insülin şırınga iğne kullanarak (örneğin, bir 20 g fare için, enjekte 100 μL teslim etmek 3 mg D-Luciferin). Fluc görüntüleme önce 10 dk için RT fare tutun.
- Tekrar anestezi koni içinde burun ile kamera odasına bu fareyi taşıyın ve anjiyojenezi Fluc sinyalleri almak için fare dorsal birkaç resim elde.
Not: sinyaller maksimum oranına ulaşıncaya ve sonra solmaya kadar her fare için Fluc kinetik monitör yapılmalıdır. - Her fare için 5.4 – 5.8 adımları yineleyin.
- Görüntüden sonra, hayvanlar uyanana kadar fareleri sıcak bir ortamda koruyun.
- İstenilen zaman noktasında (gün 3, 7, 14 ve 21), zamanla tümör progresyonu ve tümör anjiyogenezi tespit etmek için yukarıdaki prosedürleri tekrarlayın (adım 5.3 – 5.10).
- Tümör ilerlemesinde tümör büyümesi ile anjiyogenezi arasındaki ilişkiyi araştırmak için Rluc ve Fluc sinyallerini analiz edin.
Not: BLı sinyal bölgesini kapsayan ilgi alanı (YG), verileri analiz etmek için kullanılır. Her zaman noktası için fotonlar/saniye/cm2/steradian (p/s/cm2/SR) biriminde YG 'Nin toplam parlaklığı (fotonlar) ölçün. - Grafik yazılımını kullanarak YG 'nin Rluc ve Fluc sinyallerini analiz edin (Şekil 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneyde, tümör büyüme ve tümör anjiyogenezi arasındaki ilişkiyi araştırmak için 4T1 hücre kullanılarak bir meme kanseri fare modeli kuruldu (Şekil 1). Birincisi, iki Lentivirus paketlenmiş, hangi Rluc/RFP ifade gen dizileri taşınan (LV-RR) ve Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), sırasıyla, daha önce bildirilen7. Ardından, 4T1-RR ve 4T1-RRT adlı iki farklı 4T1 hücre çizgisi, sırasıyla LV-RR ve LV-RRT dönüştürücü tarafından oluşturuldu. 3 gün boyunca ilaç taramasının ardından, 4T1-RR ve 4T1-RRT, dönüştürücü verimliliğini algılamak için floresan mikroskobu altında gözlenmiştir. Floresan görüntülemede gösterildiği gibi, 4t1-RR veya 4T1-RRT hücrelerinin% 99 ' den fazlası RFP pozitif idi, bu da 4T1-RR ve 4T1-RRT hücre hatları LV-RR ve LV-RRT dönüştürücü (Şekil 2a, B) tarafından kurulmuş olduğunu önerdi. Bu arada, hücre Morfoloji ve Wild-Type 4T1 ve 4T1-RR veya 4T1-RRT arasında kültür süresi boyunca büyüme bulundu fark yoktu. Özetle, biz başarıyla hücresel durumları etkileyen olmadan 4T1-RR ve 4T1-RRT hücre hatları inşa. Daha sonra, rluc sinyallerini algılamak için 4t1-RR ve 4t1-RRT hücrelerinin biyolüminesans görüntüleme (BLI) yakalanmıştır. BLı görüntüleri her iki 4T1-RR ve 4T1-RRT hücrelerin aynı mukavemet güçlü Bioluminesans sinyalleri yayılan ortaya (Şekil 3A). Ayrıca, Rluc sinyalleri ve hücre numaraları arasındaki doğrusal ilişkiler, hem 4T1-RR (R2 = 0,9974) hem de 4T1-RRT hücrelerinde (r2 = 0,9989) görüldü, bu da rluc sinyallerinin in vivo tümör büyümesini yansıtmak için kullanılabileceğini önerdi (Şekil 3B ).
Bu bazda, transgenik Vegfr2-Fluc-KI fareler kullanarak, meme kanseri büyüdükçe anjiyojenezi araştırmak için bir tümör taşıyan fare modeli kurulmuştur. Fluc dizisinin, Vegfr2 dizisinin ilk eXoN ' unu murine 'de çalan bir sonucu olarak, Fluc, tümör ilerlemesi sırasında farelerde anjiyojenezi ile aynı şekilde (Bioluminesans sinyaller olarak görünür) ifade edildi. 4T1-RR ve 4T1-RRT hücrelerinin Subkutan Enjeksiyon sonra, hücre büyümesi CTZ varlığında Rluc sinyalleri tarafından izlenen gün 0, 3, 7, 14, ve 21 (Şekil 4A). Aynı zamanda, tümör büyümesi ile indüklenen anjiyogenez aynı fareyle D-Luciferin varlığında Fluc sinyalleri ile değerlendirildi. 7. günde 4T1-RR ve 4T1-RRT ' n e n implantasyon sonrası, 4T1-RRT hücrelerinin ölüme yol açan tümör taşıyan fareler için GCV uygulandı. BLı görüntüleri, 4T1-RR ve 4T1-RRT hücrelerinin Rluc sinyallerinin GCV tedavisinden önce aynı oranda arttığını ortaya koydu; Ancak, 4T1-RRT hücrelerinin Rluc sinyalleri keskin Post GCV tedavisi azaldı. 4T1-RR Rluc sinyalleri hala yavaşça artmıştır iken. Belli ki Rluc sinyalleri ve tümör büyüklüğü arasında önemli bir Relativite vardı (Şekil S1).
