Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو وصف تعديل غرفة تدفق لوحة موازية لاستخدامها في التحقيق في الوقت الحقيقي تفعيل قنوات أيون mechanosensitive عن طريق الإجهاد القص.
Abstract
ومن المعروف جيدا الإجهاد القص السائل للعب دور رئيسي في وظيفة بطانة الرحم. في معظم أسرّة الأوعية الدموية، يؤدي ارتفاع ضغط القص الناتج عن الزيادات الحادة في تدفق الدم إلى سلسلة إشارة تؤدي إلى توسع الأوعية مما يخفف من الضغط الميكانيكي على جدار الأوعية الدموية. ومن المعروف جيدا أن نمط الإجهاد القص أن يكون عاملا حاسما في تطوير تصلب الشرايين مع الإجهاد القص laminar يجري atheroprotective واضطراب الإجهاد القص كونها المؤيدة للأثيروجينيك. في حين أن لدينا فهم مفصل لمختلف مسارات إشارة الخلية المتوسطة، لا يتم فهم المستقبلات التي تترجم أولا التحفيز الميكانيكي إلى وسطاء الكيميائية تماما. القنوات الأيونية المشانية حاسمة في الاستجابة للقص وتنظيم إشارات الخلايا التي يسببها القص وبالتالي السيطرة على إنتاج الوسطاء vasoactive. هذه القنوات هي من بين أقدم مكونات الإشارات المنشطة للقص، وقد تم ربطها بتوسع الأوعية الناجم عن القص من خلال تعزيز إنتاج أكسيد النيتريك (على سبيل المثال، تصحيح داخلي K+ [Kir] ومستقبلات عابرة المحتملة [TRP] القنوات) وعامل فرط الاستقطاب البطانة (على سبيل المثال، كير والكالسيوم تنشيط K+ [KCa] القنوات) والقص الناجم ة مضيق للأوعية من خلال آلية غير محددة التي تنطوي على قنوات بيزو. فهم الآلية البيوفيزيائية التي يتم من خلالها تنشيط هذه القنوات من قبل قوى القص (أي مباشرة أو من خلال مستقبلات الميكانو الأولية) يمكن أن توفر أهدافا جديدة محتملة لحل الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة باختلال البطانة والتكوين الهيروي. لا يزال تحديا كبيرا لتسجيل تدفق الناجمة عن تفعيل قنوات أيون في الوقت الحقيقي باستخدام الفيزيولوجيا الكهربائية. الطرق القياسية لتعريض الخلايا لإجهاد القص محددة جيدا، مثل مخروط ولوحة مقياس الرطوبة وأغلقت غرفة تدفق لوحة موازية لا تسمح دراسة في الوقت الحقيقي من تنشيط قناة أيون. والهدف من هذا البروتوكول هو وصف تعديل غرفة تدفق لوحة موازية التي تسمح في الوقت الحقيقي تسجيل الكهربائية الفسيولوجية من قنوات أيون mechanosensitive تحت الإجهاد القص محددة جيدا.
Introduction
ومن المعروف جيدا أن القوى الهيمودينامية الناتجة عن تدفق الدم تلعب أدوارا رئيسية في وظيفة البطانة والأوعية الدموية1،2. ومن المعروف جيدا أيضا أن عدة أنواع من القنوات أيون تستجيب بشكل حاد للتغيرات في الإجهاد القص3،4،5 مما يؤدي إلى فرضية أن قنوات أيون يمكن أن تكون أجهزة استشعار الإجهاد القص الأولية. في الآونة الأخيرة، أظهرنا نحن وآخرون أن قنوات الأيون المشانية الحساسة تلعب أدوارًا حاسمة في العديد من وظائف الأوعية الدموية الحساسة للقص الإجهاد، بما في ذلك الاستجابة الوعية الدموية لإجهاد القص6و7و8 ، وتكوين الأوعية التنموية9. ومع ذلك، فإن آليات حساسية الضغط على القص لقنوات الأيون غير معروفة تماماً تقريباً. ومن المرجح أن تكون هذه الفجوة في المعرفة بسبب الصعوبة التقنية في أداء التسجيلات الفسيولوجية الكهربائية تحت ضغط القص المحدد جيداً. في هذه المقالة، لذلك، ونحن نقدم خطوة خطوة بروتوكول مفصل ةيتم تنفيذها بشكل روتيني في مختبرنا لتحقيق هذا الهدف 6،7،10،11.
الهدف العام لهذه الطريقة هو السماح بالتحقيق في الوقت الحقيقي من قناة أيون mechanoactivation تحت الإجهاد القص محددة جيدا في النطاق الفسيولوجي. ويتحقق ذلك عن طريق تعديل غرفة تدفق لوحة موازية القياسية للسماح للماصة الكهربائية الفسيولوجية ليتم خفضها في الغرفة والوصول إلى الخلايا المزروعة على لوحة أسفل خلال التعرض في الوقت الحقيقي للتدفق، وتوفير نهج فريد لتحقيق هذا الهدف6و7و11. وعلى النقيض من ذلك، يمكن استخدام غرف تدفق اللوحة المتوازية القياسية، الموصوفة في المنشورات السابقة لتحليل التصوير في الوقت الحقيقي للخلايا المعرضة لقوى القص12 أو غيرها من النهج غير الغازية13،14 ولكن ليس ل الفيزيولوجيا الكهربائية. وبالمثل، مخروط ولوحة الجهاز، نهج قوي آخر لفضح الخلايا لالإجهاد القص15،16 ليست أيضا مناسبة للتسجيلات الكهرولوجية. وبالتالي، فإن هذه الأجهزة تدفق لا تسمح بالتحقيق في حساسية الإجهاد القص من قنوات أيون. وصعوبة إجراء التسجيلات الكهرولوجية تحت التدفق هي السبب الرئيسي لندرة المعلومات عن الآليات المسؤولة عن هذه الآثار الحاسمة.
