Summary
Para examinar la visión del ratón, llevamos a cabo una prueba inminente. Los ratones fueron colocados en una gran arena cuadrada con un monitor en su techo. El estímulo visual que se avecina constantemente evocaba la congelación o las reacciones de vuelo en los ratones.
Abstract
El sistema visual en el sistema nervioso central procesa diversas señales visuales. Aunque la estructura general se ha caracterizado desde la retina a través del núcleo del geniculato lateral hasta la corteza visual, el sistema es complejo. Se han realizado estudios celulares y moleculares para dilucidar los mecanismos que sustentan el procesamiento visual y, por extensión, los mecanismos de la enfermedad. Estos estudios pueden contribuir al desarrollo de sistemas visuales artificiales. Para validar los resultados de estos estudios, es necesario realizar pruebas de la visión conductual. Aquí, mostramos que el experimento de estimulación inminente es una prueba confiable de la visión del ratón que requiere una configuración relativamente simple. El experimento que se avecina se llevó a cabo en un gran recinto con un refugio en una esquina y un monitor de computadora ubicado en el techo. Una cámara CCD colocada junto al monitor de la computadora sirvió para observar el comportamiento del ratón. Se colocó un ratón en el recinto durante 10 minutos y se le permitió aclimatarse y explorar los alrededores. A continuación, el monitor proyectó un estímulo que se avecina en un programa 10 veces. El ratón respondió a los estímulos ya sea por congelación o huyendo al escondite. El comportamiento del ratón antes y después de los estímulos que se avecinan fue registrado, y el video fue analizado usando el software de seguimiento de movimiento. La velocidad del movimiento del ratón cambió significativamente después de los estímulos que se avecinan. En cambio, no se observó ninguna reacción en ratones ciegos. Nuestros resultados demuestran que el simple experimento inminente es una prueba fiable de la visión del ratón.
Introduction
El sistema visual comienza en la retina, donde las señales visuales son capturadas por los fotorreceptores, canalizadas a las células bipolares (2 neuronas de ordenND) y finalmente pasadas a las células ganglionas (3 neuronas de ordenRd). Retina 2ND-y 3 las neuronas de ordenRdse cree que forman múltiples vías neuronales que transmiten aspectos particulares de la señalización visual como el color, movimiento, o forma. Estas diversas características visuales se transmiten al núcleo del geniculato lateral y a la corteza visual. En cambio, las señales visuales que conducen al movimiento ocular se envían al coliculus superior. Clásicamente, se han identificado dos vías retino-corticales: las vías magnocelulares y parvocelulares. Estas vías codifican objetos móviles y estacionarios, respectivamente, y su existencia encarna el concepto básico de procesamiento paralelo1,2,3,4,5, 6. Recientemente, más de 15 tipos de células bipolares7,8,9,10,11 y células ganglio12,13,14 ,se han notificado15,16 en la retina de muchas especies, incluyendo la retina del primates. Estas células se distinguen no sólo por los aspectos morfológicos, sino también por la expresión de marcadores distintivos y genes8,10,17,18, sugiriendo que varias características de las señales visuales se procesan en paralelo, lo que es más complicado de lo previsto originalmente.
Las tecnologías celulares y moleculares han contribuido a nuestra comprensión del procesamiento visual y los posibles mecanismos de enfermedades que pueden surgir de un procesamiento visual aberrante. Tal comprensión puede contribuir al desarrollo de los ojos artificiales. Aunque los exámenes y análisis celulares ofrecen un conocimiento profundo a nivel celular, una combinación de experimentos de comportamiento y experimentos celulares aumentaría significativamente nuestra comprensión actual de los procesos visuales minutuales. Por ejemplo, Yoshida et al.19 encontraron que las células de amacrinas Starburst son las neuronas clave para la detección de movimiento en la retina del ratón. Después de los experimentos celulares, realizaron el experimento conductual de nistagmo optocinético (OKN) para mostrar que los ratones mutantes en los que las células de amacrina StarBurst eran disfuncionales no respondieron a objetos en movimiento, confirmando así su Investigaciones. Además, Pearson et al.20 realizaron un trasplante de fotorreceptores en la retina del ratón para restaurar la visión en ratones enfermos. No solo realizaron experimentos celulares, sino que también midieron el comportamiento del ratón mediante el uso de grabaciones de respuesta optomotora y tareas de laberinto de agua, lo que permitió a Pearson et al. verificar que los fotorreceptores transplantados restauraron la visión en los anteriormente ciegos Ratones. Tomados en conjunto, los experimentos de comportamiento son herramientas sólidas para evaluar la visión del ratón.