Bu arada Fluc görüntülerine göre, Fluc sinyalleri Rluc yükselişi uyarınca arttı ve Rluc düşüşün ardından azalmıştır (Şekil 4b). Bu sonuçlar, tümör anjiyogenezi ve tümör büyümesi arasında doğrudan bir korelasyon olduğunu göstermektedir. İlaç GCV tarafından indüklenen tümör hücrelerinin ölümü tümör anjiyogenezi inhibisyonu neden olabilir (Şekil 4c). Fluc sinyalinin tümörün içindeki anjiyogenezi tespit ettiğini göstermek için, hayvan damarlarının histolojik kanıtı elde etmek için 21. Anti-VEGFR2 immünostatiği görüntülerine göre, 4T1-RR tümör dokusundaki mikrovasküler yapılar, Fluc sinyalleriyle tutarlı olan 4T1-RRT tümör dokusunda önemli ölçüde daha belirgindi (Şekil 5). Özetle, bu çift biyoluminesans görüntüleme stratejisi, tümör ilerlemesi ve anjiyogenezi izlemek için kullanılabilir, ayrıca tümör mikroortamında tümör büyümesi ve anjiyogenezi üzerinde farklı ilaçların anti-tümör etkilerini değerlendirmek.
Şekil 1: tümör büyümesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminesans görüntülemenin şematik haritası. LV-RR ve LV-RRT tarafından dönüştürücü olan 4T1 hücreler Vegfr2-Fluc-KI transjenik farelerde implante edildi. Tümör büyümesi sırasında, Rluc ve Fluc BLı, sırasıyla tümör büyümesini ve anjiyojenezi durumunu yansıtacak şekilde tek bir fareyle aynı anda gerçekleştirildiler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: floresan görüntüleme ile tanımlanan 4t1-RR ve 4T1-RRT hücrelerinin transktion verimliliği. (A) PLV-RR 'nin grafiksel çizimi, rluc ve RFP sıralarının promotör EF1α altında ifade edildiğini göstermiştir. Bir görüş alanının parlak ve floresan görüntüleri 4T1-RR hücrelerinin RFP-pozitif olduğunu ortaya koydu. (B) PLV-RRT diyagram çizimi, tek bir organizatör EF1α RLUC, RFP ve HSV-TTK genlerini aktive ettiğini göstermiştir. Bir görüş alanının parlak ve floresan görüntüleri 4T1-RRT hücrelerinin RFP pozitif olduğunu ortaya koydu. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 3: dönüştürücü 4T1-RR ve 4T1-RRT hücrelerinin Bioluminescence görüntüleme. (A) CTZ varlığında 4T1-RR ve 4T1-RRT hücrelerin Bioluminescence görüntüleme. (B) 4T1-RR ve 4T1-RRT hücrelerinin ölçülen rluc sinyalleri hücre numaraları ile doğrusal bir ilişki sürdürüyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: yaşayan bir hayvanın tümör büyümesi ve anjiyogenezinin dinamik süreçlerinin görselleştirilmesi. (A) Rluc ve Fluc 'un deneme ve çift BLI tespiti akış şeması. (B) transjenik bir fare içinde tümör gelişimi sırasında anjiyojenezinin tümör Ilerlemesi ve Fluc görüntülerinin temsili rluc görüntüleri. (C) rluc sinyallerinin ölçülmesi, implante edilen tümör hücrelerinin hızlı bir şekilde büyüdüğünü göstermiştir, ancak 4T1-RRT hücreleri GCV yönetiminden sonra önemli ölçüde geriledi. (D) Fluc sinyallerinin ölçülmesinde, tümör hücre implantasyonu sonrasında anjiyojenezinin, tümör büyümesi ve GCV tarafından indüklenen ölüm ile paralel bir eğilim sonrasında oluştuğunu göstermiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: VEGFR2 4t1-RR ve 4T1-RRT dokularda 21. Tümör dokularının temsili görüntüleri VEGFR2 için lekelenmiş (yeşil) gün 21. Çekirdekler DAPı (mavi) ile karşı koyanmış. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil S1: tümör ilerlemesi sırasında tümör boyutunun eğri içinde vivo. İmplantasyon sonrası 4T1-RR ve 4T1-RRT hücrelerinin tümör büyüklüğü arttı, ancak 4T1-RRT hücrelerinin tümör büyüklüğü Post-GCV tedavi azalan başladı. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S2: GCV 'Nin 4T1-RRT hücrelerde Sitotoksisik etkisi. 4T1-RRT hücreleri GCV yüksek konsantrasyon ile öldü. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Figür S3: akciğerde 4T1-RR HÜCRELERININ BLI görüntüsü. 4T1-RR hücrelerinin kuyruk ven enjeksiyonu sonra, hücrelerin Rluc sinyali BLı tarafından tespit edildi. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
| LV-RR ve LV-RRT paketleme koşulları | |||
| Bileşen | MEM orta | 3-plazmid sistemi | 4-plazmid sistemi |
| pLV-RR/pLV-RRT vektörA | 0,25 mL | 1,5 | 1,5 |
| Gag-pol + Rev ifade vektörB | 1,0 | ||
| Gag-pol ifade vektörüC | 0,75 | ||
| Rev ifade vektörD | 0,3 | ||
| VSV-G ifade vektörüE | 0,5 | 0,45 | |
| Lipozom | 0,25 mL | 7,5 (μL) | 7,5 (μL) |
Tablo 1: 293t HÜCRELERDE LV-RR ve LV-RRT viral stokları üretmek için lentiviral paketleme sisteminin transfeksiyon koşulları. (A) PLV-cDNA vektörü sırasıyla PLV-RR ve pLV-RRT ' d i r. (B) gag-pol + Rev ifade vektörü ya Pcmv-deltar 8.91 (TRC) veya PsPAX2 (addgene) olabilir. (C) gag-pol Ifade vektörü pMDLg/Prre (addgene), PLP1 (ınhtrogen) ve PPACKH1-gag (SBI) herhangi birini seçebilir. (D) Rev Ifade vektörü prsv-Rev (addgene), PLP2 (ınhtrogen) veya PPACKH1-Rev (SBI) olmalıdır. (E) VSV-g Ifade vektörü PMD. g (TRC), PMD2. g (addgene), PCMV-VSV-g (addgene), Pvsv-g (SBI) veya PLP/Vsvg (Invitrogen) seçeneğini seçebilir. Bu protokolde, psPAX2, pMD2. G ve pLV-RR veya pLV-RRT dahil olmak üzere üç plazmid sistemi kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, tümör gelişimi ve anjiyogenezi izlemek için invaziv olmayan çift BLı yaklaşımı açıklanmıştır. BLı muhabiri sistemi ilk olarak HSV-TTK/GCV intihar geni ve Rluc görüntüleme tarafından tümör progresyonu ve regresyon in vivo takip için içerir geliştirilmiştir. Bu arada, tümör anjiyojenezi Fluc görüntüleme yoluyla Vegfr2-Fluc-KI fareler kullanılarak değerlendirilir. Bu tümör taşıyan fare modeli, sürekli ve non-invaziv izleme tümörü gelişimi için pratik bir platform ve yüksek alaka, yeniden üretilebilirlik ve çevrilebilir tek bir farede çift BLı tarafından tümör anjiyogenezi sağlayabilir.
Angiogenesis uzun vadeli tümör progresyonu ile ilgilidir ve böylece yüksek öneme sahiptir1. Tümör progresyonu ile anjiyogenezi arasındaki ilişkiyi incelemek gerekir. Kanser tedavisi için artan sayıda anti-anjiyogenez stratejisi incelenmiştir, bu da tedavi sonuçlarını doğru şekilde değerlendirmek için görselleştirilen monitör yaklaşımlarına dayanır. Dahası, geleneksel radyoterapi ve kemoterapi sonrası tümör dokusunun neovaskülarizasyonu, Onkoloji araştırmaları için başka bir popüler alandır12,13,14. Bu çalışmalar gerçek zamanlı olarak tümör büyümesi ve anjiyogenezinin izlenmesi sağlayan bir hayvan modeli gerektirir. Geleneksel hayvan modellerinde tümör dokularının patolojik değişiklikleri genellikle hayvan fedakarlığı gerektiren histopatolojik incelemeye bağlıdır. Bu çift BLı fare modelleri daha büyük hata aralıkları ve hayvanların kurban daha yüksek maliyetlerinin sorunlarını gidermek yardımcı olur.