وفيما يتعلق بالنهج البديلة لتحقيق نفس الهدف، لا توجد أي نُهج دقيقة أو خاضعة للرقابة. حاولت بعض الدراسات السابقة تسجيل نشاط قناة أيون تحت التدفق عن طريق تعريض الخلايا لتيار من السائل القادم من ماصة أخرى جلبت إلى محيط خلية من فوق17،18. هذا هو غير الفسيولوجية للغاية، والقوى الميكانيكية التي تم إنشاؤها في ظل هذه الظروف لديها القليل من القواسم المشتركة مع الملامح الفسيولوجية للإجهاد القص في الأوعية الدموية. وتنطبق شواغل مماثلة على محاولات محاكاة الإجهاد الفسيولوجي للقص عن طريق التسريب من الغرف المفتوحة. كما نوقش بالتفصيل في دراستنا السابقة10، واجهة الهواء السائل مفتوحة يخلق اضطرابات متعددة وإعادة تدوير ، والتي هي غير الفسيولوجية. لمعالجة كل هذه المخاوف، قمنا بتصميم لوحة موازية معدلة (MPP) غرفة تدفق، ويشار إليهاأيضا باسم "جهاز تدفق طفيفالتوغل" في دراساتنا السابقة 6،7،10،11،أدلى من الاكريليك وتستخدم على نطاق واسع في مختبرنا. ومع ذلك، على الرغم من حقيقة أن الوصف الأصلي للتصميم قد نشرت منذ ما يقرب من 20 عاما، وهو جهاز التدفق الوحيد الذي يسمح بإجراء تسجيلات الكهرولوجيسية تحت الإجهاد القص محددة جيدا، لم تكن هذه المنهجية التي اعتمدتها مختبرات أخرى، وهناك فقط عدد قليل جدا من الدراسات التي تحاول تسجيل التيارات تحت التدفق. ولذلك، نعتقد أن تقديم وصف مفصل لاستخدام غرفة تدفق MPP سيكون عونا كبيرا للبحوث الذين يهتمون قنوات أيون mechanosensitive وبيولوجيا الأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على استخدام الحيوانات في دراساتنا من قبل جامعة إلينوي في شيكاغو لجنة رعاية الحيوان (#16-183).
1. الجمعية من تعديل غرفة تدفق لوحة موازية
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول 1 والشكل 1 للحصول على البطاقات الشخصية لقطعة غرفة التدفق MPP. يرجى الرجوع إلى الشكل 1 للحصول على مخطط بالتفصيل اتجاه قطع الغرفة للتجميع.
- التمسك الزجاج غطاء مستطيلة، قطعة D، إلى الجزء السفلي من قطعة C، أولا جعل محلول الاستومر سيليكون عن طريق خلط تماما 500 ميكرولتر عامل الاستومر سيليكون في 5 مل من قاعدة الاستومر سيليكون.
- تطبيق طبقة رقيقة من محلول الاستومر سيليكون حول حواف الفضاء مستطيلة من قطعة C ووضع بلطف غطاء مستطيل ة قطعة الزجاج D مباشرة على محلول الاستومر مثل أن قطعة D يغطي تماما مساحة مستطيلة مفتوحة من قطعة C. امسح محلول الاستومر الزائد من السيليكون بعناية.
- كرر الخطوة 1.2 للانضمام إلى الزجاج غطاء مستطيلة، قطعة F، إلى الجزء السفلي من قطعة E والسماح للحل الاستومر سيليكون لعلاج أكثر من الليل في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: وبمجرد الشفاء، سيبقى زجاج الغلاف المستطيل ملتصقاً لمدة تصل إلى ستة أشهر قبل الحاجة إلى استبداله. - بدءا من قطعة الغرفة السفلى، قطعة E، وتجميع غرفة تدفق MPP عن طريق وضع بالتتابع كل قطعة على رأس السابق في الترتيب التالي: قطعة E (أسفل)، قطعة C، قطعة B، قطعة A (أعلى).
- محاذاة الثقوب المسمار من كل قطعة في زوايا والمسمار بإحكام القطع معا لمنع تسرب من الحدوث أثناء إدارة تدفق إلى غرفة تدفق MPP.
2. إعداد الخلايا والبذر في غرفة تدفق MPP
ملاحظة: اتبع الخطوات 2.1-2.7 للخلايا البطانية المستزرعة. اتبع الطريقة المفصلة في الخطوات 2.8−2.14 لعزل الخلايا البطانية من الممرات الشريانية الماسيرية للماوس وإعداد الخلايا البطانية المعزولة حديثاً.