Hay varios métodos disponibles para medir la visión del ratón. Estos métodos tienen ventajas y limitaciones. El ERG in vivo proporciona información sobre si la retina del ratón, particularmente los fotorreceptores y las células bipolares, responde adecuadamente a los estímulos ligeros. Erg se puede probar en condiciones escotópica o fotópica21,22. Sin embargo, el ERG requiere anestesia, lo que podría afectar a la medición de salida23. El reflejo optocinético (OKR) o la respuesta optomotora (OMR) es un método robusto para evaluar la sensibilidad al contraste y la resolución espacial, ambos componentes funcionales de la visión del ratón. Sin embargo, OKR requiere cirugía para sujetar un dispositivo de fijación al cráneo del ratón24. OMR no requiere ni cirugía ni entrenamiento del ratón; sin embargo, requiere entrenamiento para permitir que un experimentador detecte subjetivamente los movimientos sutiles de la cabeza del ratón en respuesta a una rejilla en movimiento en un tambor óptico 25,26. Reflejo de la luz de la pupila mide la constricción de la pupila en respuesta a estímulos ligeros, que no requiere anestesia y exhibe respuestas objetivas y robustas 19. Aunque el reflejo de la pupila simula la respuesta de la luz retiniana in vivo, el reflejo está mediado principalmente por las células de ganglión retinianas intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs) 27. Debido a que los ipRGCs representan una pequeña minoría de RGCs y no sirven como células ganglionadoras convencionales que forman imágenes, esta medición no proporciona información relativa a la mayoría de las células ganglionarias.
El experimento de luz inminente no se ha considerado previamente una prueba importante para medir la visión del ratón. Sin embargo, también es una prueba de visión robusta y confiable a través de varias especies, como el ratón28,29, pez cebra30, Locust31,32, y Human33,34, 35. es importante destacar que el experimento que se avecina es uno de los pocos métodos para probar el camino de formación de imágenes-no es una vía de reflejo-dado el visual y los sistemas límbicos en el sistema nervioso central están involucrados en este circuito36, 37,38. Hemos establecido un sistema de estímulo visual inminente y hemos demostrado su capacidad para provocar la detección de movimiento en el ratón, que utilizamos como un proxy para evaluar la intacacidad del sistema visual del ratón.
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Protocol
Todos los experimentos y el cuidado de los animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por los comités institucionales de cuidado y uso de animales en la Universidad Estatal de Wayne (Protocolo n° 17-11-0399).
1. preparación para el experimento
- Construya un gabinete rectangular de tapa abierta para albergar al ratón durante la presentación de estímulos visuales que se avecinan. Construimos un gabinete de 40 cm x 50 cm x 33 cm usando armazón de aluminio y paneles de PVC (figura 1a, B). Coloque una hoja de papel para cubrir todo el piso del gabinete para asegurar una fácil limpieza entre los ensayos. Añadir un refugio opaco en una esquina del recinto con una entrada que da al centro de la arena para una fácil entrada y salida.
- Configure una cámara con una lente gran angular para capturar el comportamiento del ratón. Fije la cámara a un soporte montado en la mesa adyacente al gabinete. Para una captura de vídeo de la mejor calidad, utilice una velocidad de fotogramas de cámara de 60 FPS o superior.
- Configure un monitor de computadora en la parte superior del gabinete. Debido a que no se pudo ver el monitor desde el exterior, se preparó un segundo monitor, que duplicó las imágenes mostradas en el monitor principal.
- Prepare un patrón inminente para la proyección. Una forma de hacerlo es utilizar el PsychToolbox3 dentro del software de MatLab para codificar un círculo negro en expansión (figura 1C). Establecer el estímulo para comenzar en un ángulo visual de 2 ° y ampliar a 50 ° sobre 250 ms; Estos parámetros determinan la velocidad de estímulo (véase figura 1D para el cálculo del ángulo visual). Establezca el código para repetir el estímulo 10 veces con un intervalo de 1 s.
Nota: el estímulo comenzó cada repetición inmediatamente después de la terminación de la presentación anterior. Para más información sobre la presentación de estímulos, por favor refiérase a la sección 3. - Seleccione ratones de interés para los estímulos que se avecinan. Aquí, utilice 32 ratones de ojos sanos de un fondo C57, masculino y femenino, 4 a 14 semanas de edad. Además, utilice 3 ratones ciegos (cataratas severas en ambos ojos) para evaluar si la respuesta al estímulo inminente fue realmente un comportamiento visualmente guiado. Estos ratones ciegos no tenían reflejo de luz pupilar ni respuesta optomotora.