Bu çift BLı fare modelinde, en kritik adım, Fluc ve Rluc dahil olmak üzere iki tip luciferases kullanarak, aynı anda hücreler ve anjiyogenezi takip etmek. Bu iki luciferases substrat özgüllüğü mümkün tek bir ev sahibi iki tür BLı gerçekleştirmek için yapar. Ayrıca, coelenterazine yarı ömrü (Rluc substrat) çok kısa, hangi sonuçları Rluc sinyalleri uzakta hızlı bir sonraki Fluc sinyal algılama etkileyen olmadan solma15. Bu nedenle, işletim sürecinde, Rluc görüntüleme D-Luciferin (Fluc substrat) uzun yarı ömrü dikkate Fluc görüntüleme önce uygulanmalıdır. Buna ek olarak, alt yüzeylerinin inkübasyon süresini anlamak mükemmel BLı görüntüleri elde etmek için anahtardır. Substratın metabolizması, BLı sinyal yoğunluğunda varyasyona yol açan in vivo substratlar konsantrasyonunu değiştirebilir.
Teknolojideki gelişmelere sahip olmak, floresan görüntüleme, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve pozitron gibi preklinik ve klinik araştırmalarda belirli hücresel ve hücre içi olayların in vivo izleme için diğer Görüntüleme modaliteleri uygulandı emisyon tomografi (PET)16,17. Bu görüntüleme stratejileriyle karşılaştırıldığında, biyolüminesans görüntüleme, canlı görüntüleme çalışmaları alanında benzersiz üstünlüğü gösteren yüksek hassasiyet, güçlü özgüllük ve doğru ölçümlere sahiptir15. Rluc görüntüleme kullanılan HSV-TTK/GCV ön ilaç sisteminin tümör büyümesi ve anti-tümör etkileri dinamik bir yaşam hayvanında görselleştirilmesini sağlar. Subkutan dokularının izlenmesi dışında, Rluc diğer araştırmalarda BLı teknolojisi ile akciğerlerdeki hücreleri takip etmek için kullanılmıştır. Bir fare içine 4T1-RR kuyruk ven enjeksiyon sonra, biz CTZ yönetiminden sonra Rluc sinyalleri algılamak için canlı görüntüleme sistemine bu fareyi taşındık. Rluc sinyalinin görüntüsü, enjekte edilen hücrelerin ağırlıklı olarak akciğer içinde bulunduğunu gösterdi (Şekil S3). Yukarıda belirtildiği gibi, Rluc rapor geni farklı yerlerde çeşitli kanser hücrelerini izleyebilirsiniz, hangi kanser Biyoloji araştırma bu fare modelinin tam kullanımını teşvik eder.
Bu avantajlara ek olarak, BLı teknolojisi belirli moleküllerin ifade düzeylerini anlamakla kullanılabilir. Daha önce, ilgili promotörler altında ifade edilen fluorophores muhabir genler, subkutan tümörlerde gemi gelişimini ölçmek için kullanılmıştır. Tümör ilerlemesi sırasında, damar yapısı ve moleküller farelerde cerrahi olarak implante edilmiş pencere odaları aracılığıyla gözlemlenebilir. Ancak, bu yöntem hala kısıtlılıklar vardır, kaçınılmaz invazyonu da dahil olmak üzere, fluorophore Quenching, ve güçlü arka plan gürültüsü. Vegfr2-Fluc-KI farede kurulan tümör taşıyan fare modeli, tümör anjiyogenezinde en önemli molekül olan Vegfr2 ifade seviyesinin invaziv olmayan bir gözlem oluşturur. Bu arada, BLı görüntüleri gürültü olmadan büyük özgüllük görüntüler. Çift BLı fare modeli tümör ilerlemesi ve regresyon potansiyel moleküler mekanizmalar eğitim daha geniş uygulamalar olabilir.
Rluc (emisyon 480 Nm) ve Fluc (emisyon 562 Nm) ifadesine dayalı BLı teknolojisi, bir dizi in vivo hastalık modelinde benimsenmiştir. BLı teknolojisinin yaygın kullanımı in vivo, derin dokuyu tespit etmek için 600 Nm 'nin altındaki dalga boylarında Bioluminesans düşük duyarlılığı nedeniyle kısıtlanmıştır. Bu emilim ve ışık saçılma neden olur, hangi doku santimetre başına on kat kadar algılanabilir sinyal azalır. Bu soruyu ele almak için, bazı araştırmacılar 600 Nm18üzerinde ışık yayan Fluc kırmızı-emiter türevleri üzerinde çalışmalar odaklı var. Fluc18,19bu türevleri kullanılarak ışığın emilimi ve saçılma son derece azaltılabilir çünkü, Lusiferaz türevleri uygulamaları bu protokol Onkoloji araştırma daha büyük bir alana uzatacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Çin Ulusal anahtar R & D programı (2017YFA0103200), Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81671734) ve Tianjin bilim ve teknoloji destek programı (18YFZCSY00010) anahtar projeleri, temel araştırma fonları tarafından desteklenmektedir Merkezi üniversiteler (63191155). Biz Gloria Nance 's revizyonlar, bizim el yazması kalitesini iyileştirmek için değerli olduğunu kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