- في لوحة 6-جيدا، وضع أربعة إلى خمسة 12 مم تغطية الدوائر الزجاجية / جيدا وخلايا البذور بين 10٪ و 30٪ من الملاءمة بحيث يمكن الوصول إلى خلايا واحدة للتسجيلات الكهرولوجية.
- حضانة الخلايا في ظل ظروف الثقافةالقياسية (5٪ CO 2، 37 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 2 ساعة للسماح للخلايا التمسك ولا يزيد عن 24 ساعة كما الخلايا البطانية في تجربة المؤلفين تصبح مسطحة جدا ويصعب تصحيحها عند البذر في دون الوصان لأكثر من 24 ح.
- إزالة غطاء الزجاج الذي يحتوي على الخلايا الملتصقة من بئر من لوحة 6 آبار، شطف بسرعة في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)،ونقل إلى طبق بيتري 35 ملم تحتوي على 2 مل حل حمام الكهرولوجيولوجية (الجدول 2) قبل نقل إلى تدفق MPP غرفه.
- نقل دائرة الزجاج غطاء إلى الزجاج غطاء مستطيلة، قطعة D، الذي يتم الالتزام به إلى قطعة C من غرفة تدفق MPP على يقين من أن الحل المناسب يبقى على الزجاج غطاء بحيث الخلايا لا تصبح عرضة للهواء. إضافة الحل الحمام المطلوب (~ 250 درجة مئوية) إلى الخلايا بحيث يتم غمر دائرة الزجاج الغطاء والخلايا تماما في الحل.
- وضع دائرة الزجاج الغطاء بحيث تقع في النصف الأقرب إلى الجانب خزان فراغ بحيث الخلايا سوف تكون في خط مع فتحات الشق من قطعة B. تأكد من أن دائرة الغطاء الزجاجي تلتزم قطعة D من خلال التصاق الحل الزجاجي بحيث تطبيق تدفق إلى الغرفة لا يعطل موقف دائرة الزجاج الغطاء.
- تجميع غرفة تدفق MPP عن طريق الشد القطع معا في الترتيب المناسب، كما هو موضح في الخطوتين 1.4 و 1.5 وكما هو مبين في الشكل1. نقل الغرفة إلى مرحلة المجهر وperfuse على الفور الغرفة مع حل حمام مثل هذا الحل يصل إلى خزان فراغ للطموح (~ 10 مل).
- تحديد خلية صحية للتجربة عن طريق تحديد خلية ذات حدود داكنة ونواة واضحة. تجنب الخلايا التي يبدو أنها تتطفل أو الخلايا التي هي على اتصال مع خلايا أخرى.
ملاحظة: في مختبر المؤلفين، يتم استخدام الخلايا البطانية الأبهرية البشرية والخلايا البطانية البطانة الماوس الأولية في الثقافة. ومع ذلك، يمكن استخدام أي نوع آخر من الخلايا الملتصقة التي تهم احتياجات بحثية محددة بنفس الطريقة. - غسل الممرات الشريانية المعزولة فيحل التفكك (الجدول 2). نقل الممر إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل تحتوي على 2 مل من قبل الدفء (37 درجة مئوية) حل التفكك (وصفة لحل التفكك هو مبين في الجدول2) التي تحتوي على البروتياز محايدة (0.5 ملغ / مل) وelastase (0.5 ملغ / مل). الحضانة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع هز لطيف كل 10 دقائق.
- إزالة 1 مل من البروتياز محايدة / elastase حل التفكك وإضافة 1 ملغ / مل كولاجيناز نوع 1. إرجاع محلول الكولاجين إلى الحل الذي يحتوي على الشرايين لتركيز الكولاجين النهائي من النوع 1 من 0.5 ملغ /مل. الحضانة لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- باستخدام ملقط 5 الصف، حرك الممر بسرعة على طبق بيتري قطره 35 مم يحتوي على قطرة 750 درجة مئوية من محلول التفكك الطازج المبرد. مزيد من فصل الأنسجة باستخدام اثنين من الإبر حقنة 20 G لتحرير الخلايا البطانية ميكانيكيا من الشرايين المهضومة الأنزيمية.
- باستخدام 9 "القابل للتصرف باستور زجاج pipet، triturate حل الخلية 10X قبل نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل جديدة باستخدام الأنابيب الزجاجية.
- اغسل طبق بيتري بـ 750 ميكرولتر آخر من محلول التفكك ونقلها إلى نفس الأنبوب. باستخدام الماصة الزجاجية، مزيد من تفريق ميكانيكيا الخلايا عن طريق الأنابيب ما لا يقل عن 10X لخلق تعليق خلية واحدة الحرص على عدم إدخال فقاعات التي قد تضر سلامة الخلايا البطانية.