2. la aclimatación del ratón
- Coloque un ratón en el gabinete y deje que explore libremente su entorno. Si es posible, trate de minimizar el estrés durante la transferencia de animales usando la parte posterior de su mano libre como un lugar de reposo para el ratón en lugar de dejarlo colgar sin apoyo. El ratón debe encontrar el recinto completo para ser seguro y debe descubrir el escondite. Deje caer algunos pellets de comida en la esquina opuesta al refugio para animar al ratón a permanecer fuera del refugio.
- Permitir que el ratón aclimatarse en cualquier lugar de 7 a 15 min29,39. Se permiten 10 min de aclimatación antes del inicio del estímulo. Además, la aclimatación de 10 min un día antes del experimento puede aliviar los ratones.
3. proyección de estímulos visuales que se avecinan
- Antes de insertar el ratón en la arena, asegúrese de que el código de estímulo esté listo para ejecutarse para facilitar los cambios de iluminación posibles mientras el ratón está en el gabinete. Una vez que el software está listo para ejecutarse, Coloque suavemente el ratón en el gabinete.
- 10 segundos antes de la estimulación, inicie la captura de vídeo.
- Comienza los estímulos visuales que se avecinan cuando el ratón está lejos del refugio y se mueve libremente en la arena abierta. Espere 10 segundos después de la última presentación de estímulo para terminar la grabación.
- Comienza la presentación del estímulo cuando el ratón está en la esquina más alejada del refugio. Sin embargo, cuando los ratones no parecen dispuestos a explorar la esquina lejana, presentan el estímulo cuando el ratón está en un rincón diferente de la arena. Esto no parece hacer una diferencia en la respuesta de comportamiento animal.
- Transfiera el ratón de vuelta a su jaula original. Limpie el gabinete para el siguiente ratón rociando las paredes y el refugio con etanol al 70% y limpiándola. Reemplace el revestimiento del piso de papel si está sucio y reposicione el refugio a la misma ubicación inicial si se mueve durante la transferencia de animales y la limpieza del gabinete.
4. Análisis de vídeo
- Guarde el clip de vídeo para cada ratón en formato. avi sin compresión de archivos con el fin de garantizar la pérdida de datos durante la transferencia al software de análisis.
Nota: la falta de compresión dará lugar a un tamaño de archivo mayor; por lo tanto, utilice el disco duro externo para el almacenamiento. - Utilice el software de análisis para rastrear el movimiento del animal alrededor de la arena antes, durante y después de la presentación del estímulo. Utilice el software disponible comercialmente (ver tabla de materiales) con una capacidad de seguimiento manual para rastrear la posición de la cabeza del ratón en cada fotograma de vídeo, que generó la coordinación X e y cada 1/60 ms. otro software de seguimiento de movimiento incluye Fiji (NIH )40 y EthoVision (noldus).
- Calcule la velocidad y la distancia del ratón desde el refugio. Si la imagen de la arena se distorsiona debido al ángulo de vídeo, corrija la coordinación X e y antes del cálculo (figura 2).
- Compare los parámetros antes y después del inicio del estímulo inminente para determinar cómo el ratón respondió a los estímulos, ya sea por congelación, huida o demostrando ningún cambio en el comportamiento29. Defina la congelación como episodios en los que la velocidad era inferior a 20 mm/s durante 0,5 s o más. Definir el vuelo como episodios donde la velocidad aumentó a 400 mm/s o superior y terminó con el ratón en el refugio. Las definiciones de congelación y huida se basaron en las establecidas por Franceschi et al.29
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Representative Results
Un ratón con ojos sanos se colocó en el recinto y se le permitió aclimatarse durante 10 min. La arena con el monitor en el techo se mantuvo bajo condiciones de luz mesópica (7 x 105 fotones/μm2/s). Durante el período de aclimatación, el ratón exploró el espacio y encontró la cúpula opaca como un refugio. Cuando el ratón se alejó del refugio, comenzó la captura de vídeo, seguida de la iniciación del estímulo visual. En respuesta al estímulo inminente, la mayoría de los ratones se topó con la cúpula (respuesta de vuelo), que se observó en 30 de los 31 ratones (97%). Algunos de los ratones exhibieron respuestas de congelación antes de que huyeron (19/31 ratones, 61%). El estímulo inminente redujo el registro de la condición de luz 1 (6 x 105 fotones/μm2/s).