- أضف 750 درجة مئوية من تعليق الخلايا البطانية (حوالي 500−1000 خلية) مباشرة إلى القطعة D من غرفة تدفق MPP على النصف الأقرب إلى جانب فراغ الخزان. السماح للخلايا البطانية التمسك بين 45 دقيقة و 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تجميع غرفة تدفق MPP عن طريق الشد القطع معا في الترتيب المناسب كما هو موضح في الخطوتين 1.4 و 1.5 وكما هو مبين في الشكل1. نقل الغرفة إلى مرحلة المجهر وperfuse على الفور الغرفة مع حل حمام مثل هذا الحل يصل إلى طموح فراغ (~ 10 مل). تحديد الخلايا البطانية التي يمكن الوصول إليها من خلال النمط الظاهري الخام والدائري19،20.
ملاحظة: وقد استخدمت مجموعة متنوعة من طرق الهضم والكوكتيلات الإنزيم لعزل الخلايا البطانية من الأسرة الشريانية المختلفة. انظر الجدول 3 للاطلاع على الأوصاف التفصيلية للبروتوكولات التي استخدمتها مجموعة متنوعة من المحققين لعزل الخلايا البطانية للربط بالفيزيولوجيا الكهربائية للقنوات الأيونية الحساسة للمشانية. هذه الطرق من المحتمل أن تكون مناسبة للاستخدام مع غرفة تدفق MPP.
3. السيطرة على الإجهاد القص إلى غرفة تدفق MPP للتسجيلات الفسيولوجية الكهربائية من قنوات الأيون Mechasensitive تنشيط القص
- إقامة نظام ضخ الجاذبية عن طريق ربط اسطوانة حقنة تخرج 30 مل إلى قفل luer 3-way مزودة أنابيب microbore (القطر الداخلي: 0.05 بوصة، القطر الخارجي: 0.09 بوصة) مناسبة للإدراج في ثقب مدخل قطرها 3 مم من قطعة A من MPP غرفه.
- إرفاق الاسطوانة المتخرجة على الوجه الخارجي لقفص فاراداي المحيطةتلاعب الفيزيولوجيا الكهربائية (الشكل 2) باستخدام الشريط على الوجهين. قبل إدخال الأنابيب في غرفة MPP، قم بتعبئة الحقنة والأنابيب مسبقًا مع محلول الحمام (راجع الجدول 2 للاطلاع على حل الحمام المستخدم في التحقيق في تصحيح K+ قنوات في الخلايا البطانية داخليًا). إدراج الأنابيب في فتحة مدخل غرفة تدفق MPP من قطعة A.
- قبل ملء غرفة تدفق MPP مع حل مثل هذا الحل يتم إزالتها في خزان فراغ. وقف التدفق إلى الغرفة وإعادة ملء اسطوانة تخرج إلى العلامة العليا. حساب معدلات التدفق يدويا عن طريق السماح للحل لتدفق من خلال الغرفة واستخدام وقف ووتش لحساب مل / ث في ارتفاع اسطوانة حقنة معينة.
- رفع أو خفض الحقنة لتغيير التدفق، وبالتالي القص في الغرفة، ومواصلة هذه العملية حتى يتم العثور على المستوى المطلوب من الإجهاد القص.
- حساب الإجهاد القص في غرفة موازية باستخدام المعادلة التالية21:
= 6 μQ / ساعة2ث
حيث μ = اللزوجة السائلة (g/cm·s)، Q = معدل التدفق (مل/ثانية)، وعرض غرفة اللوحة المتوازية (w = 2.2 سم) والارتفاع (h = 0.1 سم).
ملاحظة: في نظام التسريب الجاذبية الحالية، في ارتفاع اسطوانة حقنة (كما تقاس من أعلى الاسطوانة) من 57 سم فوق مرحلة المجهر، ومعدل التدفق هو 0.3 مل / ث. القص محسوبة في الغرفة في هذا ارتفاع اسطوانة حقنة ومعدلالتدفق هو 0.7 dyn/cm 2. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن نظم التسريب الأخرى، مثل مضخة تمعجية، يمكن استخدامها للسيطرة على تدفق إلى غرفة تدفق MPP. ومع ذلك، قد تضيف هذه الأجهزة الاضطرابات غير المرغوب فيها وتؤثر على استقرار قياسات الفيزيولوجيا الكهربائية تحت التدفق، وبالتالي، باستخدام نظام التسريب الجاذبية الموضحة هنا. - نقل غرفة مجمعة تحتوي على الخلايا الملتصقة إلى مرحلة المجهر من جهاز الفيزيولوجيا الكهربائية وإدراج الأنابيب المملوءة مسبقا مع حل الحمام في حفرة من قطعة A. في وقت واحد ملء الغرفة وغسل الخلايا مع 10 مل من حل الحمام من قبل تحول قفل luer 3-way مثل هذا الحل يتدفق إلى الغرفة.
- مرة واحدة يتم الحصول على تكوين التصحيح المطلوب بنجاح السماح تيارات القناة لتحقيق الاستقرار في حمام ثابت في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة وقد استقرت التيارات، وتطبيق القص بطريقة خطوة الحكمة مما يسمح الزيادات في التيار لتحقيق الاستقرار قبل زيادة الخطوة التالية في الإجهاد القص.
ملاحظة: يجد المؤلفون النجاح الأكبر في تكوين التصحيح المثقب عند دراسة قنوات الأيون المثقبة في الخلايا البطانية. لإجراء تكوينات تصحيح الخلية الكاملة المثقبة، أضف 5 ميكرولتر من أمفوتيريسين B مخزون 60 ملغم/مل في كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) إلى 1 مل من 0.2 م محلول ماصة معقمة مصفاة. بعد إنشاء ختم جيجا أوم في التكوين المتصل بالخلايا، تتشكل بقع الخلايا الكاملة المثقبة في غضون 2−5 دقائق. - إزالة التعرض القص إلى الخلايا عن طريق وقف التدفق إلى الغرفة مما يسمح تيارات قناة mechanosensitive للعودة إلى التيارات الأساسية لوحظ في الحمام ثابت.
- عزل التيارات قناة أيون mechanosensitive من الاهتمام عن طريق تغيير التكافؤ الحل (على سبيل المثال، 60 مل K+ في حل حمام مع 0 كاليفورنيا2 + في حل ماصة لدراسة تصحيح داخليا K + القنوات. ويبين الجدول 2 وصفات المحلول المثال) و/أو تثبيط الدوائية للمصادر الحالية التي يحتمل أن تلوث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر في الشكل 1صور متعددة تظهر وجهات نظر مختلفة لغرفة تدفق MPP على مرحلة المجهر (اللوحة العليا) وتمثيل تخطيطي لغرفة تدفق MPP (اللوحة السفلية). تفاصيل المخطط أبعاد الجهاز بأكمله وغرفة التدفق. يظهر الشكل 2 صورة لنظام التسريب الجاذبية إلى غرفة تدفق MPP في مختبرنا (اللوحة العليا). كما يظهر تمثيل تخطيطي لنظام التدفق (لوحة أسفل) تهدف إلى تسليط الضوء على الخطوات التي عزل الخلايا في غرفة التدفق من الاندفاع من الحل من نظام التسريب ومن قوة إزالة فراغ الحل.
السمة المميزة للقنوات الأيونية mechanosensitive هو العودةالمفاجئة إلى مستويات خط الأساس عند وقف التحفيز الميكانيكي 3،6،7. ويبين الشكل 3 كمثال على ذلك أن إزالة حافز الإجهاد القص أثناء التسجيلات الكهرولوجية لتيار كير من خلية بطانة معزولة حديثا يؤدي إلى العودة إلى التيارات الأساسية المسجلة في البداية في حمام ثابت. حدثت العودة إلى مستويات خط الأساس الحالية بعد إيقاف التدفق إلى غرفة MPP في غضون عشر ثوان من توقف التدفق.
التسجيلات الكهربائية الفسيولوجية للخلايا الكاملة (WC)، وخاصة تلك المأخوذة من خلايا معزولة حديثاً، غالباً ما يكون لها تيارات خلفية تسرب واضحة يمكن أن تخفي نشاط القناة. بعض القنوات الأيونية، مثل تلك التي من تصحيح داخليا K+ قناة الأسرة، لديها خصائص بيوفيزيائية التي تسمح لطرح خلفية تسرب الحالية لتحليل أكثر دقة. ويبين الشكل 4 كمثال العملية من البيانات الخام (الشكل4ألف)إلى التسرب الخطي إلى الخارج المحسوب والمرسوم (الشكل4باء)إلى الأثر التمثيلي النهائي المطرح (الشكل4C). راجع شرحمفصل لحساب وطرح التسرب من تسجيل تصحيح المرحاض الخام المثقب في وسيلة الإيضاح المصاحبة إلى الشكل 4.
الشكل 1: غرفة تدفق MPP ومخطط مفصل. تظهر صور غرفة تدفق MPP المجمعة (اللوحة العليا) الغرفة على مرحلة المجهر من ثلاثة وجهات نظر مختلفة: الجانب كما ينظر إليه أثناء التجارب (يسار)، من مدخل التسريب (الأوسط)، ومن منفذ فراغ (يمين) الذي هو خارج الرؤية في الصورة. يتم تسمية اتجاه التدفق في كل منها. لاحظ أن السلك الأرضي يمكن أن يصلح بسهولة في واحدة من الشقوق 2 مم عندما عازمة في زاوية 90 درجة. يظهر مخطط مفصل (أسفل) الأبعاد الدقيقة للنسخ المتماثل للجهاز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظام التسريب الجاذبية. تظهر صورة تحمل علامة على نظام التسريب الجاذبية في مختبرنا في اللوحة العليا. غرفة تدفق MPP من خطوتين ونظام التسريب الجاذبية مفصلة في اللوحة السفلية. يتم تسليط الضوء على فصل غرفة التدفق التي تحتوي على الخلايا والخزانين العلوي والسفلي. الخطوة 1 يسمح الحل لتدفق من الخزان العلوي من قطعة B إلى قطعة D من الغرفة حيث يتم زرع الخلايا. الخطوة 2 يسمح الحل لتدفق من قطعة D وصولا الى الخزان السفلي، قطعة F. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الآثار التمثيلية للتنشيط الحالي لقنوات كير الناجم عن القص والعودة إلى مستويات خط الأساس الحالية عند إزالة التدفق. وهناك سيطرة إيجابية جيدة لmechanoactivation من قنوات أيون هو العودة إلى مستويات خط الأساس الحالية لوحظ في البداية في حمام ثابت عند وقف التحفيز الميكانيكي. يتم تنشيط التيارات قناة تصحيح داخليا K+ (Kir) في غضون ثوان عن طريق الإجهاد القص عندما يسمح حل الجاذبية لتدفق إلى غرفة تدفق MPP. عند توقف التدفق إلى الغرفة، تعود تيارات كير بسرعة إلى مستويات ثابتة خط الأساس التي لوحظت قبل التدفق. تم تطبيق منحدر من -140 mV إلى +40 mV على التصحيح أكثر من 400 مللي ثانية. تم إنشاء آثار تمثيلية من خلية بطانة معزولة حديثا من الشرايين الفأرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال على الطرح تسرب لتحليل دقيق من تيار كير mechanoactivated. (أ) تسجيل الخام ممثل من كير الحالية من خلية بطانة mesenteric الماوس الأولية مع ملحوظ خطي تسرب الخارج الحالي (أناتسرب). تم تطبيق منحدر من -140 mV إلى +40 mV على التصحيح أكثر من 400 مللي ثانية. (B) أناتسرب يمنع تحليل نشاط قناة كير الحقيقي. لطرح تسربI ، أولاً حساب التوصيل المنحدر الخطي منتسرب I (Gslope = (Ia-I b)/(V a-Vb)). ضربG المنحدر من الفولتية المقابلة من تتبع الخام بأكمله لمؤامرة أناتسرب على البيانات الخام. يجب أن تراكب الخط تسرب خطي إلى الخارج بالضبط. (C) طرح مخطط أناتسرب من تتبع كامل بحيث التيار الخطي الخارجي هو ~ 0 pA / pF والحالي كير الحقيقي يمكن تحليلها. لاحظ في اللوحة C أن تيار Kir الداخلي هو ما يقرب من نصف أثر البيانات الخام الأصلي في اللوحة A. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الارتفاع (مم) | العرض (مم) | الطول (مم) | معلومات إضافية | ||
| القطعة ألف | 8 | 80 | 98 | يحتوي على فتحة قطرها 3 مم لأنابيب التسريب مدخل (انظر جدولالمواد) و 53 مم × 60 مم مساحة مستطيلة للوصول إلى القطع الوسطى والخلايا | |
| القطعة باء | 1 | 80 | 98 | يحتوي على مساحة (قطري 20 مم) تحت ثقب التسريب من القطعة A وثلاثة فتحات 2 مم × 17 مم للوصول إلى الخلايا | |
| القطعة C | 1 | 80 | 98 | يحتوي على مساحة 22 مم × 50 مم حيث يتم الالتزام بالقطعة D باستخدام محلول الاستومر سيليكون (انظر جدولالمواد) | |
| القطعة D | 0.16 | 24 | 40 | مستطيلة الزجاج الشريحة السفلية من غرفة التدفق | |
| القطعة E | 5 | 80 | 120 | يحتوي على مساحة 45 مم × 50 مم للسماح بتصور الخلايا على القطعة D. مساحة 20 مم × 45 مم موجودة لمنفذ فراغ الخزان، قطعة F، ليتم الالتزام بها | |
| القطعة F | 0.16 | 24 | 50 | مستطيلة الزجاج الشريحة أسفل خزان منفذ فراغ | |
| تجميعMPP | 15 | 80 | 120 | يتم فصل غرفة التدفق من التسريب مدخل وفراغ منفذ من قبل خطوتين لتجنب تعطيل القص laminar محددة جيدا | |
| تدفق غرفة MPP تجميعها | 1 | 22 | 42 | قطعة D هو الجزء السفلي من الشريحة الزجاجية من غرفة تدفق | |
الجدول 1: أبعاد MPP (مجمعة ومفككة) ومعلومات إضافية خاصة بكل جزء من الجهاز.
| حل | وصفة (في MM) | الرقم الهيدروجيني | ||
| التفكك | 55 NaCl, 80 Na-glutamate, 6 KCl, 2 MgCl2,0.1 CaCl2, 10 glucose, 10 HEPES | 7.3 | ||
| (عزل الخلية) | ||||
| حمام (الفيزيولوجيا الكهربائية) | 80 NaCl, 60 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 الجلوكوز, 10 HEPES | 7.4 | ||
| الماصية (الفيزيولوجيا الكهربائية) | 5 حمض الهيدروكلوريك، 135 كيلو دولار، 5EGTA، 1 ملغ كل 2، 5 الجلوكوز، 10 HEPES | 7.2 | ||
الجدول 2: أمثلة على الحلول ذات الوصفات المستخدمة في التجارب.