Los clips de vídeo capturados se analizaron utilizando un software de analítica comercial con una función de rastreo manual (Image Pro Plus) o FIJI (NIH). Usando la función de rastreo, la posición del ratón fue identificada en cada fotograma del video (60 frames/s) antes, durante y después de los estímulos que se avecinan. Analizamos los cambios de velocidad a lo largo del tiempo, así como la distancia al refugio (figura 3). Cuando se produjo el vuelo, la velocidad aumentó abruptamente y la distancia al refugio se redujo en consecuencia. Por el contrario, la velocidad estaba cerca de 0 mm/s cuando los ratones se congelaron. La latencia desde el inicio de los estímulos que se avecinan al vuelo varió de 0,1 a 6,0 segundos (promedio de 2,2 s, 30 ratones). El rango de velocidad máxima para la respuesta de vuelo fue de 500-3000 mm/s (30 ratones).
Figura 1 : Sistema experimental. (A) esquemático de la envolvente de estímulos inminente. Un monitor de computadora (21 ") cubre el techo. Hay una cúpula opaca en una esquina del recinto en la que puede refugiarse un ratón. Un monitor de vídeo con un objetivo de gran angular captura el comportamiento del ratón. (B) visión general de toda nuestra configuración. El monitor secundario duplica la imagen que se muestra en la pantalla de estímulo. (C) diagrama del estímulo inminente. El estímulo que se avecina comienza a los 2 ° (1,15 cm) y se mantiene en este tamaño durante 250 ms. a continuación, se expande a 50 ° (30.8 cm) en el transcurso de 250 ms y sigue siendo 50 ° para un adicional de 500 ms. esta secuencia 1s entonces repite 9 veces más antes de terminar. (D) diagrama de los cálculos de estímulo. La altura de la jaula dicta el tamaño necesario de inicio y fin (en centímetros) del estímulo con el fin de producir un estímulo que se expande de 2 ° a 50 ° cuando está directamente encima del ratón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Cálculos de análisis. Cálculos para corregir la inclinación de la lente gran angular. Debido a la colocación de la cámara, el suelo de la arena aparece como un trapecio en lugar de un rectángulo (izquierda). Por lo tanto, las coordenadas X e y del ratón deben corregirse para analizar con precisión la posición del ratón (MID). Usando la geometría de triángulos congruentes, es posible encontrar cuánto debe cambiar la coordenada x para representar correctamente el movimiento del ratón en el espacio de 3 dimensiones (derecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Respuestas representativas a los estímulos que se avecinan. (A) un ejemplo del movimiento de un ratón rastreado dentro de la arena. Un círculo rojo muestra la cúpula donde el ratón huyó y permaneció hasta que el inminente desaparecido. 1 = punto de partida del ratón cuando se inicia la captura de vídeo. 2 = movimiento previo al inicio del estímulo cuando el ratón exploró la arena. 3 = se inició el estímulo inminente. El ratón se desvaneció en la cúpula (mostrada por una línea roja discontinua). 4 = el ratón permaneció en la cúpula hasta y después de la terminación del estímulo. (B) la velocidad cambia en función del tiempo de este ratón. La línea punteada indica Cuándo comenzó la estimulación en ciernes. La duración del estímulo se indica con el fondo amarillo. El ciclo completo de 10 segundos no se muestra aquí, ya que los ratones permanecieron estacionarios en el refugio durante toda la duración del estímulo. (C) distancia desde la cúpula a lo largo del tiempo para el mismo ratón en (a) y (B). (D) y (E) la velocidad y la distancia a la cúpula para un ratón que exhibió la reacción de congelación (duración del congelamiento mostrada por la flecha roja de doble cara) antes del vuelo. La velocidad se redujo en comparación con el control (antes de la inminente). La distancia a la cúpula no cambió durante este período. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Con el sistema de estímulos visuales en ciernes, una mayoría (97%) de ratones oculares sanos mostró respuesta de vuelo. Uno de los 29 ratones no muestra una respuesta de vuelo obvia. Sin embargo, el ratón caminó hacia la cúpula y permaneció cerca hasta que se avecina desapareció, indicando que el ratón era al menos cauteloso cuando se produjeron los estímulos que se avecinan. Por lo tanto, los estímulos que se avecinan consistentemente provocan respuestas de miedo innatas en ratones de ojos sanos. Por otro lado, tres ratones ciegos no muestran ninguna respuesta a los que se avecinan (resultados preliminares). Tomados en conjunto, demostramos que los experimentos que se avecinan son una prueba de visión útil y consistente para los ratones.