| بروتوكول عزل الخلايا البطانية | مراجع | |
| كوكتيل من البروتياز المحايد والإيلاستات (0.5 ملغ/مل لكل منهما؛ 1 ساعة عند 37 درجة مئوية) تليها الكولاجينات من النوع الأول (0.5 ملغم/مل؛ 2.5 دقيقة) | 6,7 | |
| كشط ميكانيكي لطيف لمنطقة 5 سم2 تقع في الجدار الداخلي للأورتا الصدر تنازلي | 11 | |
| Na | 17 سنة | |
| Na | 3 | |
| كولاجيناز نوع IA (1 ملغ / مل) لمدة 14 دقيقة عند 37 درجة مئوية | 8 | |
الجدول 3: منهجية دراسة القنوات الأيونية الحساسة للمشانوية باستخدام التقنيات الكهرولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتعرض نظام الأوعية الدموية باستمرار لقوى الهيمودينامية النشطة، والتي تنشط القنوات الأيونية mechanosensitive3،22 ولكن الأدوار الفسيولوجية لهذه القنوات في القص الناجم عن الإجهاد mechanotransduction هو فقط بدأت تظهر4،6،8. الآليات المسؤولة عن حساسية المشانوية للقنوات التي تعمل بالإجهاد القص لا تزال غير معروفة. يصف البروتوكول المفصل هنا طريقة التحقيق المباشر في قنوات الأيون الحساسة المشانية المعرضة لإجهاد القص اللامينار في الوقت الحقيقي.
الخطوة الحاسمة والأساسية من هذا البروتوكول هو استخدام غرفة تدفق لوحة موازية معدلة لديها فتحات ضيقة للسماح للماصة الكهربائية الفسيولوجية ليتم خفضها في الغرفة والوصول إلى الخلايا تحت التدفق. المبدأ العام لهذا الجهاز هو أنه إذا كانت فتحات ضيقة بما فيه الكفاية،والإجهاد القص الفسيولوجية (تصل إلى 15 dyn/cm 2) يمكن أن يتحقق دون تجاوز الحل بسبب قوى التوتر السطحي10. من أجل إجراء هذه التجارب بنجاح، فمن الأهمية بمكان: '1' إلى خلايا البذور في منطقة اللوحة السفلية التي هي مباشرة تحت فتحات; '2' إنشاء ختم جيجا أوم قبل بدء التدفق أو أثناء تدفق الخلفية البطيء جداً (<0.01 dyn/cm2)؛ '3' الحفاظ على ختم مستقر مع زيادة التدفق. يتم توفير أبعاد جهاز الاكريليك أربع قطع المستخدمة في مختبرناجنبا إلى جنب مع مخططات مفصلة (الشكل 1) بحيث غرفة تدفق MPP ونظام التدفق (الشكل2)يمكن تكرارها للاستخدام في أي مختبر التحقيق قنوات الأيون mechanosensitive. ويمكن أيضا تعديل هذه الأبعاد لزيادة المساحة التي بذرها الخلايا وتغيير ارتفاع قناة التدفق، الأمر الذي من شأنه أن يغير العلاقة بين معدل التدفق والإجهاد القص. انخفاض في ارتفاع غرفة التدفق من شأنه أن يؤدي إلى ارتفاع الإجهاد القص لنفس معدل التدفق، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحقيق أعلى ضغط القص. كما يمكن تعديل الغرفة لتشمل حاجز فصل التدفق الذي يحفز منطقة محلية من إعادة تدوير تدفق اضطراب23.
وتشمل المزايا الرئيسية لاستخدام غرفة تدفق MPP (1) التحقيق في الوقت الحقيقي من قنوات الأيون التي يتم تنشيطها القص من الخلايا البطانية في الثقافة والخلايا المعزولة حديثا من أنسجة الأوعية الدموية، (2) التعرض للخلايا واستجابة أيون mechanosensitive القنوات إلى مستويات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من الإجهاد القص، و (3) سهولة التجميع والتفكيك مع خيارات التسريب للتجريب. فيما يتعلق بالأساليب الأخرى القائمة، والطريقة الأخرى الوحيدة التي تسمح بإجراء التسجيلات الكهرولوجية تحت الإجهاد القص محددة جيدا هو بذر الخلايا داخل نهاية الشعرية وإدراج ماصة التسجيل في فتحة الشعرية، كما تم ذلك في الدراسات المبكرة3,22. ومع ذلك، هناك عيوب متعددة بالمقارنة مع الطريقة الموصوفة هنا، مثل صعوبة زرع الخلايا في الشعيرات الدموية، والوصول إلى عدد صغير جدا من الخلايا التي هي قريبة بما فيه الكفاية إلى نهاية الشعرية للماصة لتكون قادرة على الوصول إليها، و اضطرابات التدفق في نهاية قناة التدفق (الشعرية في هذه الحالة). كل من هذه العيوب يجعل من الصعب إجراء الفيزيولوجيا الكهربائية تحت التدفق في الخلايا المستزرعة في فتح الشعرية ويكاد يكون من المستحيل تصحيح أو حتى خلايا البذور معزولة حديثا من الأوعية الدموية. كما أنه من المستحيل إدخال خطوة لتوليد منطقة من تدفق المضطربة. جميع الطرق الموجودة الأخرى التي إما تستخدم غرف مفتوحة24،25 أو النفخ الحلول مباشرة على خلية17،18 لا تحاكي البيئة الهيمودينامية في الأوعية الدموية.
الحد الرئيسي من هذه الطريقة، ومع ذلك، هو قيد لتحقيق الإجهاد القص في مستويات أعلى من النطاق الفسيولوجي. على وجه التحديد، وقد قدرت مستويات الإجهاد القص الفسيولوجية لتصل إلى 70 dyn/cm2 في الشرايين الصحية26. في المقابل، كان أعلى مستوى الإجهاد القص التي يمكن أن نحققها فيالتكوين الحالي للغرفة 15 dyn/cm 2، وبعد ذلك تصبح قوى التوتر السطحي غير كافية لمنع الحل للخروج من الفتحات10. من الممكن أن يؤدي تقليل ارتفاع قناة التدفق إلى تحقيق مستويات أعلى من الإجهاد القص. الحفاظ على ختم جيجا أوم مستقرة تحت ضغط القص عالية هو تحد آخر ولكن معدل النجاح هو معقول مع الممارسة. وجدنا أن استخدام تقنية التصحيح مثقب (بما في ذلك المضادات الحيوية amphotericin B في محلول ماصة كما هو موضح أعلاه) تسفر عن تسجيلات أكثر استقرارا من تكوين الخلية بأكملها القياسية. بالإضافة إلى ذلك، غرفة تدفق MPP والحلول المستخدمة لا تكرر بالضبط القص من تدفق الدم في الشرايين. الدم هو سائل لزج غير نيوتوني لم نقم بتكراره في تجاربنا المختبرية. بالإضافة إلى ذلك، الغرفة المستخدمة هنا هي غرفة موازية في حين يتم حساب الإجهاد القص في الشرايين أفضل باستخدام صيغة للقص في اسطوانة.
وهناك اعتبارات وقيود هامة لتنفيذ تسجيلات أحادية القناة تحت التدفق. هذه الطريقة مناسبة لتكوين خلية تعلق (ماصة تعلق على غشاء خلية سليمة)، والتي تسفر عن الأختام مستقرة. فمن المهم على الرغم من أن تكون على علم بأن القنوات الوحيدة التي يتم تسجيل نشاطها لا تتعرض مباشرة لإجهاد القص لأنها محمية من قبل ماصة التسجيل، وخاصة في التكوين من الداخل إلى الخارج27. ونحن نعتقد أن تكوينات التصحيح المقتطعة ليست الأكثر موثوقية عند استخدامها لاختبار حساسية قنوات أيون للتدفق لأن الغشاء المقتطع عادة ما يتم سحبها في ماصة التسجيل وبالتالي لا تتعرض لتدفق محدد جيدا.
من حيث نوع الخلايا التي يمكن استخدامها في هذه التجارب، تمثل الخلايا البطانية الوعائية نوع الخلية الأكثر قابلية للتطبيق لدراسة الإجهاد القص والقنوات mechanosensitive. ركزت الدراسات السابقة في المقام الأول على الخلايا البطانية المستزرعة3،28 التي تتوفر بسهولة. لقد اختبرنا ومددنا استخدام هذه الطريقة للخلايا البطانية المعزولةحديثا من الشرايين مقاومة الماوس 6،7. وينبغي بالتأكيد النظر في أنواع الخلايا الأخرى. خلايا العضلات الملساء الوعائية، على سبيل المثال، يمكن أن تصبح عرضة لإجهاد القص خلال حالات المرض حيث تم تلف البطانة وإزالتها29،30. وهذا يمثل مجالا مثيرا للاهتمام من الدراسة حيث القنوات mechanosensitive التي توجد في العضلات الملساء، والتي لولا ذلك لن تتأثر الإجهاد القص، وسوف تسهم الآن في آليات الأمراض التي يحتمل أن تكون باثوالفسيولوجية. وعلاوة على ذلك، فإن نقل خطوط خلايا المركبات مثل HEK أو CHO مع ترميز الجينات قناة الاهتمام هو منصة ممتازة للتحليلات البيوفيزيائية للقنوات في تركيبة مع استخدام غرفة تدفق MPP.
ومن المهم أيضا أن نلاحظ أنه في حين أن النية الأصلية لغرفة تدفق MPP كان للتحقيق في الوقت الحقيقي من قناة أيون mechanoactivation، وتطبيق الجهاز قد تمتد إلى أبعد من هذا الهدف. وعلى وجه التحديد، يمكن استخدام نفس النهج للدراسات التي تستخدم أجهزة استشعار الأقطاب الكهربائية، مثل جهاز استشعار أكسيد النيتريك (NO) لتحديد إطلاق NO استجابة لإجهاد القص. لذلك، نحن نقدم منهجية معممة لأولئك الذين لديهم مصلحة في التحقيق في العمليات البيولوجية المنظمة ميكانيكيا في الوقت الحقيقي، وتشجيع المزيد من التعديل من غرفة MPP لتلبية الاحتياجات البحثية المحددة لأولئك الذين يدرسون العمليات الحساسة في مجموعة متنوعة من المجالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R01 HL073965، IL) و (T32 HL007829-24، ISF). كما يود المؤلفون أن ينوه بمتجر الآلات العلمية في جامعة إلينوي في شيكاغو لتوليد أحدث غرف تدفق MPP لدينا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
| 5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
| 9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
| 12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
| 24 mm x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
| 24 mm x 50 mm Rectangular Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
| 20 G syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| 35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
| Elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
| Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
| Neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
| Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |
References
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
- Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
- Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
- Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
- Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).
- Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
- Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
- Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).
- White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).
- Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
- Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
- Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
- Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
- Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).
- Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
- Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
- Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585 (2016).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
- Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
- Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
- Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).