Ponemos la velocidad de los estímulos que se avecinan a 192 grados/s. Franceschi y otros29 examinaron las respuestas que se avecinan a diferentes velocidades, de 5 a 84 grados/s y las respuestas de congelación observadas preferentemente a niveles de velocidad más bajos. Yilmaz y Meister28 observaron respuestas de vuelo en 35 a 350 grados/s; sin embargo, la latencia de vuelo era más larga a velocidades más altas. Por lo tanto, para evocar respuestas de vuelo consistentes, la inminente debe ser a una velocidad de 50 grados/s o más. Los estímulos que se avecinan se pueden generar fácilmente incluso con software de presentación estándar. Sin embargo, este tipo de software no puede crear mayores velocidades de estímulos que se avecinan. En cambio, usamos MatLab y PsychToolbox3 para crear estímulos visuales a 192 grados/s.
Hemos aclimatado a los ratones por 10-15 minutos antes de los estímulos que se avecinan, que es el tiempo de aclimatación anteriores investigadores describieron 28,29,39. Además, probamos si la aclimatación el día anterior cambió el comportamiento inminente. Coloqué los ratones en el recinto durante 10 minutos sin que se avecinan estímulos el día anterior a los estímulos que se avecinan. Esta aclimatación redujo significativamente la latencia de vuelo (p < 0,01, n = 7 ratones, datos no mostrados). Aunque 10 minutos de aclimatación en el día de la inminente causa de las respuestas de vuelo, 1 día de aclimatación anterior disminuyó la latencia de las respuestas de vuelo.
Hay algunas limitaciones para el uso de estímulos que se avecinan como una prueba de visión. En primer lugar, es difícil probar un ojo a la vez. A menos que se suturen un ojo, ambos ojos se prueban juntos. En segundo lugar, no se han establecido plenamente los mecanismos de la respuesta que se cierne sobre el comportamiento. En la retina, Yilmaz y Meister 28 sugirieron que los OFF-dsgcs ventrales (células ganglioneras selectivas de dirección), pero no on-dsgcs, transmiten las señales que se avecinan para causar respuestas. Esta conclusión surgió de sus resultados que los ratones respondieron a los estímulos que se avecinan oscuros, pero no a la amenaza blanca. En el cerebro, Wei et al.36 y Shang et al.37 demostraron que las vías del coliculus superior a través de la amígdala y el gris periacueducto son responsables de los que se avecinan. Sin embargo, se deben llevar a cabo más estudios para confirmar estas investigaciones.
Aunque existen algunas limitaciones con respecto al experimento inminente, el estímulo visual que se avecina genera una respuesta de miedo consistente y robusta en ratones y debe ser una prueba útil de la visión del ratón que requiera un entrenamiento mínimo del experimentante.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las becas NIH r01 EY028915 (TI) y RPB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10.1" monitor (2° display) | Elecrow | Elecrow 10.1 Inch Raspberry Pi 1920x1080p Resolution Display | |
| 14" Business Class Laptop 5490 | Dell | 84 / rcrc961481-4860836 | |
| 20" x 50" Absorbant Liners | Fisher Scientific | AL2050 | works well to protect floor of arena, could use any type of liner |
| 21.5" monitor (1° display) | Acer | Acer R221Q bid 21.5-inch IPS Full HD Display | |
| CCD Camera | Lumenera Corporation | Infiniyy3S-1UR | excellent for behavioral studies due to high fps rate (60 fps) |
| Enclosure (alminum frames and PVC panels) | 80/20 Inc. | 4x cat.#9010, 4x cat.#9005, 1x cat.#9000, 5x cat.#65-2616 | excellent, used quick build tab to find PVC, joints, and frame |
| Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Excel Spreadsheet Software | Microsoft Office | user friendly and widespread knowledge of Microsoft Office software | |
| Freearm | Amazon | used to mount camera to the table, could use any mountable extendable arm | |
| ImagePro Premiere 3D | Media Cybernetics | version 9.3 | good program, could use some updating with the automated tracking feature |
| Matlab software (Psychotoolbox 3) | MathWorks | Matlab R2018b 64-bit (9.5.0.944444) | excellent software to generate pattern stimuli of any conditions |
| SteamPix sorftware | Norpix | StreamPix 7 64-bit Single Camera | works well, a few problems with frame dropping but good customer service |
| WD My Book External Hard Drive | Western Digital | WDBBGB0080HBK hard drive 8 TB USB 3.0 | necessary if using .avi files with no compression codec due to large size of files |
| Wide angle lens | Navitar | NMV-5M23 | excellent and necessary to capture entire arena |
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